李旭陽(yáng)， 潘 琳， 劉慧燕， 胡明珍， 方海田

（1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021）

枸杞（Lycium barbarumL.）是寧夏著名特產(chǎn)，其果實(shí)中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，主要包括多糖、多肽、生物堿、黃酮類、萜烯類、有機(jī)酸、木脂素、酚酰胺、類胡蘿卜素等多種化合物，具有不同的藥理活性和保健作用[1-3]。枸杞不僅具有滋補(bǔ)肝腎、清肝明目、補(bǔ)血安神、延壽益精等功效，還可以通過(guò)阻斷流感病毒表面蛋白和刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，用于預(yù)防和治療流感。枸杞中的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類和多種氨基酸、胡蘿卜素、大量維生素、微量元素可以改善人體的血液循環(huán)，增強(qiáng)人體免疫力和提高人體抗氧化效力[4-6]。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，進(jìn)入并定植在胃腸道后，能夠與宿主共生，從而構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境[7]。乳酸菌不僅可以調(diào)節(jié)人體代謝平衡，還是發(fā)酵產(chǎn)品中的主要微生物[8]。其在發(fā)酵過(guò)程中，不僅可以改善食品本身帶有的氣味及產(chǎn)品特性，還可以提高產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-11]。此外，乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生大量的蛋白酶及各種微量的脂肪酶，可將食品中的大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)和脂肪降解為更易被人體吸收的小分子氨基酸及脂肪酸等。其自身不僅可以合成維生素B1、B2、B3、B5 等，還可以產(chǎn)生某些游離氨基酸或氨基酸衍生物，抑制丙烯酰胺的合成[12-13]。乳酸菌在食品行業(yè)應(yīng)用廣泛，常被用來(lái)發(fā)酵酸奶及其他乳制品、蔬菜以及肉制品等[14]。

本文以寧夏枸杞為原料，選用瑞士乳桿菌NXU_19022 進(jìn)行枸杞汁發(fā)酵，通過(guò)發(fā)酵時(shí)間、接菌量、加糖量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以乳酸產(chǎn)量為評(píng)定條件確定發(fā)酵工藝參數(shù)，采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。以期為發(fā)酵枸杞工業(yè)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枸杞（市售）；異抗壞血酸（天津市化學(xué)試劑一廠）；檸檬酸（偉博鑫生物公司）；FR980 恒溫培養(yǎng)箱（上海復(fù)日科技有限公司）；HH-3A 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海丙林電子科技有限公司）；PHSJ-3F 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；SBA-40E 生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1不同加糖量對(duì)枸杞汁乳酸含量的影響 將枸杞汁和水以1∶5 的比例混合浸泡5～6 h，浸泡時(shí)加入0．05%（w/v）異抗壞血酸鈉，在浸泡結(jié)束后加入0．15%（w/v）的果膠酶，混勻后進(jìn)行打漿。將打漿完的枸杞汁進(jìn)行過(guò)濾，濾去枸杞籽，并用檸檬酸將枸杞汁的pH 調(diào)整為4．5，加糖量設(shè)為料液的3%、4%、5%、6%、7%，混勻后進(jìn)行55 ℃，25 min 水浴巴氏殺菌。水浴后將培養(yǎng)好的乳酸菌以5%的接種量接入枸杞汁中，輕輕搖晃，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h。測(cè)定乳酸產(chǎn)量。

1.2.2不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)枸杞汁乳酸含量的影響 同1．2．1，加糖量設(shè)定為5%，將發(fā)酵時(shí)間分別調(diào)整為8、10、12、14、16 h。發(fā)酵結(jié)束測(cè)定乳酸產(chǎn)量。

1.2.3不同菌液添加量對(duì)枸杞汁乳酸含量的影響同1．2．1，加糖量設(shè)定為5%，將菌液添加量分別調(diào)整為料液的3．50%、4．00%、4．50%、5．00%、5．50%，發(fā)酵14 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定乳酸產(chǎn)量[15-16]。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnkeu 響應(yīng)面設(shè)計(jì)，在上述3 個(gè)單因素變量中選取3 個(gè)影響顯著的發(fā)酵條件作為響應(yīng)面分析的自變量，以發(fā)酵完成后枸杞汁的乳酸產(chǎn)量作為響應(yīng)值，對(duì)發(fā)酵枸杞汁的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化[17-18]。

1.2.5發(fā)酵后的枸杞汁中多酚含量測(cè)定 吸取1．0 mL適當(dāng)稀釋的枸杞汁于10 mL 比色管中，加入2．5 mL福林酚試劑，搖勻，加入2．5 mL 15%的Na2CO3溶液，其加入樣品、福林酚試劑、15%Na2CO3溶液的比例為1∶2．5∶2．5，加水定容至刻度，搖勻。40 ℃水浴60 min，靜置冷卻20 min，測(cè)定其在波長(zhǎng)778 nm 時(shí)的吸光度值。其標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作為：吸取200 mg/L沒(méi)食子酸0．0、0．2、0．4、0．6、1．0、1．5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，得到?jīng)]食子酸工作液。然后分別取沒(méi)食子酸工作液1．0 mL 于10 mL比色管中，再根據(jù)比例加入福林酚試劑和15%Na2CO3溶液。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)液中總多酚的濃度[19-20]。

1.2.6發(fā)酵后枸杞汁中多糖含量測(cè)定 使用苯酚-硫酸法測(cè)多糖[21-22]。取枸杞汁10 mL，加入30 mL 95%乙醇于4 ℃下靜置24 h，用濾布過(guò)濾并用冷乙醇沖洗沉淀2 次，風(fēng)干后用40 mL 水溶解沉淀。取上述水溶液1 mL 加入1 mL 5%苯酚溶液，再向混合液中加入5 mL 濃硫酸，充分混勻，靜置10 min，再置于40 ℃水浴鍋15 min，后立即冷卻至室溫，測(cè)定其在490 nm 波長(zhǎng)下吸光度。其標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取0．1 mg/mL 葡萄糖0．1、0．2、0．4、0．6、0．8、1．0 mL 至具塞試管中，分別加水定容至2．0 mL，加1 mL 5%苯酚溶液，搖勻后加入5 mL 濃硫酸搖勻，其余操作參照枸杞汁多糖測(cè)定。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算枸杞汁中多糖的濃度。

1.2.7數(shù)據(jù)處理 利用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 2．0 進(jìn)行t 檢驗(yàn)，使用Origin 8．0 作圖，Design Expert 8．0．6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1—圖3 及表2 可以看出，加糖量從3%增加到4%時(shí)，乳酸產(chǎn)量增加。但當(dāng)加糖量高于4%時(shí)，乳酸產(chǎn)量會(huì)下降，可能是糖含量過(guò)高，使發(fā)酵液的濃度和滲透壓升高，抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，從而造成乳酸含量降低，故將加糖量定為4%；接菌量從3．5%增加到4．5%時(shí)，乳酸產(chǎn)量在不斷增加，但當(dāng)再增加接菌量時(shí)，乳酸產(chǎn)量趨于平穩(wěn)或增加量減少，可能是接菌量過(guò)大，無(wú)法滿足乳酸菌代謝所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)代謝，故將接菌量定為4．5%；發(fā)酵時(shí)間從8 h 增加到16 h 時(shí)乳酸產(chǎn)量在不斷增加，但從8 h 至14 h 間每2 個(gè)小時(shí)內(nèi)乳酸產(chǎn)量的差值都有所增加，而從14～16 h 間乳酸產(chǎn)量差值下降，可能是發(fā)酵液中酸度過(guò)高，不利于乳酸菌的生長(zhǎng)，故將發(fā)酵時(shí)間定為14 h。

圖1 加糖量不同時(shí)乳酸產(chǎn)量

圖3 發(fā)酵時(shí)間不同時(shí)乳酸產(chǎn)量

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 菌液添加量不同時(shí)乳酸產(chǎn)量

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，利用Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)以加糖量（A）、菌液添加量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量；以乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[23-24]。

以乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，回歸分析見(jiàn)表2 和表3，對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程為：Y1=372.00+1.87×A+4.38×B+3.75×C-8.75×AB-10×AC-10×BC-21.62×A2-26.63×B2-25.38×C2該模型值F=134.23，（P＜0.0001），說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑闃O顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明沒(méi)有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象，表明模型合理，可以使用該模型推測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。模型中一次項(xiàng)A、B、C，對(duì)響應(yīng)值都有極顯著的影響，交互項(xiàng)BC、AB、AC 對(duì)響應(yīng)值均有顯著影響。二次項(xiàng)A2、B2、C2 有極顯著的影響。根據(jù)F值大小可知，各因素對(duì)乳酸產(chǎn)量影響的主要因素為B>C>A，即接菌量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 以產(chǎn)量為響應(yīng)值的回歸模型及方差分析

通過(guò)圖4—圖6 可直觀地看出各因素交互作用對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響。曲線越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于實(shí)驗(yàn)條件的改變?cè)矫舾?，同理，曲面坡度越平緩，?shí)驗(yàn)條件的改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小。圖4 顯示加糖量與菌液添加量交互形成的曲面坡度陡峭，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響很大，達(dá)到顯著水平。圖5 顯示加糖量與發(fā)酵時(shí)間交互形成的曲面坡度陡峭，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響很大，達(dá)到顯著水平。圖6 顯示菌液添加量與發(fā)酵時(shí)間交互形成的曲面坡度陡峭，說(shuō)明兩者交互作用對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響很大，達(dá)到顯著水平。

圖4 加糖量和菌液添加量對(duì)乳酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

圖5 加糖量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面

圖6 菌液添加量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖

根據(jù)響應(yīng)面法分析得到最佳發(fā)酵條件，詳見(jiàn)表4。

表4 最佳發(fā)酵條件

2.3 發(fā)酵前后枸杞汁中多糖、多酚質(zhì)量濃度變化

枸杞多糖（Lyciumbarbarumpolysaccharide，LBP）是枸杞中活性成分中的一種水溶性多糖，其是一種對(duì)人體健康有益的活性物質(zhì)，具有促進(jìn)免疫、抗氧化、降血糖血脂等作用[25]。實(shí)驗(yàn)表明，不同菌株發(fā)酵的枸杞汁，其多糖含量不同可能是菌株產(chǎn)生胞外多糖。其中NXU_19006 菌株發(fā)酵枸杞汁后多糖含量增加較多。從表6 中可以看出多酚含量與未發(fā)酵枸杞汁多酚含量相比下降，這可能是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)又作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被乳酸菌代謝利用了。其中多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.125 2x-0.014 8，R2=0.999 8；其多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.824 3x-0.0098，R2=0.999 3。

表5 發(fā)酵前后多糖、多酚質(zhì)量濃度變化 mg/mL

3 結(jié)論

本文通過(guò)乳酸菌菌株瑞士乳桿菌NXU_19022進(jìn)行枸杞汁發(fā)酵工藝的優(yōu)化，以乳酸產(chǎn)量為評(píng)定條件，進(jìn)行發(fā)酵時(shí)間、菌液添加量和加糖量關(guān)鍵指標(biāo)的測(cè)定，以響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間12 h、菌液添加量為4.5%、加糖量為4%。并對(duì)發(fā)酵后枸杞汁中多糖多酚類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)酵后枸杞汁多糖含量增加，多酚物質(zhì)含量下降。綜上，瑞士乳桿菌發(fā)酵枸杞汁，可以提高枸杞汁中乳酸含量和多糖含量。