郭靜 劉紅 張學(xué)花 邢會(huì)香 曹得輝 石慧慧

(青海普蘭特藥業(yè)有限公司，青海 西寧 810007)

十五味蘿蒂明目片是傳統(tǒng)藏藥復(fù)方制劑，由蘿蒂、寒水石(奶制)、藏茴香、石灰華、甘草、紅花、渣馴膏、丁香、金錢白花蛇、綠絨蒿、鐵屑、訶子、余甘子(去核)、代赭石、毛訶子組成[1]。原標(biāo)準(zhǔn)[1]含量檢測指標(biāo)單一，只檢測了蘿蒂(阿魏酸)含量。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以甘草酸、甘草苷作為指標(biāo)性性成分進(jìn)行含量測定[2-3]，在查看大量處方相關(guān)含量檢測文獻(xiàn)[4-12]并經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析后，采用HPLC法測定甘草中甘草酸含量；礦物藥中存在重金屬與砷較多，該處方中含多味礦物藥材(代赭石主含三氧化二鐵，鐵屑主含鐵，石灰華主含碳酸鈣[13]，寒水石主含硫酸鹽[14])。由于重金屬及砷含量嚴(yán)重影響藥品質(zhì)量，結(jié)合前期相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16-18]及2020年版《中國藥典》含類似礦物品種重金屬、砷鹽檢查方法分析[19-22]，制定出該制劑中重金屬、砷鹽檢查方法，為有效控制該制劑的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1儀器 ACQUITY Arc高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司)、LC-15C高效液相色譜儀(島津有限公司)；ML204T/02萬分之一電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；C3860超聲波清洗儀(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司有限公司)；SX-4-10箱式電阻爐(天津泰斯態(tài)儀器有限公司)；HH-S11.4電熱恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器有限公司)；ACE Excel 5 C18色譜柱(廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司)；萬用電爐。

1.2藥材與試劑 砷標(biāo)準(zhǔn)溶液、鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，批號(hào)分別為：GSB-04-1714-2004、GSB-04-1742-2004)；甘草酸銨對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110731-201720，純度：97.7%)，甲醇、乙腈均為進(jìn)口色譜純，其余試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水；十五味蘿蒂明目片、缺甘草陰性均由青海普蘭特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1重金屬檢查

2.1.1對(duì)照溶液的制備 稱取硝酸鉛0.1599 g，置1000 mL量瓶中，加硝酸5 mL與水50 mL溶解后，用水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備溶液。臨用前，精密量取貯備液10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液(每1 mL相當(dāng)于10 μg的Pb)。取一支25 mL納氏比色管，加標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液3 mL與醋酸鹽緩沖溶液(pH3.5)2 mL后加水稀釋成25 mL，記作甲管。

2.1.2供試品溶液的制備 取本品1 g，精密稱定，置鉑坩堝中，緩緩熾灼至完全炭化，放冷，加硫酸1 mL使?jié)駶?，加熱至硫酸蒸汽除盡后，加硝酸0.5 mL，蒸干，至氧化氮蒸汽除盡后，在500～600 ℃熾灼使完全灰化，放冷，加7 mol·L-1鹽酸溶液10 mL，攪拌5 min，濾過，濾渣用7 mol·L-1鹽酸溶液洗滌3次，每次5 mL，合并濾液，置分液漏斗中，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL振搖10次，棄去乙醚液，酸液置水浴上蒸干，加水15 mL，滴加氨試液至對(duì)酚酞指示液顯微紅色，再加醋酸鹽緩沖溶液(pH3.5)2 mL，微熱溶解后，加20%鹽酸羥胺溶液2 mL，濾過，濾液置25 mL納氏比色管中，濾渣用水洗滌，合并洗滌液，加水稀釋至刻度作為供試品溶液，記作乙管。

2.1.3檢測溶液的制備 分別加入與乙管相同質(zhì)量的供試品和與甲管相同質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液，照2.1.2法制成測試溶液，記作丙管。

2.1.4空白對(duì)照溶液 照2.1.2方法不加樣品制成空白對(duì)照溶液。

2.1.5比色結(jié)果 將上述三支25 mL納氏比色管及空白對(duì)照溶液同置白紙上，自上向下透視，結(jié)果顯示丙管(D)中顯出的顏色深于甲管，故乙管與甲管比較，乙管(C)中顯出的顏色淺于甲管(B)，即樣品中重金屬含量少于百萬分之三十，見圖1。

A.空白溶液；B.對(duì)照溶液；C.供試品溶液；D.檢測溶液

2.2砷鹽檢查

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)砷對(duì)照液的制備 精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液2 mL，置A瓶中，加鹽酸5 mL與水21 mL，再加碘化鉀試液5 mL與酸性氯化亞錫試液5滴，在室溫放置10 min后，加鋅粒2 g，立即將導(dǎo)氣管C與A瓶密塞，使生成的砷化氫氣體導(dǎo)入D管中，并將A瓶置25～40℃水浴中反應(yīng)45 min，取出D管，添加三氯甲烷至刻度，混勻，即得。儀器裝置，見圖2。

圖2 砷裝置圖

2.2.2供試品溶液的制備 取本品0.67 g，精密稱定，置鉑坩堝中，加氫氧化鈣1.0 g,混勻，加水2～4 mL，攪勻，緩緩熾灼至完全炭化，在500～600 ℃熾灼使完全灰化，放冷，加水5 mL，再緩緩加鹽酸4 mL(注意泡沸)，攪拌5 min，濾過，加水15 mL洗滌濾渣，合并濾液，再加鹽酸4 mL，照2.2.1檢查法，自“再加碘化鉀試液5 mL”起，至添加三氯甲烷至刻度，混勻，即得。

2.2.3比色結(jié)果 將所得溶液與標(biāo)準(zhǔn)砷對(duì)照液同置白色背景上，從D管上方向下觀察、比較，結(jié)果顯示供試品溶液的顏色較標(biāo)準(zhǔn)砷對(duì)照液的顏色淺，即樣品中砷鹽含量少于百萬分之三，見圖3。

A：砷對(duì)照液；B、C：供試品溶液

2.3甘草酸的含量測定

2.3.1色譜條件[23]色譜柱：ACE Excel 5 C18(250×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL·min-1；流動(dòng)相：乙腈-3.3%冰醋酸溶液(33∶67)；檢測波：252 nm；柱溫：28 ℃。理論板數(shù)按甘草酸峰計(jì)應(yīng)不低于5000。

2.3.2甘草酸對(duì)照品溶液的制備 取甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

2.3.3供試品溶液的制備 取十五味蘿蒂明目片適量，研細(xì)，精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率480 w，頻率40 kHz)30min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4陰性樣品溶液的制備 按十五味蘿蒂明目片處方，除甘草外按比例稱取其余藥材，根據(jù)制備工藝，制成陰性樣品，按2.3.3項(xiàng)下供試品溶液制備的方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.5空白溶液的制備 稀乙醇溶液

2.3.6專屬性試驗(yàn) 精密量取甘草酸對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液、空白溶液各10 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜，見圖4。結(jié)果顯示空白溶液、陰性樣品溶液對(duì)主色譜峰無干擾，對(duì)照品和供試品溶液中主色譜峰保留時(shí)間一致。另采用PDA檢測器對(duì)對(duì)照品溶液、供試品溶液中的主色譜峰進(jìn)行峰光譜掃描和純度檢測。結(jié)果顯示對(duì)照品和供試品溶液中主色譜峰純度角度小于純度閾值，純度符合要求，具體數(shù)據(jù)見表1，本試驗(yàn)提示該方法專屬性良好。

A.供試品溶液；B.陰性樣品溶液；C.甘草酸對(duì)照品溶液；D.空白溶液

表1 樣品和對(duì)照品主色譜峰純度角度和純度閾值列表

2.3.7線性關(guān)系考察 精密稱取甘草酸銨對(duì)照品21.36 mg，加70%乙醇制成0.209 mg·mL-1的對(duì)照品貯備溶液。分別精密移取2、3、5、7 mL置25 mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻得標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的測試溶液。分別精密吸取各系列濃度的對(duì)照品溶液10 μL按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜。以質(zhì)量濃度(X,mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得回歸方程Y=9E+06X-225.22(r=0.9999)。結(jié)果表明，甘草酸在0.0164～0.205 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.8重復(fù)性試驗(yàn) 由實(shí)驗(yàn)員(甲)照2.3.3方法平行制備6份供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定進(jìn)行測定，記錄色譜。結(jié)果十五味蘿蒂明目片甘草酸含量的RSD為1.5%，在樣品中待測成分含量為0.1%時(shí)RSD<3(%)，提示該方法重復(fù)性良好。

2.3.9中間精密度試驗(yàn) 由另外一名實(shí)驗(yàn)員(乙)照2.3.3方法平行制備6份供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件用另一臺(tái)(HPLC-15C)高液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜。結(jié)果甲乙兩名實(shí)驗(yàn)員在不同儀器、不同日期、不同色譜柱、不同廠家試劑上測得甘草酸含量的RSD為2.2%，提示該方法中間精密度良好，具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.3.10加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的十五味蘿蒂明目片樣品(批號(hào)190510)，研細(xì)，平行9份樣品，分為3組，分別加入3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平(50%、100%和150%)的甘草酸銨對(duì)照品。按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備回收供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，并計(jì)算甘草酸的加樣回收率，提示該方法的準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.3.11穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果表明供試品在稀乙醇溶液中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在重金屬檢查中，由于制劑中礦物藥種類較多，應(yīng)先用強(qiáng)酸進(jìn)行有機(jī)破壞。其次考慮供試品在高鐵鹽情況下，用乙醚萃取的方式去除鐵屑和代赭石的顏色干擾，再用20%鹽酸羥胺酸性液將3價(jià)Fe還原為2價(jià)，消除氧化硫化氫產(chǎn)生的白色渾濁。

在砷鹽檢查中，由于有機(jī)物對(duì)砷鹽可能存在吸附、絡(luò)合等作用影響檢出，在選用氫氧化鈣法做有機(jī)破壞時(shí)，經(jīng)有機(jī)破壞與未經(jīng)有機(jī)破壞的試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)有機(jī)破壞的樣品能有效排除鐵粉和代赭石顏色干擾。

在甘草酸含量測定中，發(fā)現(xiàn)樣品流動(dòng)相pH在2.0時(shí)對(duì)色譜柱的選擇性較高。ACE色譜柱較一般C18色譜柱分離效果好，耐用性好，故在偏酸環(huán)境中推薦選擇ACE色譜柱。

綜上所述，十五味蘿蒂明目片含量測定、重金屬、砷鹽檢查方法操作簡單，重復(fù)性、準(zhǔn)確度及耐用性良好，本研究為今后該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定了良好的基礎(chǔ)。