梁夢夢，邵欣欣，陳聰，張松，張廣忠，李佳*

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2. 濟(jì)南玖玫玫瑰有限公司，山東 濟(jì)南 250400)

抑郁癥是一種以顯著而持久的心情低落為主要臨床癥狀的常見病，患者通常表現(xiàn)為興趣明顯減少、存在睡眠障礙，嚴(yán)重者會出現(xiàn)自殘、自殺傾向[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，世界上患有抑郁癥的總?cè)藬?shù)達(dá)3.22億，其中近一半的人生活在東南亞和西太平洋區(qū)域，反映出這兩個區(qū)域人數(shù)相對較多[2]。

目前傳統(tǒng)抗抑郁藥雖有一定療效，但普遍存在復(fù)發(fā)率高、治愈率低、副作用大等問題[3]，開發(fā)治療抑郁癥的新藥顯得尤為重要。中醫(yī)藥治療抑郁癥以藥理成分多、多靶點治療、毒副作用小為特點，具有“增效減副”的優(yōu)勢[4]。

玫瑰花為薔薇科植物玫瑰RosarugosaThunb.的干燥花蕾，性溫，味甘、微苦，入肝脾二經(jīng)，具有行氣解郁、和血、止痛之功，可用于治療肝胃氣痛、食少嘔惡、月經(jīng)不調(diào)、跌撲傷痛等癥[5]，主產(chǎn)于山東平陰。現(xiàn)代藥理研究亦表明，玫瑰花所含有的黃酮類、維生素、氨基酸、揮發(fā)油等成分，具有抗抑郁、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、調(diào)節(jié)血脂、降血糖等藥理活性[6-7]。但是，玫瑰花抗抑郁的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚不夠明確。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對玫瑰花抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為抗抑郁新藥研發(fā)提供理論依據(jù)及新的研究思路。

1 資料來源與篩選標(biāo)準(zhǔn)

1.1 抗抑郁單體收集與篩選

本研究選擇信息比較全面的中國知網(wǎng)(China national knowledge infrastructure，CNKI)數(shù)據(jù)庫為數(shù)據(jù)來源，以“TKA =‘抗抑郁’and TKA =‘單體’”為檢索式。其中，文獻(xiàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)實驗性論文和專利；(2)實驗步驟的各項信息較完整；(3)有明確的抗抑郁作用的單體。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)實驗對象為單味藥、復(fù)方或中西藥聯(lián)用類論文；(2)綜述類文獻(xiàn)；(3)實驗數(shù)據(jù)或指標(biāo)有誤的論文。收集并篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的抗抑郁單體。

2 研究方法

2.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)相似性比對

將抗抑郁單體與玫瑰花化合物結(jié)構(gòu)導(dǎo)入化學(xué)結(jié)構(gòu)比對軟件Data Warrior中，進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)片段的相似性比對，選擇大于95% 為相似度閾值[8]，得到其相似性比對的結(jié)果，以探索已具備研究基礎(chǔ)的化合物與玫瑰花化合物的相似程度，分析玫瑰花所含化合物臨床抗抑郁應(yīng)用潛力。

2.2 玫瑰花的抗抑郁成分-靶點關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)抗抑郁單體和玫瑰花化合物結(jié)構(gòu)相似性比對，獲得玫瑰花化合物中與抗抑郁單體具有高度結(jié)構(gòu)相似性成分，對其相關(guān)靶點以Probability≥0.068為篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終篩選出玫瑰花的抗抑郁成分，并預(yù)測其相關(guān)靶點，構(gòu)建玫瑰花的抗抑郁成分-靶點數(shù)據(jù)庫。將經(jīng)篩選后的玫瑰花的抗抑郁成分及對應(yīng)靶點導(dǎo)入 VOS viewer 1.6.13進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，繪制玫瑰花的抗抑郁成分與靶點關(guān)聯(lián)規(guī)則圖譜，分析玫瑰花的抗抑郁成分與靶點的內(nèi)在聯(lián)系。借助頻數(shù)分析，統(tǒng)計高頻成分及靶點，繪制頻數(shù)分布圖。

2.3 構(gòu)建玫瑰花成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.3.1 玫瑰花的作用靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將玫瑰花的抗抑郁成分作用靶點導(dǎo)入STRING(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫，并限定研究物種來源于人種(homo sapiens)，借助此蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析平臺構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)。

2.3.2 玫瑰花的抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將玫瑰花的抗抑郁成分作用靶點導(dǎo)入DAVID (https://david.ncifcrf.gov)數(shù)據(jù)庫，借助DAVID子庫GAD進(jìn)行疾病富集分析，構(gòu)建靶點-疾病數(shù)據(jù)庫。將玫瑰花的抗抑郁成分-靶點數(shù)據(jù)庫、靶點-疾病數(shù)據(jù)庫及上述PPI數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)可視化軟件 Cytoscape3.7.2，并進(jìn)行融合，構(gòu)建玫瑰花的抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)。其中成分、靶點、疾病被表示為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點，其之間的相互聯(lián)系以邊表示。

2.4 核心靶點篩選及核心成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞“depression,”查找與抑郁癥相關(guān)的靶點，并構(gòu)建抑郁癥-靶點數(shù)據(jù)庫。同玫瑰花抗抑郁成分-靶點數(shù)據(jù)庫合并，去除重復(fù)和假陽性的靶點，最后與活性成分相關(guān)的靶點相映射，獲得玫瑰花與抑郁癥相關(guān)的核心成分和相關(guān)靶點，構(gòu)建玫瑰花抗抑郁核心成分-靶點數(shù)據(jù)庫。

將核心靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，限定研究物種來源于人種(homo sapiens)，構(gòu)建核心靶點 PPI 相互作用網(wǎng)絡(luò)，將該相互作用關(guān)系同抑郁癥-靶點數(shù)據(jù)庫、玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶點數(shù)據(jù)庫分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，合并，以構(gòu)建核心成分-核心靶點-疾病相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)，其中玫瑰花的核心成分、核心靶點、疾病被表示為網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點，其之間的相互聯(lián)系以邊表示。

2.5 通路富集分析

將玫瑰花的核心靶點導(dǎo)入 DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 通路富集分析，閾值為P<0.01，限定研究物種來源于人種(homo sapiens)。

2.6 分子對接

對玫瑰花核心成分及核心靶點以節(jié)點度值(degree)進(jìn)行排布，篩選節(jié)點度值前三的靶點及成分為玫瑰花的抗抑郁關(guān)鍵靶點及關(guān)鍵成分，于蛋白質(zhì)晶體庫PDB(https://www1.rcsb.org/)篩選出關(guān)鍵靶點相對應(yīng)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，運用分子對接軟件Discovery Studio 2017 R2中的Receptor-Ligand International模塊，對玫瑰花關(guān)鍵靶點及關(guān)鍵成分分別進(jìn)行CDOCKER分子對接。蛋白的活性位點以晶體結(jié)構(gòu)中自身標(biāo)注的原配體作用的活性氨基酸位點為中心，進(jìn)行“活性口袋”構(gòu)建，使小分子通過CDOCKER算法模塊與“活性口袋”中的氨基酸進(jìn)行對接，參數(shù)設(shè)置：Pose Cluster Radius設(shè)置為0.5，Random Conformations 設(shè)置為10，Orientations to Refine設(shè)置為10，其余維持默認(rèn)參數(shù)不變。

3 研究結(jié)果

3.1 玫瑰花的抗抑郁化學(xué)成分

經(jīng)玫瑰花化學(xué)成分與抗抑郁單體結(jié)構(gòu)片段相似性比對(圖1)篩選，結(jié)果顯示，玫瑰花成分中與抗抑郁單體具有高結(jié)構(gòu)相似性(>95%)成分27個(詳見OSID附表1)，且主要為黃酮類、萜類、苯丙素類、甾體類、多酚類(表1)。

圖1 抗抑郁單體與玫瑰花成分相似結(jié)構(gòu)性比對Fig.1 The similar structural comparison of antidepressant monomers and Rosae Rugosae Flos ingredients

表1 玫瑰花的抗抑郁相關(guān)化合物分類Table 1 Classification of antidepressant related compounds in Rosae Rugosae Flos

3.2 玫瑰花的抗抑郁成分與靶點的關(guān)聯(lián)關(guān)系

以玫瑰花的抗抑郁成分27個，對應(yīng)作用靶點255個，構(gòu)建玫瑰花的抗抑郁成分-靶點數(shù)據(jù)庫，并導(dǎo)入VOS viewer 1.6.13，發(fā)現(xiàn)由于化學(xué)成分結(jié)構(gòu)的多樣性，從而導(dǎo)致其作用靶點的差異性(圖2)。如圖顯示，甾體類化合物與靶點P60568更為相關(guān)，萜類以及多酚類化合物與靶點Q14534、P04745更為相關(guān)，而黃酮類化合物以其天然的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢涉及多種藥理活性，提示此類化合物具備多樣的生物活性。

根據(jù)玫瑰花的抗抑郁活性成分及抑郁靶點關(guān)聯(lián)分析(圖2)，將顯著關(guān)聯(lián)結(jié)果進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計，得到玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶點頻數(shù)分析圖(圖3)，結(jié)果顯示，C1成分(黃酮類化合物)和C5成分(酚酸類化合物)對于抑郁相關(guān)靶點均具備較高的特異性，其中黃酮類化合物覆蓋更多的靶點。

圖2 玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶點關(guān)聯(lián)分析Fig.2 The correlation analysis of Rosae Rugosae Flos antidepression ingredients and targets

圖3 玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶點頻數(shù)分析Fig.3 The frequency chart of Rosae Rugosae Flos antidepression ingredients and targets

3.3 玫瑰花的抗抑郁成分主要作用通路

以Cytoscape3.7.2構(gòu)建玫瑰花抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4 (a))，結(jié)果顯示，來源于玫瑰花的27個成分與255個靶點發(fā)生相互作用，并與986種疾病產(chǎn)生關(guān)聯(lián)，其中包含抑郁癥。通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路富集分析(圖4 (b))，發(fā)現(xiàn)玫瑰花的抗抑郁成分主要通過氮素代謝，類固醇激素生物合成，神經(jīng)活性配體-受體的相互作用，花生四烯酸代謝等通路發(fā)揮治療疾病的作用。

注:(a)中紅色為27個玫瑰花抗抑郁成分，玫紅色為255個與玫瑰花發(fā)生相互作用的靶點，藍(lán)色為與255個靶點相關(guān)聯(lián)的986種疾病(其中包括抑郁癥)。圖4 玫瑰花的抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)及其抑郁相關(guān)靶點KEGG通路分析Fig.4The antidepression ingredients-targets-disease interaction network and the depression-related targets-path analysis of Rosae Rugosae Flos

3.4 玫瑰花抗抑郁核心靶點及核心成分

從玫瑰花的抗抑郁成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4(a))中篩選出與抑郁相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò)(玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò))，將核心靶點 PPI關(guān)系同抑郁癥-靶點數(shù)據(jù)庫、玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶點數(shù)據(jù)庫分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，合并，構(gòu)建玫瑰花的抗抑郁核心成分-核心靶點-疾病相關(guān)作用網(wǎng)絡(luò)(圖5 )。圖5 網(wǎng)絡(luò)中有節(jié)點48個(核心成分17個，核心靶點31個)，包含194條邊。借助KEGG對玫瑰花抗抑郁核心靶點進(jìn)行通路富集分析，得到圖6，發(fā)現(xiàn)玫瑰花治療抑郁癥的活性成分主要通過HIF-1 信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、催乳素信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸等通路發(fā)揮作用。

注:黃色表示玫瑰花，紅色表示玫瑰花抗抑郁核心成分(TCMSP 編號活性成分和來自文獻(xiàn)自擬編號成分)，藍(lán)色表示玫瑰花治療抑郁癥潛在靶點。圖5 玫瑰花的抗抑郁核心成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.5 The antidepression core ingredients-targets-disease interaction network

圖6 玫瑰花抗抑郁核心靶點KEGG通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis for the depression-related core targets of Rosae Rugosae Flos

將抗抑郁核心成分與其作用核心靶點進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計分析，得到抗抑郁核心成分-靶點頻數(shù)分析圖(圖7)，結(jié)果顯示，黃酮類化合物及其相對應(yīng)的靶點具備更高的特異性。

圖7 抗抑郁核心成分-靶點頻數(shù)分析Fig.7 The frequency chart of antidepression core ingredients-targets

3.5 玫瑰花抗抑郁關(guān)鍵靶點及關(guān)鍵成分

以節(jié)點度值進(jìn)行排布，結(jié)果顯示節(jié)點度值前三的靶點在抑郁癥相關(guān)子網(wǎng)絡(luò)中具備突出作用，活性成分degree≥18的具備更好的生物活性。因此，靶點P31749、P35354、P03372、P01375為玫瑰花的抗抑郁關(guān)鍵靶點，活性成分124(來自文獻(xiàn)[9]，編號自擬)、MOL000007、MOL000008、MOL000098、MOL000206、MOL000415、MOL000422、MOL000437、MOL004799(來自TCMSP數(shù)據(jù)庫，與數(shù)據(jù)庫提供編號一致)為抗抑郁關(guān)鍵成分(結(jié)構(gòu)見圖8)。

圖8 玫瑰花抗抑郁關(guān)鍵成分結(jié)構(gòu)圖Fig.8 The structure chart of the key antidepressant components of Rosae Rugosae Flos

3.6 分子對接結(jié)果

為進(jìn)一步確認(rèn)玫瑰花所含抗抑郁成分及其作用靶點，將抗抑郁核心成分、核心靶點進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)9個核心成分中僅有6個成分可與其相關(guān)靶點進(jìn)行對接(表2)。分子對接打分值越高表示吻合性越好，分析發(fā)現(xiàn)成分MOL000008，MOL000098，MOL000422與靶點P31749的結(jié)合最好(圖9)，成分MOL000008，MOL000206，MOL000422與靶點P31749、P03372也可較好結(jié)合(圖10～11)。

表2 核心靶點分子對接Table 2 Molecular docking results of core targets

圖9 靶點P31749 分子對接可視化結(jié)果Fig.9 Molecular docking visualization results of target P31749

圖10 靶點P35354分子對接可視化結(jié)果Fig.10 Molecular docking visualization results of target P35354

圖11 靶點P03372分子對接可視化結(jié)果Fig.11 Molecular docking visualization results of target P03372

4 討論

經(jīng)研究初步判定，玫瑰花所含成分中黃酮類化合物在發(fā)揮抗抑郁作用方面更具顯著特異性。玫瑰花的抗抑郁活性成分-靶點頻數(shù)分析結(jié)果顯示(圖3)，C1成分(黃酮類化合物)和C5成分(酚酸類化合物)對于抑郁相關(guān)靶點均具備較高的特異性，且黃酮類化合物覆蓋更多的靶點。大量報道證明，酚酸類化合物受生物利用度的影響和制約[10]，說明其成藥性差，因而不作為首選研究藥物和臨床前體藥物研究的參考。進(jìn)一步針對玫瑰花抗抑郁核心靶點和核心成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)僅有黃酮類化合物發(fā)揮高度特異性(圖7)。

迄今為止，從玫瑰花中共分離和檢測到的所有成分中黃酮類化合物占比較高，約占40.87%[11]，研究發(fā)現(xiàn)該類化合物與抗抑郁化合物顯示出高度結(jié)構(gòu)相似性。通過片段結(jié)構(gòu)相似性比對，設(shè)置篩選條件為高度結(jié)構(gòu)相似性≥95%，結(jié)合其結(jié)構(gòu)特性及相對應(yīng)的靶點和分子對接結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物及其相對應(yīng)的靶點具備更高的特異性。另外已有研究表明，大量的黃酮類物質(zhì)具有抗抑郁作用，槲皮素[12]和蘆丁[13]可通過降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)量，緩解抑郁樣行為；山柰酚、芹菜素[14-15]則能通過抑制單胺氧化酶(MAO)的表達(dá)，顯示出抗抑郁活性；金絲桃苷通過影響5-HT系統(tǒng)，顯示出抗抑郁作用[16]。然而，玫瑰花作為藥食同源中藥材之一，具有安全有效的優(yōu)勢，其抗抑郁作用機(jī)理的研究不足嚴(yán)重影響了具有較高藥用價值和經(jīng)濟(jì)價值[17]的玫瑰花藥用開發(fā)。

藥物的藥效成分不僅作用于相關(guān)靶點，還可以影響靶點相關(guān)多個信號通路與代謝途徑，進(jìn)而干擾特定疾病的發(fā)生發(fā)展。本次研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素、山柰酚均可作用于靶點AKT1、PTGS2、ESR1，異丁香酚可作用于PTGS2、ESR1，槲皮素可作用于AKT1，異槲皮苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷均可作用于PTGS2。已有研究證實，參與神經(jīng)生物學(xué)過程的蛋白激酶是情感障礙藥物治療、預(yù)后、診斷的新靶點[18]。蛋白激酶AKT1是蛋白激酶B的一種亞型，對神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育、生長和存活起著重要作用，當(dāng)其在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)顯著上調(diào)，大鼠抑郁樣行為具有明顯的緩解趨勢[19]。AKT1P還參與到與各種生長因子相關(guān)的HIF-1信號通路[20]、與催乳素受體相關(guān)的催乳激素信號通路[21]、與神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)的多巴胺能神經(jīng)突觸通路當(dāng)中，這些通路可能是芹菜素、山柰酚、槲皮素作用于靶點AKT1發(fā)揮抗抑郁功效的作用機(jī)制。大量證據(jù)表明炎癥過程和氧化應(yīng)激反應(yīng)是抑郁癥發(fā)病的主要機(jī)制，在抑郁癥中起著重要的作用，抑郁癥所伴隨的神經(jīng)退行性加重，部分是由炎癥過程引起的[22]。PTGS2是一種炎性相關(guān)酶，在慢性炎癥組織中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性病變相關(guān)的炎癥過程[23]。而PTGS2基因編碼的環(huán)氧合酶-2與MDD發(fā)病機(jī)制有關(guān)[24]。COX-2抑制劑還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和PGE2發(fā)揮抗抑郁作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)玫瑰花抗抑郁作用靶點PTGS2參與到催乳激素信號通路當(dāng)中，此通路可能是芹菜素、異丁香酚、山柰酚作用于靶點PTGS2發(fā)揮抗抑郁功效的作用機(jī)制。有研究顯示，ESR1基因的TT等位基因RS2234693與慢性或重度抑郁癥有關(guān)[26]。新生兒氯丙咪嗪治療顯著誘導(dǎo)下丘腦中ESR1 mRNA表達(dá)增加，并且新生兒氯丙咪嗪治療(在大腦發(fā)育期間)誘導(dǎo)了參與調(diào)節(jié)抑郁樣行為的不同腦區(qū)雌激素受體的變化[27]。經(jīng) KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)玫瑰花抗抑郁作用靶點ESR1可通過催乳激素信號通路發(fā)揮抗憂郁作用。此通路可能是芹菜素、異丁香酚、山柰酚作用于靶點ESR1發(fā)揮抗抑郁功效的作用機(jī)制。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以結(jié)構(gòu)相似性顯著的成分為基礎(chǔ)，采用分子對接技術(shù)，對玫瑰花抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為明晰玫瑰花抗抑郁作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，為抗抑郁新藥研發(fā)提供理論依據(jù)及新的研究思路。