聶黔麗，王修俊*，劉林新，陳顏紅，包歡歡，何春霞

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

豆豉主要以黃豆或黑豆為原料，經(jīng)過微生物群落作用發(fā)酵而成。因其獨特風味及營養(yǎng)價值而成為我國四大傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品之一，長期食用還具有助消化、增強肝臟排毒、預防癌癥等生理功能。細菌型豆豉主要在山東、貴州及云南等地較為常見，這類豆豉主要通過細菌在蛋白酶作用下分解蛋白質(zhì)進行有氧發(fā)酵，利用食鹽、高濃度白酒改變微生物生長環(huán)境減緩其生長速度，此外還通過添加姜粉、胡椒粉去豆腥增加發(fā)酵風味物質(zhì)在無氧環(huán)境后熟發(fā)酵，干燥既得成品細菌型豆豉。遵義細菌型干豆豉作為遵義的一種特色美食，常與臘肉、折耳根搭配成為遵義地方特色菜，深受人們喜愛。

豆豉的質(zhì)量、風味與發(fā)酵過程中的微生物密切相關，而目前遵義細菌型自然發(fā)酵豆豉主要以家庭式或者手工作坊式自然發(fā)酵，涉及的菌群多、菌群產(chǎn)物復雜，發(fā)酵主要貢獻菌群無法控制，發(fā)酵出來的豆豉品質(zhì)無法保障。針對這一問題，目前大多數(shù)研究都采用高通量測序?qū)ψ匀话l(fā)酵豆豉的菌群結構及多樣性進行分析，該技術不需分離純化樣品中的微生物，能夠有效避免純培養(yǎng)挑菌過程中的主觀性，并且能客觀反映樣品中微生物群落結構和組成，因此被廣泛應用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的菌群研究中。趙文鵬等利用高通測序技術研究得到曲霉型豆豉發(fā)酵中細菌群落組成和演替規(guī)律；李薇等則對毛霉型豆豉的微生物群落結構及動態(tài)演替規(guī)律進行了分析；鄧高文等以貴州水豆豉為研究對象，利用該技術對其細菌菌群結構及多樣性進行研究。但是目前的研究大多集中于對霉菌型豆豉的研究，關于細菌型豆豉仍然較少，并且都只是側重于分析豆豉的菌群結構及多樣性，關于豆豉微生物菌落結構多樣性及其與風味品質(zhì)的相關性的研究甚少。

傳統(tǒng)的遵義細菌型自然發(fā)酵豆豉，發(fā)酵周期長、發(fā)酵過程復雜，難以判斷其發(fā)酵周期。因此本研究以發(fā)酵成熟的干豆豉為原料，依托高通量測序分析遵義細菌型豆豉樣品的菌落結構，揭示遵義細菌型自然發(fā)酵干豆豉的微生物菌落結構多樣性，并對遵義細菌型豆豉的風味品質(zhì)進行分析，從而為遵義細菌型豆豉微生物菌群結構影響其風味物質(zhì)形成的機理提供重要參考及為后續(xù)生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然發(fā)酵干豆豉成品（以下簡稱豆豉） 遵義新嘉裕食品有限公司；土壤基因組提取試劑盒 美國Omega公司；Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混合液、Hieff NGS?基因分選磁珠 上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Pico-21臺式離心機 美國Thermo Fisher公司；ETC 811 PCR儀 北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Q32866Qubit3.0熒光計 美國Invitrogen公司；FR-1000凝膠成像系統(tǒng) 上海復日科技有限公司；DYCZ-21電泳槽、DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳拓能達科技有限公司；ZHWY111B型恒溫搖床 上海志城分析儀器有限公司；FA1004型電子精密天平 上海良平儀表有限公司；YX280B型手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；LS-1F型超凈化工作臺 上海索普儀器有限公司；0.5～10 μL移液槍 羅德生物技術有限公司；SPX-250B-G型光照培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；78-1型磁力加熱攪拌器 常州博遠實驗分析儀器廠；XHF-D高速勻漿機 寧波新芝股份有限公司；L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB手動固相微萃取裝置 美國Supelco公司；HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 高通量測序

1.3.1.1 樣品預處理

隨機取豆豉樣品2.0 g，使用高溫滅菌的剪刀將其剪碎后混合均勻，取0.5 g樣品放入2.0 mL樣品管，在組織破碎儀中進行破碎后提取，得到內(nèi)切樣品，命名為DC-1；將0.5 g樣品加入無菌水混合均勻后離心留取適量沉淀后進行提取，得到表皮樣品，命名DC-2。

1.3.1.2 豆豉樣品DNA提取及PCR擴增

使用E.Z.N.AMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒對樣品中的DNA進行提取，提取方法參照試劑盒的說明進行，得到樣品基因組DNA。

以Nobar_341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）、Nobar_805R（CCTACGGGNGGCWGCAG）作為引物對細菌16S rRNA序列的V-V區(qū)域進行擴增。將PCR體系各組分于無菌離心管中混合均勻后短暫離心，之后將PCR管置于PCR儀中按照PCR條件進行擴增，最后將擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫大小，為了得到均勻的長簇效果和高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，使用Qubit 3.0熒光定量儀進行文庫濃度測定，構建測序文庫后委托生工生物工程（上海）股份有限公司于MiSeq平臺測序。

1.3.1.3 多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過MiSeq得到含有barcode序列的雙端序列數(shù)據(jù)，拼接、對比優(yōu)化后質(zhì)控過濾，參數(shù)為-O5-m50，使用cutadapt去除引物；TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC再根據(jù)PE reads之間的overlap關系使用PEAR將成對reads拼接成一條序列；由barcode序列和引物序列從拼接對優(yōu)化后相似度在97%相似度水平下的數(shù)據(jù)，利用RDP classifier、SINTAX、BLAST進行可操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）分類學分析，以確定細菌型豆豉微生物分類信息。

1.3.2 自然發(fā)酵干豆豉風味品質(zhì)分析

1.3.2.1 氨基酸測定

取粉末顆粒狀豆豉樣品1.00 g，按GB 5009.124ü 2016《食品中氨基酸的測定》方法，每組實驗做3 個平行，結果取平均值。

1.3.2.2 游離脂肪酸測定

參照GB 5009.168ü2016《食品中脂肪酸的測定》，對總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist17和Wiley275標準質(zhì)譜圖，確定揮發(fā)性化學成分，用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對含量。

1.3.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)測定

將豆豉樣品混勻剪碎，稱取充分混勻豆豉樣品2.0 g，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定豆豉揮發(fā)性物質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過mothur軟件進行rarefaction分析，Excel 2019對其余數(shù)據(jù)進行處理。利用R軟件、Excel 2019、Python的ete3 package軟件分別繪制稀釋曲線、相對豐度柱形圖、系統(tǒng)樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 高通量測序結果

2.1.1 豆豉序列分析

經(jīng)Illumina高通量技術對樣品16S rRNA的V-V區(qū)域進行測序并對測序結果進行篩選后，共得到424 631 條長度大于400 bp的有效序列，細菌及真菌樣品OTU覆蓋率高達99%，表明豆豉樣品中微生物種類幾乎都被檢測到，完全能夠代表樣本中細菌的真實情況；樣品平均Chao指數(shù)為245.24，有效序列有133 587.5 條，OTU數(shù)為81，說明測序結果覆蓋全面，長度大于分析標準序列，可用于序列測定分析（表1）。在OTU劃分的基礎上，按照97%相似性水平下對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類注釋，再通過RDP和SINTAX將OTU代表序列鑒定后得到，豆豉中的微生物被鑒定為7 個門，15 個綱，20 個目，30 個科，44 個屬。

表1 豆豉序列數(shù)據(jù)Table 1 Bacterial sequencing data for douchi samples

2.1.2 豆豉的細菌多樣性指數(shù)分析

基于QIIME，以樣品在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性指數(shù)構建稀釋曲線，從而反映樣品在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。曲線越平緩說明數(shù)據(jù)樣本量越充足，由圖1可看出，豆豉樣品序列數(shù)大于10 000左右時，多樣性指數(shù)稀釋性曲線趨于平緩，OTU數(shù)目不再上升，達到飽和。表明測序量合理，并且隨著序列數(shù)的增加豆豉樣品中細菌多樣性不會有太大改變，足以反映豆豉樣品中大部分的微生物多樣性。

圖1 細菌α多樣性指數(shù)稀釋性曲線圖Fig.1 Rarefaction curves of bacterial α-index

2.1.3 豆豉的科、屬水平相對豐度分析

由圖2可知，豆豉的細菌在科水平上細菌種類有桿菌科（Bacillacea）、芽孢桿菌科-1（Paenibacillaceae-1）、球菌科（Planococcaceae）、擬桿菌科（Paenibacillaceae-2）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）及其他菌株，從科水平上分析豆豉中芽孢桿菌相對豐度接近50%，說明該地區(qū)豆豉主要貢獻菌群為芽孢桿菌科。在屬水平上，豆豉樣品的優(yōu)勢菌屬有芽孢桿菌屬（）、擬桿菌屬（）、梭形桿菌屬（）、短芽孢桿菌屬（）、無芽孢桿菌屬（）、厭氧桿菌屬（）、乳桿菌屬（）、腸球菌屬（）、未分類芽孢桿菌屬（unclassified_Paenibacillaceae），其平均相對豐度為41.01%、27.23%、7.09%、8.44%、6.6%、2.02%、2.12%、1.58%、1.16%。可見遵義細菌型豆豉中桿菌屬芽孢桿菌、擬桿菌、短桿菌占據(jù)絕對優(yōu)勢，其綜合比例占比高達92.39%，含少量的乳桿菌。

圖2 細菌在科水平和屬水平相對豐度柱狀圖Fig.2 Relative abundance of bacteria at the family and genus levels

2.1.4 豆豉系統(tǒng)發(fā)育菌株種占比分析

從圖3可看出，豆豉菌群隸屬于兩個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），相對含量94.33%和5.39%。其核心優(yōu)勢菌群隸屬于厚壁菌門的桿菌綱，而芽孢桿菌科在該地區(qū)干豆豉中占絕對優(yōu)勢，其相對豐度為41.85%。另外雖然乳桿菌在科水平上的相對豐度僅為2.23%，但是其對豆豉的滋味有重要影響。董蘊等在對細菌類群對豆豉品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，酸味是不同豆豉之間形成差異的最大感官指標，并得到乳桿菌與豆豉的酸味呈正相關；陳浩等研究發(fā)現(xiàn)，添加了乳桿菌發(fā)酵的豆豉，其產(chǎn)品理化特性及揮發(fā)性物質(zhì)均優(yōu)于未添加乳桿菌組；Liu Chenjian等在云南細菌型豆豉中發(fā)現(xiàn)大量乳桿菌，且是該地區(qū)豆豉發(fā)風味形成的主要貢獻者；另外在李曉然等對云南地區(qū)細菌型豆豉的菌群結構研究中，乳桿菌屬相對豐度占絕對優(yōu)勢，在豆豉發(fā)酵中起重要作用，其次10%左右的芽孢桿菌也是該地區(qū)豆豉發(fā)酵的重要菌；而宋園亮在乳桿菌和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵豆豉的研究中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌能顯著減少由純種枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆豉所產(chǎn)生的氨味，使豆豉具有濃厚的酯香，在感官評價中接受度最好。另外在郭婭、鄧高文、黃曉潤等對貴州地區(qū)特色水豆豉菌群結構的分析中，均未檢出乳桿菌，這可能與豆豉的類型有關。因此本研究可以得出，遵義細菌型干豆豉主要由芽孢桿菌和乳桿菌共同作用，協(xié)同發(fā)酵出具有獨特醬香的遵義細菌型干豆豉。

圖3 樣品系統(tǒng)組成樹狀圖Fig.3 Dendrogram of bacterial communities in douchi samples

2.2 豆豉風味品質(zhì)分析

2.2.1 豆豉游離氨基酸分析

由表2、圖4可知，豆豉中總氨基酸含量為24.828 mg/g，共檢測16 種氨基酸，均包括人體所需的6 種必需氨基酸。不同菌株發(fā)酵豆豉對豆豉中氨基酸種類及含量有顯著影響，這主要在與不同微生物的發(fā)酵周期不同，進而影響蛋白質(zhì)水解程度，而發(fā)酵豆制品中的鮮味和苦味物質(zhì)主要是由于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生，當不同滋味的物質(zhì)在一起時會發(fā)生味道的相消、相乘等作用，從而形成了干豆豉獨特的滋味。由表2可以看到，豆豉呈現(xiàn)鮮味氨基酸分別為0.198 mg/g和4.147 mg/g，占0.79%及17.80%；甜味氨基酸蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸及組氨酸含量總和占總氨基酸比率為4.67%；苦味氨基酸纈氨酸、酪氨酸和精氨酸的總和占總氨基酸含量的51.65%，鮮、甜、苦3 種滋味相互作用，呈現(xiàn)了遵義細菌型干豆豉獨特的滋味。

表2 豆豉游離氨基酸組成變化Table 2 Free amino acid composition of douchi

圖4 豆豉游離氨基酸分離譜圖Fig.4 Chromatogram showing the separation of free amino acids in douchi

2.2.2 豆豉游離脂肪酸分析

根據(jù)圖5和表3可知，豆豉中共檢測出26 種游離脂肪酸，其中飽和脂肪酸15 種，硬脂酸含量最高，占總脂肪酸的47.64%。脂肪酸在豆豉風味形成過程中作為重要的前提物質(zhì)對細菌型發(fā)酵豆豉的營養(yǎng)和香氣成分有重要影響，例如硬脂酸、棕櫚酸等可以在多種酶的作用下發(fā)生氧化產(chǎn)生酮類等風味物質(zhì)；而飽和脂肪酸有調(diào)節(jié)人體免疫能力、促進細胞分化等作用，當攝入不足會對人體健康產(chǎn)生影響，尤其是硬脂酸不但是-3系多不飽和脂肪脂肪酸重要補充來源，而且還可以改善豆豉口感，是眾多風味物質(zhì)的前提發(fā)酵物質(zhì)。此外該豆豉中不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的25.26%，其中-3系多不飽和脂肪酸亞麻酸占不飽和脂肪酸總量的93.09%，-6系多不飽和脂肪酸亞油酸占0.929%。不飽和脂肪酸具有降低膽固醇、改善癌癥患者免疫能力和促進癌細胞死亡、抑制癌細胞生長及產(chǎn)后調(diào)劑等多種作用，其中亞麻酸、亞油酸等含量可以作為影響食品營養(yǎng)價值的重要參考標準之一，因此這也是豆豉具有生理保健功能的重要來源之一。

圖5 豆豉游離脂肪酸TICFig.5 TIC chromatogram of free fatty acids in douchi

表3 豆豉游離脂肪酸組成變化Table 3 Free fatty acid composition of douchi

2.2.3 豆豉揮發(fā)性物質(zhì)分析

續(xù)表4

續(xù)表4

由圖6、表4可知，自然發(fā)酵豆豉由于發(fā)酵菌株不確定性和多樣性，揮發(fā)性物質(zhì)種類豐富，共檢測出91 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酸類物質(zhì)、酮類物質(zhì)及烯烴類物質(zhì)種類最多；從揮發(fā)性物質(zhì)相對含量上看，該豆豉酸類物質(zhì)最高達到44.529%，其次是含氮類物質(zhì)12.386%，吡嗪類物質(zhì)占10.622%，醇類物質(zhì)占0.995%。

圖6 揮發(fā)性物質(zhì)的TICFig.6 TIC chromatogram of volatile substances in douchi

表4 豆豉揮發(fā)性物質(zhì)相對含量Table 4 Relative contents of volatile substances in douchi

吡嗪類物質(zhì)含量在該豆豉中僅次于酸類物質(zhì)，是其風味物質(zhì)的主要成分之一。其中2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪閾值極低，會產(chǎn)生可可香氣、烤面包香氣及令人愉悅的烤花生香氣；這類物質(zhì)主要通過影響硫代謝、氨基酸代謝從而對該豆豉風味產(chǎn)生極大影響。

醇類、酮類及酯類物質(zhì)在該豆豉中含量較少，但是對其風味的影響也是極大的。例如醇類物質(zhì)賦予了豆豉典型的豉香醬香風味，其中異戊醇、2-甲基丁醇及1-辛烯-3-醇對豆豉形成特有醬香風味有顯著貢獻，苯甲醇有苦杏仁和濃郁的櫻桃香味。酮類化合物一般呈果香風味，由脂肪酸氧化作用后，其閾值低且增香能力強。在該豆豉中酮類化合物占比4.926%，2-丁酮、2-甲基-3-戊酮、3-甲基-2-戊酮、4-甲基-3-己酮、6-甲基-3-庚酮、6-甲基-2-庚酮、2-壬酮、苯基丙酮等物質(zhì)對豆豉風味物質(zhì)具有較高貢獻度。

結合對遵義細菌型豆豉的高通量測序結果中芽孢桿菌和乳桿菌為豆豉發(fā)酵過程的核心菌群，而有研究報道，豆豉中揮發(fā)性物質(zhì)中酸類物質(zhì)大多由乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)的微生物多數(shù)為枯草芽孢桿菌，此外醇類、酯類等的大部分化合物由枯草芽孢桿菌和乳桿菌共同產(chǎn)生，由此可見遵義細菌型干豆豉的芽孢桿菌及乳桿菌對其風味有著極大影響。

3 結 論

結合遵義細菌型干豆豉的稀釋曲線及相對豐度圖可以看出，該地區(qū)干豆豉的細菌組成比較豐富：共檢出7 個門、15 個綱、20 個目、30 個科、44 個屬；桿菌屬芽孢桿菌、擬桿菌、短桿菌為該豆豉的主要貢獻菌群，在相對豐度中占據(jù)絕對優(yōu)勢，少量的乳桿菌在其發(fā)酵過程中也有重要作用，協(xié)同發(fā)酵出具有獨特豉香的遵義細菌型干豆豉。此外對該干豆豉風味品質(zhì)分析得到，該豆豉中共存在16 種氨基酸，均包括人體所需的6 種必需氨基酸，總氨基酸含量為24.828 mg/g；共檢測出26 種游離脂肪酸，其中飽和脂肪酸15 種，不飽和脂肪酸11 種；利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術從豆豉中檢測出了91 種揮發(fā)性物質(zhì)，以主要影響豆豉風味的酯類、酮類、酸類、醇類及吡嗪類化學物質(zhì)作為參考對主要貢獻香氣成分相對含量及閾值進行比較，酸類物質(zhì)含量最高，其次是含氮類物質(zhì)，醇、酮及酯類物質(zhì)含量較少。本研究促進了遵義細菌型自然發(fā)酵干豆豉微生物菌群結構和風味品質(zhì)相關性的基礎研究，在一定程度驗證了遵義細菌型豆豉的風味主要由芽孢桿菌和乳桿菌共同作用產(chǎn)生，從而為遵義型細菌型豆豉的后續(xù)生產(chǎn)及直投式復合發(fā)酵菌劑的研究提供理論依據(jù)。