郭志明，郭 闖，王明明，宋 燁，陳全勝，鄒小波

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.中華全國(guó)供銷合作總社濟(jì)南果品研究院，山東 濟(jì)南 250220）

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)蘋果產(chǎn)量占世界蘋果產(chǎn)量的45%以上，在我國(guó)水果經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但蘋果采后貯藏過(guò)程中容易被腐敗菌侵染導(dǎo)致變質(zhì)，其中黑曲霉、青霉和鏈格孢是導(dǎo)致蘋果腐敗變質(zhì)的最主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌。腐敗菌侵染果蔬，是腐敗菌與果蔬相互作用的過(guò)程，腐敗菌會(huì)導(dǎo)致蘋果組織細(xì)胞成分發(fā)生變化，這些變化反映了腐敗菌的侵染過(guò)程。在感染早期，腐敗菌主要潛伏在蘋果果實(shí)的表面，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果實(shí)由于生理衰老和環(huán)境條件的變化，抵抗力下降，潛伏的腐敗菌就會(huì)通過(guò)傷口、氣孔和花萼等部位進(jìn)入果實(shí)并迅速萌發(fā)，滲透并產(chǎn)生菌絲體，不僅導(dǎo)致蘋果腐敗變質(zhì)，而且其次級(jí)代謝產(chǎn)物真菌毒素具有致畸致癌的作用，嚴(yán)重危害人體健康，造成嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。其中，某些腐敗菌還會(huì)改變微環(huán)境，有利于腐敗菌的生長(zhǎng)，因此對(duì)果蔬產(chǎn)品中腐敗菌的侵染過(guò)程及物理化學(xué)機(jī)理的研究非常有必要。

傳統(tǒng)的腐敗菌侵染過(guò)程的研究包括化學(xué)分析、電子顯微鏡、掃描電鏡等，雖然可以準(zhǔn)確地測(cè)定植物細(xì)胞的成分和結(jié)構(gòu)，但是這些方法需要先破壞蘋果組織細(xì)胞，測(cè)定步驟復(fù)雜，難以實(shí)時(shí)快速觀測(cè)果蔬組織細(xì)胞成分的空間分布。新興的檢測(cè)技術(shù)，如免疫定位，需要進(jìn)行復(fù)雜的分子修飾和抗原抗體連接，具有耗時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)。因此亟待開發(fā)一種有效的方法，實(shí)現(xiàn)腐敗菌侵染蘋果組織的原位監(jiān)測(cè)和快速監(jiān)測(cè)。

共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)具有無(wú)損、免標(biāo)記、快速、所需樣品量少和樣品前處理簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，所構(gòu)建的拉曼化學(xué)圖像可以揭示組分獨(dú)特的空間分布情況，并且繼承了顯微拉曼光譜成分檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。利用拉曼光譜圖像的指紋性可以揭示待測(cè)物的大分子成分分布信息，通過(guò)拉曼光譜中的細(xì)微變化還可以揭示多型體的分辨、有序度晶體與非晶體及材料的應(yīng)變等分子結(jié)構(gòu)信息，該技術(shù)已廣泛用于生化分析和微生物檢測(cè)。R?sch等采用共聚焦顯微拉曼技術(shù)對(duì)培養(yǎng)皿上的5 種細(xì)菌菌落的類別進(jìn)行判別。Li Yue’e等采用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)研究了鎘對(duì)小鼠肝臟的損傷，為研究鎘在人肝臟中的積累和毒性提供了參考。Pan Tingtao等利用共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)腐敗梨果的交鏈孢酚的含量。趙艷茹等利用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)對(duì)油菜莖稈橫截面健康組織與染菌組織化合物進(jìn)行化學(xué)成像，建立了核盤菌侵染莖稈的早期診斷模型。目前，共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)多應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，Li Guohao等利用磁性顯微拉曼光譜平臺(tái)以外泌體作為癌性標(biāo)志物，對(duì)乳腺癌患者和健康人進(jìn)行判別。Ma Danying等利用利用拉曼顯微光譜學(xué)系統(tǒng)，對(duì)健康和乳腺癌組織進(jìn)行原位拉曼光譜采集，揭示了乳腺組織癌變過(guò)程中許多生化成分的變化，有助于乳腺癌的早期監(jiān)測(cè)和光譜診斷。在果蔬腐敗方面的研究較少，利用拉曼化學(xué)成像技術(shù)闡釋蘋果優(yōu)勢(shì)腐敗微生物的侵染過(guò)程具有重要的科學(xué)價(jià)值和實(shí)用意義。

本研究采用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)蘋果優(yōu)勢(shì)腐敗菌侵染過(guò)程中果實(shí)細(xì)胞和細(xì)胞間隙成分及結(jié)構(gòu)的變化。以全新的視角闡述優(yōu)勢(shì)腐敗菌侵染蘋果腐敗的機(jī)制：1）利用顯微共聚焦拉曼光譜成像系統(tǒng)采集新鮮、侵染早期、侵染中期和侵染晚期蘋果細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙的拉曼光譜，通過(guò)與纖維素和果膠標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜比較，解析出蘋果細(xì)胞成分的拉曼指紋圖譜。2）比較不同侵染階段的蘋果平均拉曼光譜，分析優(yōu)勢(shì)腐敗菌侵染過(guò)程中蘋果細(xì)胞成分纖維素和果膠的變化情況。3）采用夾峰法，選取纖維素和果膠的拉曼特征峰構(gòu)建偽彩色圖像，分析在蘋果細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙的分布情況和腐敗菌侵染過(guò)程中蘋果組織細(xì)胞的細(xì)微變化。為采用拉曼化學(xué)成像技術(shù)研究腐敗菌與果蔬組織互作的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。4）對(duì)腐敗菌侵染蘋果不同階段的拉曼光譜進(jìn)行預(yù)處理和主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）方法建立蘋果不同腐敗程度的判別模型，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)腐敗菌侵染蘋果組織的早期快速診斷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)選用紅富士蘋果共計(jì)60 個(gè)，從江蘇鎮(zhèn)江水果批發(fā)市場(chǎng)挑選大小、形狀一致，沒(méi)有污染物和機(jī)械損傷的蘋果。樣品被運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，隨后在4 ℃儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)前在室溫（25 ℃）條件下放置24 h，使蘋果溫度與實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度一致。

擴(kuò)展青霉（CICC40658）、皮落青霉（CICC40656）、產(chǎn)黃青霉（CICC40654）、黑曲霉（CICC2089）和鏈格孢（CICC2527） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；纖維素標(biāo)準(zhǔn)品、果膠標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PDA培養(yǎng)基 國(guó)藥沃凱有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XploRA PLUS超快速拉曼成像光譜儀 堀場(chǎng)（中國(guó)）貿(mào)易有限公司；DSX-280B高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；Blue pard恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LED-3超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；XB.K.25血球計(jì)數(shù)板 上海市求精生化試劑有限公司；一次性培養(yǎng)皿 鎮(zhèn)江華東器化玻有限公司；一次性無(wú)菌手術(shù)刀 宿遷盛視醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的活化和培養(yǎng)

對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行活化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入第3代后，置于4 ℃冰箱中保存。選用PDA培養(yǎng)基，在85%相對(duì)濕度和28 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌塑料接種環(huán)收集腐敗菌孢子并懸浮于無(wú)菌水中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板將腐敗菌懸液濃度控制在10CFU/mL。

1.3.2 蘋果穿刺接種

選取新鮮的蘋果，用75%乙醇溶液擦拭表面進(jìn)行殺菌消毒，置于無(wú)菌操作臺(tái)紫外線下照射30 min。采用無(wú)菌注射器針頭沿蘋果赤道部分進(jìn)行穿刺，每隔120°穿刺一個(gè)孔，向孔中注入20 μL的菌懸液，將接種好的蘋果置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待腐敗斑直徑約為1 cm，取出染病果實(shí)切片，進(jìn)行拉曼光譜圖像采集。

1.3.3 組織切片制備

新鮮蘋果切片：沿蘋果赤道部位切取2 cmh1.5 cmh1.5 cm的蘋果組織塊，用手術(shù)刀切取0.5 cm厚的薄片，每個(gè)蘋果組織塊做3 個(gè)切片。共選取10 個(gè)新鮮蘋果，共獲取30 個(gè)蘋果切片。

腐敗蘋果切片：選取不同菌種染病的蘋果，每個(gè)接種點(diǎn)切取2 cmh1.5 cmh1.5 cm的蘋果組織塊。每種腐敗菌選擇10 個(gè)蘋果，分別獲取30 個(gè)蘋果組織切片，共獲得150 個(gè)蘋果切片。每個(gè)蘋果切片，按照距接種腐敗中心點(diǎn)的距離劃分為嚴(yán)重腐?。?.5 mm）、中度腐敗（3.5 mm）、輕微腐?。?.5 mm）。用濾紙吸去切片表面多余水分，固定在載玻片上，進(jìn)行拉曼光譜的采集。每個(gè)菌種選擇2 個(gè)蘋果組織切片用于拉曼光譜圖像的采集。

圖1 蘋果組織樣品制備流程（a）和腐敗程度劃分示意圖（b）Fig.1 Preparation of apple tissue samples (a), and plot for spoilage degree division (b)

1.3.4 拉曼光譜與拉曼化學(xué)成像采集

1.3.4.1 蘋果組織和標(biāo)準(zhǔn)品拉曼光譜采集

將蘋果組織切片、纖維素和果膠標(biāo)準(zhǔn)品分別置于自動(dòng)位移平臺(tái)上，調(diào)節(jié)激光光斑聚焦到待測(cè)物表面，每個(gè)光斑點(diǎn)采集3 次，取平均值作為最后的光譜數(shù)據(jù)值。參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)為638 nm，光柵為600 grooves/mm，物鏡倍數(shù)為50，衰減功率為50%，積分時(shí)間為10 s，累計(jì)次數(shù)為1，拉曼位移范圍為300～3 020 cm，共聚焦孔徑為100 μm。

1.3.4.2 拉曼化學(xué)成像

將切片固定到位移平臺(tái)上，垂直方向固定不變，僅在水平方向進(jìn)行成像，區(qū)域?yàn)樘O果的細(xì)胞（180 μmh140 μm）及細(xì)胞間隙（50 μmh140 μm）。先在白光燈下采用50 倍物鏡調(diào)整待測(cè)樣品到清晰的視野，然后關(guān)閉白光，打開激光器，采用點(diǎn)掃描的方式采集待測(cè)樣品的光譜，參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長(zhǎng)為638 nm，激光功率衰減為100%，積分時(shí)間為1 s，采集步長(zhǎng)為5 μm，每個(gè)點(diǎn)累計(jì)次數(shù)為1。掃描結(jié)束后，采用夾峰法，選取拉曼特征峰，構(gòu)建偽彩色圖像，以擴(kuò)展青霉侵染為例，對(duì)腐敗菌侵染過(guò)程中蘋果細(xì)胞壁成分變化進(jìn)行拉曼化學(xué)成像分析。

1.3.5 光譜數(shù)據(jù)處理及建模

為減少瑞利散射、噪聲和熒光背景等對(duì)光譜數(shù)據(jù)分析的干擾，對(duì)采集到的拉曼光譜進(jìn)行預(yù)處理和基線校正。然后采用PCA對(duì)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理和聚類分析，以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)、探索和識(shí)別樣品數(shù)據(jù)中的潛在聚類。最后采用LDA對(duì)蘋果4 種不同腐敗程度的拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析。LDA是一種常用的模式識(shí)別方法，以最小化類內(nèi)的方差，利用數(shù)據(jù)類之間的差異進(jìn)行建模，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)分類和特征提取。本研究所涉及的光譜預(yù)處理采用LabSpec6軟件，PCA和LDA數(shù)據(jù)處理均采用MatLab 2014a軟件（Mathworks Co.USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜預(yù)處理

由于原始拉曼光譜具有一定的光譜噪聲和較高的熒光背景干擾，有效的光譜預(yù)處理非常重要。通過(guò)優(yōu)選光譜預(yù)處理方法對(duì)光譜進(jìn)行去尖峰、平滑和基線校正等處理，能夠有效地減少光譜噪聲，保留有用信息，有利于簡(jiǎn)化建模過(guò)程和提高模型的穩(wěn)定性。因此在建模前，首先對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理。光譜預(yù)處理過(guò)程和結(jié)果如圖2所示。圖2a為原始拉曼光譜，圖2b～d分別為去尖峰，平滑和去基線處理后的拉曼光譜。研究比較發(fā)現(xiàn)最佳的平滑去噪處理參數(shù)設(shè)置為：處理類型為降噪，擬合點(diǎn)數(shù)為126，擬合程度為2，因子為1。去基線參數(shù)設(shè)置為：背底擬合為多項(xiàng)式擬合，參數(shù)設(shè)定為擬合點(diǎn)數(shù)為2，擬合最大點(diǎn)數(shù)為236。通過(guò)光譜預(yù)處理，原始光譜的尖峰被去除，有效信息得到了保留，基線漂移現(xiàn)象得到了很好的改善。

圖2 蘋果細(xì)胞典型的拉曼光譜Fig.2 Typical Raman spectra of apple cells

2.2 蘋果細(xì)胞成分拉曼光譜解析

蘋果組織細(xì)胞壁由多種成分組成，因此采集到的拉曼光譜包含多個(gè)成分信息。研究根據(jù)采集到的蘋果拉曼光譜峰，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜，對(duì)蘋果細(xì)胞拉曼光譜進(jìn)行解析。通過(guò)對(duì)蘋果細(xì)胞壁的拉曼光譜峰進(jìn)行物質(zhì)歸屬解析發(fā)現(xiàn)，半纖維素的拉曼光譜峰位于526 cm和2 946 cm位移處，526 cm處為半纖維素的木聚糖分子振動(dòng)，由于半纖維素和纖維素都具有相似的分子成分，因此2 946 cm也包含了半纖維素的CüH拉伸振動(dòng)信息；果膠的拉曼光譜峰位于835 cm和875 cm位移處，其中835 cm為高甲基化果膠的-糖苷鍵振動(dòng)，875 cm為低甲基化果膠的CüOüC異構(gòu)體的骨架模式振動(dòng)；木質(zhì)素的拉曼光譜峰位于920 cm和1 467 cm位移處，920 cm為木質(zhì)素的（CüOüC）平面對(duì)稱振動(dòng)峰，1 647 cm為木質(zhì)素的üCHü彎曲振動(dòng)峰；蛋白質(zhì)的拉曼位移峰位于991 cm和1 645 cm位移處，其中991 cm為蛋白質(zhì)的CüCH拉伸振動(dòng)和丙氨酸振動(dòng)，1 645 cm為蛋白質(zhì)的酰胺I C=O拉伸振動(dòng)。另外，423 cm和629 cm位移處的拉曼峰表示蘋果細(xì)胞中的果糖成分。蘋果細(xì)胞主要成分的拉曼光譜峰及其所對(duì)應(yīng)的歸屬物質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 蘋果細(xì)胞拉曼光譜峰的物質(zhì)歸屬Table 1 Assignment of Raman spectral peaks of apple cells

2.3 腐敗微生物侵染蘋果不同階段的平均拉曼光譜

蘋果細(xì)胞壁主要包含纖維素、半纖維素、果膠和木質(zhì)素等成分。腐敗菌在侵染蘋果組織的過(guò)程中，會(huì)分泌纖維素酶和果膠酶，水解蘋果細(xì)胞壁，釋放出細(xì)胞內(nèi)的水和其他營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，隨著腐敗程度的增加，蘋果細(xì)胞成分不斷被腐敗菌消耗，其拉曼光譜峰強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生一定程度的變化。圖3顯示了蘋果細(xì)胞在腐敗菌侵染不同階段（新鮮、輕微腐敗、中度腐敗和嚴(yán)重腐?。┑钠骄庾V曲線。

圖3 腐敗菌侵染不同階段的蘋果細(xì)胞平均拉曼光譜Fig.3 Averaged Raman spectra of apple cells at different fungal infection stages

從圖3可以看出，4 種腐敗階段的蘋果細(xì)胞平均拉曼光譜具有一定的相似性，但是強(qiáng)度具有明顯的差別，1 121、1 371 cm和2 946 cm處的拉曼光譜峰強(qiáng)度隨著腐敗程度的增加逐漸下降，表明腐敗菌在侵染蘋果過(guò)程中，產(chǎn)生纖維素酶，分解了蘋果細(xì)胞纖維素，導(dǎo)致蘋果細(xì)胞壁中纖維素含量的降低。這種趨勢(shì)同樣也發(fā)生在835 cm和875 cm處，表明腐敗菌侵染導(dǎo)致蘋果細(xì)胞果膠含量的降低。

2.4 腐敗菌侵染過(guò)程中蘋果細(xì)胞成分拉曼化學(xué)成像分析

為從微觀角度觀測(cè)黑曲霉侵染過(guò)程中蘋果細(xì)胞成分的變化，采用拉曼化學(xué)成像技術(shù)對(duì)侵染早期、中期和晚期的蘋果組織細(xì)胞進(jìn)行成像分析。根據(jù)解析的多糖、纖維素、半纖維素和果膠的拉曼特征光譜，采用夾峰法，選取以上成分的特征光譜峰，以光譜強(qiáng)度構(gòu)建這些成分在蘋果組織細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙中分布的偽彩色圖像。偽彩色條顏色從藍(lán)至紅表示相應(yīng)成份拉曼信號(hào)的強(qiáng)弱變化，顏色越靠近紅色表明待測(cè)成分的含量越高。

2.4.1 糖類成分的可視化分布

由于2 946 cm處的拉曼光譜峰為糖類的CüH拉伸振動(dòng)，為構(gòu)建糖類成分在蘋果組織細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙中的分布圖像，夾峰選取范圍為2 900～3 000 cm位移處的光譜區(qū)間。由圖4a可以看出，新鮮的蘋果組織細(xì)胞形態(tài)呈圓形或橢圓形，大小均勻；中度腐敗的蘋果組織細(xì)胞，形狀發(fā)生褶皺彎曲，細(xì)胞壁表面呈現(xiàn)高低不平的狀態(tài)，原因可能是受到腐敗菌的侵染，細(xì)胞壁成分被分解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)含物流出，導(dǎo)致顯微鏡聚焦困難，視野模糊；而嚴(yán)重腐敗的蘋果組織，細(xì)胞發(fā)生坍塌，細(xì)胞表面凹凸不平，可能原因是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，整體細(xì)胞被分解。圖4b、c顯示了構(gòu)建的糖類成分在蘋果細(xì)胞壁中的糖類分布的偽彩色圖和三維圖，從多糖成分的偽彩色圖像可以看出，糖類成分在細(xì)胞壁中呈不均勻分布的狀態(tài)，越靠近角隅區(qū)和胞間層的區(qū)域含量越高，越靠近細(xì)胞間隙的部分，多糖含量越高；隨著腐敗程度的增加，多糖的含量呈下降趨勢(shì)。

圖4 蘋果細(xì)胞壁中糖類成分分布圖Fig.4 Distribution of carbohydrates in apple cell wall

2.4.2 纖維素成分的可視化分布

由于1 080 cm和1 121 cm處的拉曼光譜峰分別歸屬于纖維素的CüO和CüOüC糖苷鍵振動(dòng)，為了構(gòu)建纖維素成分在蘋果細(xì)胞間隙中分布的偽彩色圖像，通過(guò)夾峰法選取范圍為1 050～1 150 cm處的光譜區(qū)間。構(gòu)建的纖維素成分在蘋果細(xì)胞間隙中的分布圖像（圖5）可以看出，新鮮的蘋果細(xì)胞中，纖維素在細(xì)胞間隙中呈現(xiàn)不均勻連續(xù)分布的狀態(tài)；中度腐敗的蘋果細(xì)胞中，纖維素含量明顯下降，且分布較為離散，可能原因是腐敗菌在侵染蘋果的初期，產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，分解了纖維素；由于纖維素分布存在不均勻的情況，在嚴(yán)重腐敗的蘋果組織偽彩色圖中，局部區(qū)域纖維素出現(xiàn)了較高的情況，甚至高于新鮮的蘋果組織，而在其他區(qū)域，嚴(yán)重腐敗的蘋果細(xì)胞，相比于中度腐敗，纖維素含量變化較小，可能是在腐敗菌侵染末期，腐敗菌的菌絲穿過(guò)細(xì)胞壁，進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)部，依靠細(xì)胞內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)成分大量繁殖。

圖5 蘋果細(xì)胞間隙中纖維素分布圖Fig.5 Distribution of cellulose in the intercellular space of apples

2.4.3 果膠成分的可視化分布

由于果膠的特征拉曼光譜峰位于835 cm和875 cm位移處，因此通過(guò)夾峰法選取800～900 cm范圍內(nèi)的拉曼光譜構(gòu)建果膠成分在蘋果細(xì)胞間隙中分布的偽彩色圖像。由圖6可知，相比于纖維素成分，果膠在蘋果組織中的含量較低，在新鮮蘋果細(xì)胞中，果膠呈不均勻連續(xù)分布的狀態(tài)，其中，中度和嚴(yán)重腐敗的蘋果組織，果膠分布狀態(tài)較分散，原因是在腐敗菌侵染過(guò)程中，分泌胞外果膠酶，水解細(xì)胞中的果膠成分。

圖6 蘋果細(xì)胞間隙中果膠成分分布圖Fig.6 Distribution of pectin components in apple intercellular space

2.5 不同侵染階段拉曼光譜聚類分析

由于預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)具有較高的維度，存在冗余的光譜信息，給建模帶來(lái)了復(fù)雜性，因此需要對(duì)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)在進(jìn)行降維分析，減少無(wú)關(guān)信息對(duì)模型的干擾，提高模型的判別準(zhǔn)確度。研究采用PCA對(duì)120 個(gè)拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，圖7顯示了4 個(gè)腐敗程度的樣本（新鮮、輕微腐敗、中度腐敗和嚴(yán)重腐?。┰诶塾?jì)貢獻(xiàn)率達(dá)97.58%的PC1、PC2和PC空間分布情況，從散點(diǎn)圖可以看出，4 種腐敗程度的拉曼光譜具有明顯的聚類趨勢(shì)，其中新鮮的蘋果拉曼光譜與其他3 種腐敗程度的蘋果拉曼光譜存在較少的交叉，腐敗程度越高，其與新鮮蘋果組織拉曼光譜的距離越遠(yuǎn)，越容易被分開，而3 種腐敗的蘋果拉曼光譜之間均存在交叉現(xiàn)象。

圖7 基于前3 個(gè)PC的不同侵染階段蘋果細(xì)胞樣本的得分散點(diǎn)圖Fig.7 Scatter plot of first three principal components for apple cell samples at different infection stages

2.6 不同侵染階段判別模型的建立

為有效識(shí)別不同侵染階段的蘋果腐敗程度，在PCA的基礎(chǔ)上，采用LDA算法建立判別模型。首先分別獲取了5 種蘋果優(yōu)勢(shì)腐敗菌在4 種不同侵染階段的120 個(gè)拉曼光譜數(shù)據(jù)，在建立LDA判別模型的過(guò)程中，120 個(gè)樣本數(shù)據(jù)被分為校正集（80）和預(yù)測(cè)集（40）。之后選取累計(jì)貢獻(xiàn)率超過(guò)95%的前15 個(gè)PC作為輸入變量，并對(duì)PC的數(shù)量進(jìn)行優(yōu)化。圖8顯示了LDA判別模型的PC數(shù)優(yōu)化過(guò)程，可以看出，當(dāng)選擇前2 個(gè)PC時(shí)，模型的判別精確度較差，隨著輸入PC數(shù)的增加，模型的性能得到了極大的提高，當(dāng)PC數(shù)超過(guò)10以后，模型的判別效果不再發(fā)生明顯變化。表2統(tǒng)計(jì)了蘋果5 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的最佳判別結(jié)果，對(duì)于蘋果優(yōu)勢(shì)腐敗菌黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、皮落青霉、擴(kuò)展青霉和鏈格孢，當(dāng)分別選取10、6、12、15 個(gè)和10 個(gè)PC時(shí)，判別效果最佳，預(yù)測(cè)集判別率分別為97.92%、100%、95.87%、100%、97.92%，這表明采用LDA模式識(shí)別方法分析蘋果細(xì)胞成分變化的拉曼光譜數(shù)據(jù)，可以有效的對(duì)腐敗菌侵染蘋果進(jìn)行早期診斷。

圖8 蘋果5 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌建立LDA模型的PC數(shù)優(yōu)化黑曲霉（a）、產(chǎn)黃青霉（b）、皮落青霉（c）、擴(kuò)展青霉（d）、鏈格孢（e）Fig.8 Optimization of number of principal components in LDA model for five dominant apple spoilage fungi Aspergillus niger (a), Penicillium chrysogenum (b), P.epidermidis (c), P.expansum (d) and Alternaria (e)

表2 蘋果5 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌不同侵染階段的LDA判別模型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical results of LDA discriminant model for different infection stages of five dominant spoilage fungi in apples

3 結(jié) 論

采用共聚焦顯微拉曼光譜成像系統(tǒng)獲取5 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌侵染蘋果不同階段的組織拉曼光譜圖像，進(jìn)行圖譜解析和物質(zhì)歸屬，發(fā)現(xiàn)蘋果組織細(xì)胞中的纖維素、果膠、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等成分是拉曼光譜響應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。在不同侵染階段，這些成分的特征拉曼光譜峰平均強(qiáng)度發(fā)生了明顯的變化，隨著腐敗菌侵染程度的加劇，其強(qiáng)度逐漸下降。

針對(duì)腐敗菌侵染過(guò)程中蘋果細(xì)胞成分進(jìn)行拉曼化學(xué)成像分析，通過(guò)拉曼化學(xué)成像成功的構(gòu)建了多糖、纖維素和果膠成分在蘋果細(xì)胞壁中分布的偽彩色圖像。隨著腐敗菌侵染程度的加劇，多糖的含量呈下降趨勢(shì)；中度腐敗的纖維素相對(duì)于新鮮的蘋果組織有所減少，但嚴(yán)重腐敗的部分區(qū)域纖維素高于新鮮的蘋果組織，可能是在腐敗菌侵染末期，腐敗菌的菌絲進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)部，依靠營(yíng)養(yǎng)成分大量繁殖；相比于纖維素成分，中度和嚴(yán)重腐敗的蘋果組織中的果膠分布狀態(tài)較分散，主要原因是在腐敗菌侵染過(guò)程中分泌胞外果膠酶，水解細(xì)胞中的果膠成分。

采用PCA結(jié)合LDA算法建立了5 種腐敗菌侵染蘋果不同階段的判別模型，判別準(zhǔn)確率均達(dá)95%以上，其中產(chǎn)黃青霉和擴(kuò)展青霉的判別率為100%，結(jié)果表明利用蘋果組織成分變化的拉曼光譜進(jìn)行腐敗菌侵染程度的早期判別可行。

本研究以蘋果為對(duì)象，采用共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)對(duì)蘋果優(yōu)勢(shì)腐敗菌侵染蘋果的過(guò)程進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，建立了蘋果腐敗程度檢測(cè)方法，并從微觀角度對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌侵染過(guò)程中蘋果組織細(xì)胞成分及結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了可視化檢測(cè)，研究結(jié)果表明，共聚焦顯微拉曼光譜成像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)腐敗菌侵染蘋果的早期診斷和過(guò)程解析。