萬文，楊天杰，樊曉騰，2，鄭海平，王世梅，韋中，徐陽春*，沈其榮

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心/資源節(jié)約型肥料教育部工程研究中心/國家有機(jī)類肥料工程技術(shù)研究中心，南京 210095；2.河南師范大學(xué)，河南 新鄉(xiāng) 453000）

我國每年產(chǎn)生各類作物秸稈近9億t，而秸稈中含有豐富的有機(jī)物及氮、磷、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的潛在利用價(jià)值。因此，對(duì)秸稈進(jìn)行高效資源化利用成為我國發(fā)展綠色循環(huán)農(nóng)業(yè)中亟待解決的問題。秸稈還田是其資源化利用的主要途徑之一，該方法有利于土壤腐殖質(zhì)的更新和土壤有機(jī)質(zhì)的積累，起到培肥地力、促進(jìn)作物生長的作用。但秸稈直接還田的降解效率低、耗時(shí)長，常需要添加秸稈降解菌以提高秸稈的降解效率。由于秸稈表面存在蠟質(zhì)層，秸稈降解菌難以接觸和附著在秸稈上，無法產(chǎn)生大量纖維素類酶；蠟質(zhì)層也阻礙了纖維素類酶與秸稈的接觸，造成秸稈降解菌效率降低或施用效果不穩(wěn)定。近年來，許多研究通過添加秸稈降解助劑（如表面活性劑）來提高秸稈降解菌產(chǎn)酶量，從而提高秸稈降解效率。

表面活性劑是指一類具有固定的親水親油基團(tuán)、在溶液表面能定向排列，并能使表面張力顯著下降的物質(zhì)。與陰離子、陽離子表面活性劑相比，非離子表面活性劑穩(wěn)定性更高，乳化、潤濕和洗滌的能力更強(qiáng)。周梅芳發(fā)現(xiàn)表面活性劑能夠提高簡青霉產(chǎn)漆酶的能力。孟杰等的研究表明表面活性劑能在一定程度上激發(fā)纖維素分解菌的活性，可改善堆肥環(huán)境，促進(jìn)微生物生長和提高纖維素類酶活性。這些研究均表明，添加表面活性劑能夠促進(jìn)秸稈降解菌的產(chǎn)酶能力，從而提升秸稈的降解效率，但尚未有研究比較不同種類的表面活性劑對(duì)秸稈降解菌降解秸稈效果的影響，表面活性劑的濃度是否會(huì)影響纖維素類酶活性也有待進(jìn)一步研究。

因此，為了提高降解菌秸稈降解的效率，本研究以玉米秸稈為研究對(duì)象，篩選出一株降解秸稈能力較強(qiáng)的菌株——草酸青霉Z7-6，研究4種不同非離子表面活性劑對(duì)其降解玉米秸稈的影響。首先利用液體發(fā)酵方法，考察不同濃度、不同種類的表面活性劑對(duì)秸稈降解菌利用玉米秸稈及產(chǎn)纖維素類酶的影響，篩選出表面活性劑的最佳濃度；再利用固體發(fā)酵體系進(jìn)行效果驗(yàn)證，最終獲得配合高效玉米秸稈降解菌的最佳表面活性劑種類及濃度。該研究可為表面活性劑作為降解秸稈助劑提供理論依據(jù)，并為提高秸稈降解效率提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣

供試土壤采自江蘇省金壇區(qū)朱林鎮(zhèn)秸稈直接還田地塊，該地塊為稻麥輪作，稻麥秸稈均全量還田。

1.1.2 玉米秸稈

秸稈采自江蘇省宜興市紫云山生態(tài)園。用清水將玉米秸稈表面塵土洗凈并風(fēng)干，除去葉片、葉鞘和根部后，切成1～3 cm的小段，65℃烘干至恒質(zhì)量備用。

1.1.3 表面活性劑

吐溫80（Tween 80，TW）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，TR）、3-[甲氧基聚（乙氧基）]丙基-甲基-雙（三甲基硅氧基）硅烷（MT）購自國藥化學(xué)集團(tuán)試劑公司，聚醚硅氧烷（PP）購自江蘇龍燈化學(xué)集團(tuán)公司。

1.2 供試培養(yǎng)基

本研究主要采用以下4種培養(yǎng)基進(jìn)行降解菌的篩選和活性檢測(cè)：無機(jī)鹽培養(yǎng)基用于秸稈降解菌的初篩；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato dextrose agar，PDA）用于真菌的純化培養(yǎng)；產(chǎn)酶培養(yǎng)基和羧甲基纖維素（Carboxymethyl cellulose，CMC）-剛果紅培養(yǎng)基用于秸稈降解菌酶活性的檢測(cè)。其他培養(yǎng)基配方為：秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加1.5 g玉米秸稈段；秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)基，每100 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加25.0 g玉米秸稈段，秸稈達(dá)到手握成團(tuán)、落地即散的狀態(tài)。

以上培養(yǎng)基均經(jīng)過115℃高壓滅菌30 min后備用。

1.3 秸稈降解菌的篩選

秸稈降解菌初篩：稱取1.0 g秸稈樣品至裝有90 mL無菌水的三角瓶中，于170 r·min、30℃下振蕩30 min后，靜置30 min。吸取上清液稀釋后涂布于含有10.0 g玉米秸稈粉的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)3～5 d，直至出現(xiàn)單菌落。挑取在無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上生長旺盛的真菌菌絲，轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基，連續(xù)劃線培養(yǎng)后得到純化的菌株，與40%甘油等體積混合并保存于-80℃冰箱。將初篩獲得的6個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30℃、170 r·min振蕩培養(yǎng)12 h，用無菌水調(diào)整各菌株孢子濃度至10CFU·mL，取10 μL菌液接種于CMC-剛果紅固體平板上，置于30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)3 d，測(cè)定菌落直徑（）和透明圈直徑（），計(jì)算/值，該比值越大表明菌株水解CMC的能力越強(qiáng)。每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)。

秸稈降解菌的復(fù)篩：將初篩獲得的菌株接種至含50 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃靜置培養(yǎng)7 d至其表面產(chǎn)生大量孢子。加入30 mL無菌水后在搖床上振蕩30 min，用無菌紗布過濾培養(yǎng)物后，加入無菌水調(diào)節(jié)孢子濃度為10CFU·mL，即得孢子接種液。按1%（∶）接種量將各菌株孢子液接種至秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、170 r·min下振蕩培養(yǎng)7 d。每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。將降解后的秸稈殘?jiān)诰W(wǎng)孔為0.1 mm的尼龍網(wǎng)袋內(nèi)用大量清水沖洗，除去秸稈上附著的菌絲及其他可溶物，剩余秸稈殘?jiān)?5℃下烘干至恒質(zhì)量，稱量秸稈殘留物干質(zhì)量，計(jì)算秸稈相對(duì)降解率（Relative degradation rate，）：

式中：為對(duì)照組秸稈剩余物干質(zhì)量，g；為處理組秸稈剩余物干質(zhì)量，g。

秸稈降解菌株的鑒定：從平板上刮取真菌菌絲，加入液氮研磨，以加速細(xì)胞壁破碎。采用OMEGA真菌基因組提取試劑盒提取供試菌株的總DNA。用ITS引物對(duì)菌株的ITS基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物分別為ITS1（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR反應(yīng)體系（50 μL）如下：DNA模板1 μL，dNTP（2.5 mmol·L）4 μL，引物（1 mmol·L）各1 μL，10×Loading Buffer 5 μL，MgCl（25 mmol·L）3 μL，Taq酶（5 U·μL）0.5μL，ddHO 34.5μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI（https：//ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性大于97%的序列在MEGA 7.0軟件中分析菌株同源性，采用鄰近法（Neighbor-joining method）構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.4 添加表面活性劑試驗(yàn)

4種表面活性劑TW、TR、MT和PP分別設(shè)置0.1%（∶）和0.5%（∶）兩個(gè)濃度，以不添加表面活性劑為對(duì)照，共設(shè)置9個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。通過液體發(fā)酵篩選表面活性劑的最佳濃度，考察不同表面活性劑在不同濃度下對(duì)秸稈降解菌降解玉米秸稈的效果，最后采用固體發(fā)酵進(jìn)行驗(yàn)證。

添加表面活性劑的秸稈液體發(fā)酵試驗(yàn)：參照1.3中的方法制備濃度為10CFU·mL的孢子接種液。按1%（∶）接種量將降解菌孢子懸液接種于含有不同濃度表面活性劑的秸稈液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于30℃搖床中170 r·min振蕩培養(yǎng)7 d。參照1.3中的方法測(cè)定秸稈相對(duì)降解率。取發(fā)酵液經(jīng)10 000 r·min離心10 min后取上清液，即為粗酶液。用DNS法測(cè)定粗酶液的濾紙酶（FPA）、羧甲基纖維素酶（CMCase）和木聚糖酶（Xylanase）活性，將1 min內(nèi)水解生成1μmol還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位（U）。

添加表面活性劑的秸稈固體發(fā)酵試驗(yàn)：參照1.3中的方法制備濃度為10CFU·mL的孢子接種液。按1%（∶）接種量將降解菌孢子懸液接種于含有不同表面活性劑的秸稈固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制固體培養(yǎng)基的含水量為75%，在30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)30 d后取樣測(cè)定秸稈相對(duì)降解率和濾紙酶、羧甲基纖維素酶、木聚糖酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用R 4.0.2版本（https：//www.r-project.org）。采用agricolae包進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，通過ggplot2包進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化。數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析（ANOVA），利用Tukey HSD檢驗(yàn)法檢驗(yàn)處理間的差異顯著性（＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈降解菌株Z7-6的篩選及鑒定

采用以玉米秸稈粉為唯一碳源的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，從秸稈直接還田的土壤樣品中分離純化得玉米秸稈降解菌共6株，在剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)透明降解圈的效果如表1和圖1a所示。結(jié)果表明，菌株Z7-6在CMC-剛果紅平板上的脫色效果更為明顯，相對(duì)降解率達(dá)40.58%，顯著高于其他5個(gè)菌株（=129.3，＜0.001），其/值顯著高于其他菌株（=13 988，＜0.001）。對(duì)菌株Z7-6進(jìn)行菌種鑒定，ITS分析結(jié)果表明其為草酸青霉（）（圖1b）。

圖1 秸稈降解菌對(duì)玉米秸稈的降解效果以及菌株鑒定結(jié)果Figure 1 Degradation effects of straw degrading microbes and strain identification

表1 秸稈降解菌的降解圈（D）與菌落直徑（d）Table 1 The degradation circle（D）and colony diameter（d）of straw degrading microbes

2.2 表面活性劑對(duì)草酸青霉Z7-6液體發(fā)酵的影響

0.1 %濃度的表面活性劑處理下的秸稈相對(duì)降解率高于0.5%濃度，除TW處理外，其他3種表面活性劑 均 達(dá) 到顯 著 差異（MT：=103.8，＜0.001；PP：=105.9，＜0.001；TR：=87.4，＜0.01，圖2a）。不同表面活性劑處理下，0.1%TR處理的秸稈相對(duì)降解率最高，達(dá)61.36%，顯著高于不加表面活性劑的對(duì)照處理（=66.63，＜0.001），較其提高了60%，但與0.1%TW相比差異不顯著（＞0.05）。以上結(jié)果表明，較低濃度（0.1%）的表面活性劑提升草酸青霉Z7-6降解秸稈的效果更佳，其中0.1%TR與0.1%TW處理的效果最好。

進(jìn)一步檢測(cè)各處理對(duì)草酸青霉Z7-6分泌纖維素類酶活的影響，結(jié)果表明，各表面活性劑對(duì)濾紙酶、羧甲基纖維素酶、木聚糖酶活性的影響基本一致，即0.1%濃度的表面活性劑處理下均顯著高于0.5%濃度處理（＜0.001，圖2b～圖2d）。所有處理中，0.1%TR處理的濾紙酶和CMC酶活性均最高，濾紙酶活性為42.01 U·gds，CMC酶活性為174.30 U·gds，均顯著高于其他處理（濾紙酶：=12 876，＜0.001；CMC酶：F=4×10，＜0.001，圖2b、圖2c）。0.1%TW處理下木聚糖酶活性最高，但與0.1%TR處理無顯著差異。與對(duì)照相比，0.1%TR處理的濾紙酶、CMC酶和木聚糖酶活性分別提高了213.74%、155.27%和115.24%。

圖2 液體發(fā)酵條件下表面活性劑對(duì)草酸青霉Z7-6降解秸稈及產(chǎn)酶能力的影響Figure 2 Effects of surfactant on strain Z7-6 degradation and enzyme activities

以上結(jié)果表明，較低濃度的表面活性劑可提高濾紙酶、CMC酶和木聚糖酶的活性，其中0.1%TR處理效果最佳；而較高濃度的表面活性劑可降低部分纖維素類酶的活性，如0.5%MT和0.5%PP抑制了CMC酶活性和木聚糖酶活性。

為了分析液體發(fā)酵時(shí)表面活性劑種類、濃度以及3種產(chǎn)纖維素類酶活性對(duì)草酸青霉Z7-6相對(duì)降解率的交互作用，對(duì)其進(jìn)行了廣義線性分析。由表2可知，表面活性劑的種類和濃度對(duì)草酸青霉Z7-6的秸稈相對(duì)降解率均有顯著影響（＜0.001），且表面活性劑濃度與秸稈相對(duì)降解率間存在顯著的負(fù)相關(guān)（＜0.001），表明在本研究中表面活性劑濃度越高，秸稈相對(duì)降解率越低。但表面活性劑對(duì)菌株降解秸稈的影響是否存在濃度效應(yīng)，需增加表面活性劑濃度梯度進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 液體發(fā)酵條件下表面活性劑種類、濃度和酶活性的交互作用對(duì)秸稈相對(duì)降解率的影響Table 2 Interactive effects of type and concentration ofsurfactants and enzyme activity on relative degradation rate under liquid fermentation condition

3種產(chǎn)纖維素類酶活性與秸稈相對(duì)降解率的相關(guān)性結(jié)果表明，只有CMC酶活性與秸稈相對(duì)降解率呈顯著正相關(guān)關(guān)系（=0.028），表明CMC酶活性可顯著促進(jìn)草酸青霉Z7-6降解玉米秸稈的能力。但表面活性劑種類、濃度和3種產(chǎn)纖維素類酶對(duì)秸稈相對(duì)降解率均無交互作用（＞0.05），表明表面活性劑的種類和濃度并非通過線性關(guān)系影響產(chǎn)纖維素類酶活性，進(jìn)而影響秸稈降解能力。

2.3 表面活性劑對(duì)草酸青霉Z7-6固體發(fā)酵的影響

為了驗(yàn)證0.1%濃度的4種表面活性劑對(duì)草酸青霉Z7-6降解玉米秸稈的實(shí)際效果，開展模擬秸稈還田時(shí)添加菌劑的固體發(fā)酵試驗(yàn)。研究結(jié)果表明，0.1%TR處理下草酸青霉Z7-6對(duì)玉米秸稈的降解能力最強(qiáng)，達(dá)69.67%，0.1%TW處理次之，0.1%MT和PP的效果最差，但仍高于對(duì)照處理；0.1%TR處理的相對(duì)降解率顯著高于其他3種表面活性劑，與對(duì)照相比，該處理秸稈的相對(duì)降解率提高了41.87%（圖3a）。

0.1 %表面活性劑對(duì)3種纖維素類酶活性的影響相似（圖3b～圖3d）。0.1%TR處理下濾紙酶、CMC酶以及木聚糖酶活性最高，濾紙酶活性達(dá)3.51 U·gds，CMC酶活性達(dá)25.55 U·gds，木聚糖酶活性達(dá)1 429.00 U·gds；該處理的濾紙酶和木聚糖酶活性顯著高于0.1%TW處理（圖3b、圖3d）。與對(duì)照相比，0.1%TR處理的濾紙酶、CMC酶和木聚糖酶的活性分別提高了70.39%、45.33%和75.10%。

圖3 表面活性劑對(duì)草酸青霉Z7-6降解秸稈能力以及產(chǎn)酶活性的影響Figure 3 Effects of surfactants on straw degradation and enzyme activities ability of strain Z7-6

以上結(jié)果表明，0.1%濃度的4種表面活性劑均可提高草酸青霉Z7-6降解玉米秸稈的能力，其中0.1%TR效果最佳，對(duì)3種纖維素類酶的活性有顯著的促進(jìn)作用。

3 討論

秸稈還田是目前秸稈資源化利用最常用的方式之一，但由于還田秸稈總量巨大且多為就地還田，即使施用秸稈降解菌，也會(huì)因秸稈表面的蠟質(zhì)層阻礙菌株與秸稈的接觸而降低秸稈降解效率。研究發(fā)現(xiàn)將表面活性劑用作助劑可以加速秸稈的降解。木質(zhì)纖維素具有強(qiáng)疏水性，添加表面活性劑后，可改變其疏水特性，降低木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附，使秸稈更好地與降解菌或酶相結(jié)合。非離子表面活性劑預(yù)處理能增大纖維素酶的可利用表面，增加纖維素吸附酶的反應(yīng)位點(diǎn)，有效穩(wěn)定酶的性質(zhì)，提高秸稈的糖化率。表面活性劑還可增加細(xì)胞膜的通透性，加速蛋白質(zhì)類物質(zhì)（如酶類）的跨膜運(yùn)輸，增加胞外纖維素酶的濃度，進(jìn)而提高微生物降解秸稈的能力。本研究中，秸稈降解效果較好的處理，其纖維素酶活性更高，推測(cè)表面活性劑可能增加了草酸青霉Z7-6細(xì)胞的通透性，加大了秸稈對(duì)酶的吸附作用。后期可通過檢測(cè)微生物細(xì)胞內(nèi)外和秸稈表面的纖維素酶含量進(jìn)行驗(yàn)證。

目前，已有非離子表面活性劑對(duì)秸稈降解影響的相關(guān)研究，但尚未進(jìn)行不同種類非離子表面活性劑效果的比較。本研究發(fā)現(xiàn)，不同種類的非離子表面活性劑對(duì)草酸青霉Z7-6降解玉米秸稈的影響不同。Triton X-100處理的秸稈降解效果最佳，草酸青霉Z7-6產(chǎn)纖維素類酶活性也顯著增加；吐溫80處理次之。與吐溫系列的表面活性劑相比，Triton X-100親水基團(tuán)數(shù)更多，具有更高的臨界膠束濃度（Critical micelle concentration），親水性更強(qiáng)，可更好地與木質(zhì)素結(jié)合；其特殊的結(jié)構(gòu)可穩(wěn)定水解酶結(jié)構(gòu)，即使在低濃度下（0.02%）也能提升水解酶活性。多項(xiàng)研究表明，Triton X-100促進(jìn)里氏木霉溶脹素-木聚糖酶融合酶活性的能力優(yōu)于吐溫20；Triton X-100處理后對(duì)稻稈酶解的效果也優(yōu)于吐溫80。

本研究還發(fā)現(xiàn)表面活性劑濃度較低時(shí)（0.1%），玉米秸稈降解效果更好，纖維素類酶的活性也更高。尤其是較高濃度的MT和PP反而抑制了草酸青霉Z7-6的部分纖維素類酶活性。這可能是由于發(fā)生了產(chǎn)物抑制作用，即表面活性劑濃度增高，降解菌分泌纖維素類酶增多，產(chǎn)生更多的秸稈降解物，反而抑制了相關(guān)酶的活性。也有研究表明，高濃度的表面活性劑會(huì)顯著抑制外切酶的活性，破壞酶的活性構(gòu)象而使其喪失活性；同時(shí)酶解體系中形成膠束，降低了纖維素酶的可及度，抑制了總酶活性。此外，表面活性劑含量過高可能會(huì)影響菌體的正常代謝，從而影響菌株的產(chǎn)酶功能，導(dǎo)致酶活性降低。因此，在后期研究中可嘗試更低濃度的表面活性劑，確定每種表面活性劑的最佳使用濃度，節(jié)省成本的同時(shí)也可提高秸稈降解效率。

近年來，在秸稈降解領(lǐng)域?qū)Ρ砻婊钚詣┑难芯恐饾u增多，使用較多的主要是生物表面活性劑和非離子表面活性劑。雖然生物表面活性劑對(duì)秸稈降解的促進(jìn)效果十分顯著，但其制得率較低，難以規(guī)?；a(chǎn)，且在應(yīng)用過程中受環(huán)境影響較大，穩(wěn)定性較低。本研究中所用的表面活性劑為化學(xué)純品，易配制、效果穩(wěn)定，因此，非離子表面活性劑可作為秸稈降解預(yù)處理較為合理、高效的方式之一。本研究表明0.1%Triton X-100對(duì)草酸青霉Z7-6秸稈降解的提升作用最強(qiáng)，其對(duì)纖維素類酶活性的促進(jìn)效果最佳，可作為潛在的秸稈降解表面活性劑。

4 結(jié)論

本研究篩選出一株對(duì)玉米秸稈降解能力較好的菌株——草酸青霉Z7-6，分別在液體和固體發(fā)酵條件下，通過比較4種表面活性劑在不同濃度下對(duì)草酸青霉Z7-6降解秸稈的影響發(fā)現(xiàn)，0.1% Triton X-100提升草酸青霉Z7-6降解秸稈的效果最佳，同時(shí)使濾紙酶、羧甲基纖維素酶、木聚糖酶的活性得到提升。