劉光明， 劉慶梅， 楊 陽(yáng)， 劉 萌， 李夢(mèng)思， 桓 霏， 郜 帥， 曹敏杰

(集美大學(xué) 海洋食品與生物工程學(xué)院/水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心/廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門 361021)

引起機(jī)體過(guò)敏反應(yīng)的原因眾多，其中由食物引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)發(fā)病率不容忽視[1]，食物過(guò)敏也已被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重要的健康問(wèn)題之一[2]。西方國(guó)家過(guò)敏人群的過(guò)敏食物以花生及堅(jiān)果類為主，而東方國(guó)家多為魚類及甲殼類水產(chǎn)品[3]。2020年，我國(guó)甲殼類水產(chǎn)品總產(chǎn)量為603.3萬(wàn)t；相較于2019年，其增長(zhǎng)率為6.32%[4]；隨著年產(chǎn)量及消費(fèi)量的增加，食用甲殼類水產(chǎn)品引起的過(guò)敏問(wèn)題也呈增加的趨勢(shì)。蟹類是重要的甲殼類水產(chǎn)品，其誘發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)是由免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)E介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)，通常會(huì)持續(xù)終生[5]。我國(guó)香港地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示，在459名過(guò)敏患者中，對(duì)蟹類、蝦類和貝類的過(guò)敏患病率分別為15.3%、13.9%和11.1%[6]。因此，蟹類引起的過(guò)敏反應(yīng)不容忽視。

食物過(guò)敏原是指能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE抗體并與之結(jié)合，進(jìn)一步激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而引發(fā)過(guò)敏癥狀的食物特定成分。目前經(jīng)由世界衛(wèi)生組織/國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(World Health Organization/International Union of Immunological Societies，WHO/IUIS)過(guò)敏原命名小組鑒定的超過(guò)125個(gè)物種的370種食物過(guò)敏原，90%以上為蛋白質(zhì)[7]，其中已被命名的蟹類過(guò)敏原共9個(gè)。在過(guò)敏原分子中決定特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)稱為抗原表位，可被抗體或免疫受體識(shí)別[8]。目前，蟹類過(guò)敏原(如原肌球蛋白、精氨酸激酶等)的抗原表位已逐漸被定位分析。此外，多項(xiàng)研究表明：不同處理技術(shù)主要通過(guò)改變過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)，修飾、破壞或掩蓋過(guò)敏原的表位，從而達(dá)到消減過(guò)敏原致敏性的目的[9-10]。我國(guó)蟹類過(guò)敏的發(fā)生率較高，如何消減蟹類致敏性、促進(jìn)蟹類產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展已成為一個(gè)亟需解決的重要問(wèn)題。本文介紹了蟹類水產(chǎn)品過(guò)敏原及過(guò)敏原表位，詳細(xì)對(duì)比了用于消減蟹類水產(chǎn)品致敏性的不同處理技術(shù)，以期為蟹類低致敏食品及低致敏性生物制品的開發(fā)提供參考。

1 蟹類水產(chǎn)品過(guò)敏原及過(guò)敏原表位

過(guò)敏原對(duì)熱、pH值和胃腸道消化酶具有高度耐受能力，從而保留完整的表位序列和結(jié)構(gòu)，可被過(guò)敏原特異性免疫細(xì)胞識(shí)別，引發(fā)特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致過(guò)敏癥狀[11]。隨著蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的進(jìn)步，目前已有多種蟹類過(guò)敏原被報(bào)道，其中原肌球蛋白(tropomyosin，TM)與精氨酸激酶(arginine kinase，AK)是主要過(guò)敏原，其他次要過(guò)敏原，如肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP)等也備受關(guān)注[12]。

1.1 原肌球蛋白

TM由多種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白組成，主要功能是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架[13]。1998年，在銹斑蟳(Charybdisferiatus)中TM被鑒定為過(guò)敏原，并獲批WHO/IUIS系統(tǒng)命名為Cha f 1[14]。此后TM也相繼在帝王蟹(Paralithodescamtschaticus)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、青蟹(Scyllaparamamosain)、梭子蟹(Portunuspelagicus)和雪蟹(Chionoecetesopilio)等蟹類中被發(fā)現(xiàn)，序列同源性均高達(dá)95%以上[15-16]。TM致敏率在23%～83%，分子質(zhì)量為34～38 kDa，氨基酸長(zhǎng)度由284個(gè)氨基酸殘基組成，是等電點(diǎn)約為4.5的糖蛋白，耐熱耐酸堿，且具有良好的消化穩(wěn)定性(耐胃蛋白酶和胰蛋白酶消化)[6]。其空間結(jié)構(gòu)由兩條α-螺旋相互纏繞而成，增加了蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使其經(jīng)高溫高壓處理后仍能保持較強(qiáng)的致敏性[17]。在蟹類TM的過(guò)敏原表位分析中，有研究采用消化酶水解結(jié)合質(zhì)譜分析獲得青蟹TM的7條耐熱耐消化的線性表位[18]。此外，Liu等[19]以兔抗青蟹TM多克隆抗體為靶蛋白，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)淘選獲得青蟹TM的8條IgG線性表位與7個(gè)IgG構(gòu)象表位。

1.2 精氨酸激酶

AK的生理功能主要是參與細(xì)胞ATP水平的調(diào)節(jié)，它可催化甲殼類動(dòng)物中L-精氨酸殘基的磷酸化，這是細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)機(jī)制的關(guān)鍵反應(yīng)[20]。過(guò)敏原AK已在雪蟹[21]、梭子蟹[22]、青蟹[23]、褐蟹(Callinectesbellicosus)[24]等蟹類中被鑒定，分子質(zhì)量為40～42 kDa，一般由359個(gè)氨基酸殘基組成，等電點(diǎn)約6.0，胰酶消化240 min后仍維持原有蛋白條帶，但不耐胃蛋白酶消化。目前，青蟹AK的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，其是由α螺旋的N端區(qū)域與α螺旋-β折疊的C端區(qū)域纏繞成的不對(duì)稱結(jié)構(gòu)[23]。與TM相比，AK不穩(wěn)定、不耐熱，且易揮發(fā)，因此也被認(rèn)為是吸入蒸汽引起呼吸道過(guò)敏癥狀的過(guò)敏原之一[25]。Yang等[26]以蟹類過(guò)敏患者血清中特異性IgE為靶蛋白，通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得青蟹AK的5條線性表位與8個(gè)構(gòu)象表位。利用BediPred和Discotope進(jìn)行褐蟹AK的表位預(yù)測(cè)分析，得到8條潛在的線性表位和7個(gè)潛在的構(gòu)象表位，其中2條線性表位(K40-S45、S130-F136)及2個(gè)構(gòu)象表位(D106N108、E317E319G320)與青蟹AK的表位重疊[24]。

1.3 肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白

屬于鈣離子結(jié)合蛋白家族的SCP在肌肉松弛方面發(fā)揮重要作用，空間結(jié)構(gòu)包含螺旋- 環(huán)- 螺旋基序以結(jié)合鈣離子，已在雪蟹[24]、青蟹[27]中被鑒定為過(guò)敏原。其分子質(zhì)量約為20 kDa，包含194個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.7，在高溫(60～100 ℃)、弱酸(pH值2.0～5.0)、強(qiáng)堿(pH值10.0～11.0)條件下均易發(fā)生聚合，且不耐胃蛋白酶消化。Chen等[28]通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)合血清學(xué)實(shí)驗(yàn)確定了青蟹SCP的3條線性表位，Yang等[26]采用噬菌體展示技術(shù)獲得青蟹SCP的6個(gè)構(gòu)象表位。

1.4 其他過(guò)敏原

除了上述3種過(guò)敏原，其他一些蟹類過(guò)敏原也受到研究關(guān)注：Li等[29]鑒定了青蟹中分子質(zhì)量為18 kDa的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)，獲批WHO/IUIS系統(tǒng)命名為Scy p 3，其對(duì)熱穩(wěn)定，包含153個(gè)氨基酸殘基，三級(jí)結(jié)構(gòu)由8個(gè)α-螺旋緊密纏繞而成，并利用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合血清學(xué)實(shí)驗(yàn)確定MLC的7條線性表位；Yang等[26]純化獲得了青蟹過(guò)敏原磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TIM)和細(xì)絲蛋白c(filamin c，F(xiàn)LN c)，分子質(zhì)量分別為28 kDa和90 kDa，均不耐熱。TIM的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)二聚體且單體為(β/α)8筒狀[30]，F(xiàn)LN c中過(guò)敏優(yōu)勢(shì)區(qū)(336～531個(gè)氨基酸位置)的晶體結(jié)構(gòu)是由16條β-折疊和2條α-螺旋組成的筒狀[31]。通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得TIM的4條線性表位與4個(gè)構(gòu)象表位、FLN c的6條線性表位與6個(gè)構(gòu)象表位，且TIM和FLN c由于相同表位基序PLRG、P(T/K)VH(I/T)L、MQP和L- TT- GA的存在，使得二者能夠被相同的抗體識(shí)別結(jié)合[26]。血藍(lán)蛋白(hemocyanin，Hc)已在中華絨螯蟹中被鑒定，其存在3條與血清IgE結(jié)合頻率大于40%的重要線性表位[32]。

由研究報(bào)道可知，已鑒定的蟹類水產(chǎn)品過(guò)敏原及其詳細(xì)的表位信息見表1。

表1 蟹類水產(chǎn)品過(guò)敏原及過(guò)敏原表位

2 蟹類水產(chǎn)品致敏性的消減技術(shù)

基于鑒定的過(guò)敏原及其表位，選擇有效的處理方式定向消減蟹類致敏性以生產(chǎn)低致敏產(chǎn)品，已逐漸成為該領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)新趨勢(shì)。迄今為止，致敏性消減主要可分為物理法、化學(xué)法、生物法3大類，物理法包括熱處理、輻照、超聲技術(shù)等，化學(xué)法包括美拉德反應(yīng)等，生物法包括酶法交聯(lián)、酶解技術(shù)、微生物發(fā)酵和分子改造等[2, 10]。

2.1 物理消減技術(shù)

2.1.1熱處理消減

熱處理是最常用的加工方法，包括煮制、蒸制、高壓蒸汽等，主要借助高溫影響過(guò)敏原的空間結(jié)構(gòu)、消化性和抗原表位等，以改變過(guò)敏原的致敏性。Yu等[33]發(fā)現(xiàn)煮制對(duì)TM的消化穩(wěn)定性影響不大，高壓蒸汽通過(guò)降低青蟹TM的消化穩(wěn)定性而達(dá)到消減青蟹致敏性的效果。Liu等[34]比較了蒸制、煮制和高壓對(duì)擬穴青蟹肌肉組織的影響，結(jié)果顯示高壓處理通過(guò)減少青蟹肌肉組織中的過(guò)敏原含量和種類、破壞蛋白空間結(jié)構(gòu)，從而有效降低了青蟹肌肉粗蛋白的致敏性。但由于熱處理方式和蟹肉中各個(gè)過(guò)敏原耐熱性的不同，使得熱處理在降低蟹肉致敏性的研究結(jié)果中存在差異[35]，因此，利用該方法有效消減蟹肉的致敏性還有待進(jìn)一步深入。

2.1.2輻照消減

利用射線對(duì)食物進(jìn)行輻照，通過(guò)產(chǎn)生電離和激發(fā)而釋放出軌道電子并形成自由基，使之與食物中的蛋白質(zhì)發(fā)生一系列物理、化學(xué)、生物化學(xué)反應(yīng)，降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解、聚合、交聯(lián)、改性等[36]。筆者研究團(tuán)隊(duì)利用輻照技術(shù)處理了中華絨鰲蟹和三疣梭子蟹的TM，結(jié)果顯示低輻照劑量(3～7 kGy)對(duì)TM致敏性無(wú)影響，當(dāng)輻照劑量提高至10 kGy時(shí)明顯破壞了TM結(jié)構(gòu)完整性，有助于其消化性的升高和致敏性的降低[37]。同樣地，張明琦等[38]發(fā)現(xiàn)隨著輻射劑量的增加，蟹粗提液的蛋白濃度下降、疏水性升高、與抗體的結(jié)合能力減弱，結(jié)果表明輻照能夠改變蟹過(guò)敏原的溶解度、空間結(jié)構(gòu)、掩蓋或破壞過(guò)敏原的抗原表位，從而有效消減其致敏性。

2.1.3超聲消減

超聲波是一種機(jī)械波，在傳播過(guò)程中與媒介相互作用，可以形成高速率、高剪切力的微小漩渦，誘導(dǎo)基質(zhì)的空化效應(yīng)，產(chǎn)生自由基，從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變[39]。超聲處理可以引起食物組織的微觀結(jié)構(gòu)破壞、總蛋白的溶解度顯著降低，導(dǎo)致過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、體外消化率顯著提高，從而影響食物的致敏性[40]。程華峰等[41]發(fā)現(xiàn)普通蒸煮對(duì)中華絨螯蟹肌肉粗蛋白的致敏性無(wú)影響，超聲結(jié)合蒸煮處理能促進(jìn)粗蛋白中TM的降解，并降低其致敏性。此外，有研究表明：微波處理后青蟹肌肉粗提物中TM的消化穩(wěn)定性及致敏性沒(méi)有明顯變化，而超聲處理(200 W、30 ℃)、超聲結(jié)合蒸煮處理均能使青蟹TM快速消化從而降低蟹肉的致敏性，其中超聲結(jié)合蒸煮處理的效果更顯著[42]。

2.2 化學(xué)消減技術(shù)

蟹類水產(chǎn)品致敏性的化學(xué)消減技術(shù)是通過(guò)美拉德反應(yīng)完成。美拉德反應(yīng)是利用食物中的游離氨基或者氨基酸殘基與還原糖(果糖、木糖、阿拉伯糖、麥芽糖等)的羰基在一定溫度下發(fā)生非酶褐變的反應(yīng)[43]。迄今為止，美拉德反應(yīng)消減食物過(guò)敏原致敏性的研究越來(lái)越多，其主要機(jī)理在于還原糖通過(guò)修飾過(guò)敏原的關(guān)鍵位點(diǎn)來(lái)降低其與特異性抗體的結(jié)合，以達(dá)到食物減敏或脫敏的效果[44]。Han等[45]將擬穴青蟹TM、AK與L-阿拉伯糖反應(yīng)后，由于過(guò)敏原的表位發(fā)生糖化修飾而被掩蓋、破壞，使得TM美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的脫顆粒能力降低了12.5%，AK美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的脫顆粒能力降低了30.0%。擬穴青蟹SCP與木糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且糖化修飾產(chǎn)生的糖鏈對(duì)過(guò)敏原表位形成封閉作用，使其能夠顯著下調(diào)過(guò)敏患者嗜堿性粒細(xì)胞表面CD63分子的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞下降比例為20.44%～90.83%，最終有效消減了SCP的致敏性[27]。

2.3 生物消減技術(shù)

2.3.1酶法交聯(lián)消減

在溫和的反應(yīng)條件下，交聯(lián)酶(漆酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸酶、過(guò)氧化物酶等)可以通過(guò)分子內(nèi)或分子間共價(jià)鍵誘導(dǎo)蛋白質(zhì)交聯(lián)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象[46]。目前，酶與過(guò)敏原的交聯(lián)在降低食物過(guò)敏原致敏性方面顯示出廣闊的前景。酪氨酸酶和辣根過(guò)氧化物酶均能與擬穴青蟹TM發(fā)生交聯(lián)，產(chǎn)生的大分子物質(zhì)的疏水性明顯變化、致敏性顯著降低，并在一定程度上誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)耐受[47]。Fei等[48]發(fā)現(xiàn)在咖啡酸和酪氨酸酶催化下與擬穴青蟹AK有效交聯(lián)，交聯(lián)產(chǎn)物耐胃蛋白酶消化、二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且由于抗原表位被覆蓋而降低肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的能力，并在小鼠體內(nèi)顯示致敏性降低。

2.3.2酶解消減

酶解技術(shù)作為一種高效、安全、環(huán)保的傳統(tǒng)食品加工方法應(yīng)用于食品工業(yè)，蛋白酶可水解斷裂過(guò)敏原的肽鍵來(lái)破壞其空間結(jié)構(gòu)和線性表位，以達(dá)到降低過(guò)敏原致敏性的目的[49]。有研究發(fā)現(xiàn)在3種蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及蛋白酶P)的消化作用下，北海道毛蟹和雪蟹提取物的致敏性幾乎完全喪失[50]。同樣地，Yu等[51]利用胃蛋白酶處理擬穴青蟹AK，酶解產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力明顯降低，提示AK消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合位點(diǎn)可能在消化過(guò)程中被部分或全部破壞，從而減弱了與血清IgE抗體的反應(yīng)能力。酶解技術(shù)能夠有效消減過(guò)敏原的致敏性，但仍受到酶的種類、酶解模式、酶解程度等因素的影響。

2.3.3微生物發(fā)酵消減

發(fā)酵法是生物技術(shù)中最早發(fā)展和應(yīng)用的食品加工技術(shù)之一，利用微生物的代謝活動(dòng)，通過(guò)生物催化劑(微生物細(xì)胞或酶)將有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品的過(guò)程[52]。有研究利用發(fā)酵技術(shù)消減小龍蝦及魚類致敏性的同時(shí)，還能保持水產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)[53-54]。同時(shí)，趙丹丹等[55]通過(guò)乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵大閘蟹，獲得了低致敏性的蟹肉，且產(chǎn)品具有良好的口感與風(fēng)味。由于微生物的參與，在發(fā)酵過(guò)程中需要優(yōu)化多種條件，以獲得期望的效果。但不同食品發(fā)酵所需的菌株及時(shí)間等條件的差異，制約了該方法在食品加工中的廣泛應(yīng)用。

2.3.4分子改造消減

分子改造技術(shù)已逐漸成為獲得理想蛋白質(zhì)的常用方法，對(duì)誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原表位進(jìn)行表位刪除、突變等，能夠有效降低過(guò)敏原的IgE結(jié)合能力和致敏性。Liu等[19]利用定點(diǎn)突變技術(shù)突變青蟹TM抗原表位上的關(guān)鍵氨基酸，顯著降低了TM的IgE結(jié)合能力。Xia等[30]將青蟹TIM構(gòu)象表位上的關(guān)鍵氨基酸突變?yōu)楸彼?，獲得了低致敏性突變體。對(duì)青蟹SCP構(gòu)象表位關(guān)鍵氨基酸及鈣離子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行替換，有效消減了SCP的致敏性[56]。此外，Li等[57]通過(guò)敲除青蟹TM、MLC耐熱耐消化的線性表位構(gòu)建了2種突變衍生物，與野生型過(guò)敏原相比，該類衍生物表現(xiàn)出顯著降低的IgE結(jié)合能力和致敏性。

當(dāng)前對(duì)于蟹類水產(chǎn)品致敏性消減技術(shù)的研究中，物理法、化學(xué)法及生物法中的酶法交聯(lián)、酶解法研究較多，而生物法中的微生物發(fā)酵、分子改造尚處于起步階段。蟹類水產(chǎn)品致敏性消減處理技術(shù)的對(duì)比分析見表2。

3 總結(jié)與展望

迄今為止，已有多種蟹類中的過(guò)敏原被鑒定、抗原表位被定位，同時(shí)，物理法、化學(xué)法、生物法均能夠改變蟹肉中過(guò)敏原的結(jié)構(gòu)、并對(duì)其抗原表位進(jìn)行修飾、破壞或掩蓋等，從而有效消減了蟹肉的致敏性。雖然不同處理方式在蟹類致敏性消減方面取得了一定的進(jìn)展，但仍然存在一些問(wèn)題有待深入：1)蟹類水產(chǎn)食物中復(fù)雜的基質(zhì)對(duì)加工效果存在影響，因此蟹類水產(chǎn)品過(guò)敏原結(jié)構(gòu)與致敏性的構(gòu)效關(guān)系解析是該領(lǐng)域的研究難點(diǎn)。2)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)與工業(yè)化生產(chǎn)之間存在多種技術(shù)銜接問(wèn)題，目前難以實(shí)現(xiàn)低致敏性蟹類食品的大規(guī)模量產(chǎn)，對(duì)于當(dāng)前效果明顯的消減處理方式亟須進(jìn)行工業(yè)化中試。3)單一的加工技術(shù)難以同時(shí)消減蟹肉中多個(gè)過(guò)敏原的致敏性，現(xiàn)有蟹類產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)大多涉及熱處理，利用多種加工方法聯(lián)合處理進(jìn)行探究，例如將熱處理與超聲技術(shù)或美拉德反應(yīng)技術(shù)或酶法處理技術(shù)等聯(lián)用有望更大程度地降低其致敏性，以促進(jìn)蟹類產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。