金海麗 陳嬉 羅華榮 徐鋮 孫亞萌 林天真 甘梅富

目前研究發(fā)現(xiàn)，Notch 信號(hào)通路在胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中被激活，與癌細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲、抗凋亡有關(guān)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[1～3]。Notch信號(hào)通路由Notch受體、配體等組成，目前已知包括Notch1～4 在內(nèi)的4 個(gè)Notch 同源體[4]；相關(guān)研究顯示，Notch1、Notch3 高表達(dá)與惡性腫瘤患者預(yù)后明顯相關(guān)[5，6]。目前關(guān)于Notch3 對(duì)三陰性乳腺癌作用的研究仍較為少見，為此本次研究在體外培養(yǎng)三陰性乳腺癌細(xì)胞株BT20，探討Notch3調(diào)節(jié)BT20細(xì)胞增殖的機(jī)制，旨在為三陰性乳腺癌的分子靶向治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 乳腺癌細(xì)胞株BT20 由上海研域生物科技有限公司生產(chǎn)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基由上海廣銳生物科技有限公司生產(chǎn)；脂質(zhì)體2 000 轉(zhuǎn)染試劑由北京藍(lán)博斯特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；Trizol 試劑、RIPA 裂解液由上海素爾生物科技有限公司生產(chǎn)；鼠抗人NF-κB 單克隆抗體，鼠抗人GAPDH 多克隆抗體，HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠由北京華達(dá)杰瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2021 年1 月，將BT20 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)，按1×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞融合度超過50%時(shí)使用脂質(zhì)體2 000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、Notch3 siRNA組。為防止脂質(zhì)體2 000 對(duì)BT20 細(xì)胞的毒性作用，轉(zhuǎn)染6 h 后更換為DMEM 完全培養(yǎng)基。小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）由上?；偕锟萍加邢薰竟驹O(shè)計(jì)合成，Notch3 siRNA 組正義序列：5′-TTAACGUCAACA AAGGACCUG-3′，反義序列：5′-TTCAGGUCCUUUGU UGACGUU-3′；陰性對(duì)照組正義序列：上游5′-TTUGCACUGUGCAAGCCUCUU -3′，反義序列：5′ -TTAAGA GGGCUUGCACAGUCA-3′；空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)不做任何處理。

1.2.2 細(xì)胞增殖 采用四唑鹽比色法（methylthiazolyl method，MTT）法檢測(cè)BT20 細(xì)胞增殖情況，取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按1×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，觀察細(xì)胞融合度超過50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。加入MTT 20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μl/孔，勻速振蕩10 min，上酶標(biāo)儀讀取490 nm 處吸光度值，每組各5 個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 將饑餓處理后的各組細(xì)胞消化、重懸計(jì)數(shù)后，向上室加入500 μl無血清的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml，下室中加入500 μl 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定30 min，洗滌后使用0.1%結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡下采集圖像，隨機(jī)選取5 個(gè)視野下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。經(jīng)基底膠與不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基混合后，向上室加入100 μl，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/ml，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)，觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè) Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Notch3、CyclinD1、BCL-2、BCL-xl、GAPDH 引物由上海索寶生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃1 min，95 ℃30 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)，延伸72 ℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物行2% 瓊脂糖凝膠電泳，計(jì)算Notch3、CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 Notch3、CyclinD1、BCL-2、BCL-xl、GAPDH引物序列

1.2.5 Western blot 檢測(cè) RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 蛋白定量，取40 μg 蛋白行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入鼠抗人NF-κB 單克隆抗體（1：200 稀釋），鼠抗人GAPDH 多克隆抗體（1∶1000稀釋），4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶2000 稀釋），室溫靜置2 h，ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照計(jì)算各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch3 siRNA 轉(zhuǎn)染效果 Notch3 siRNA 轉(zhuǎn)染48 h后，Notch3 siRNA 組BT20細(xì)胞中Notch3 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.24±0.08，明顯低于陰性對(duì)照組的表達(dá)量（1.37±0.24），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.37，P＜0.05）。

2.2 三組細(xì)胞增殖水平比較見表2

表2 三組細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)增殖水平比較

由表2 可見，培養(yǎng)第1 天時(shí)，三組細(xì)胞增殖水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.31，P＞0.05）；培養(yǎng)第2 天、第3 天、第4 天、第5 天時(shí)，三組細(xì)胞增殖水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=6.87、11.04、15.98、26.39，P均＜0.05）。培養(yǎng)第2 天、第3 天、第4 天、第5 天時(shí)，Notch3 siRNA 組細(xì)胞增殖水平明顯低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=3.15、4.03、2.94、3.26、4.01、3.50、2.97、3.11，P均＜0.05）；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.18、0.37、0.41、0.62，P均＞0.05）。組內(nèi)比較，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延伸，三組細(xì)胞增殖水平均逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=5.94、7.65、9.76，P均＜0.05）。

2.3 三組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較見表3

表3 三組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較/個(gè)

由表3 可見，三組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=12.79、14.07，P均＜0.05）。兩兩比較，Notch3 siRNA 組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=5.32、6.02、4.97、5.07，P均＜0.05）；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.39、0.57，P均＞0.05）。

2.4 三組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較Notch3 siRNA 組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.83±0.27，明顯低于空白對(duì)照組（4.71±0.63）和陰性對(duì)照組（4.65±0.58），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=19.69、18.07，P均＜0.05）；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.29，P＞0.05）。

2.5 Notch3對(duì)下游基因表達(dá)的影響見表4

表4 三組CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

由表4 可見，三組下游基因CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA 的相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=11.26、16.94、18.17，P均＜0.05）。兩兩比較，Notch3 siRNA 組下游基因CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=4.15、3.02、3.12、2.98、3.56、3.16，P均＜0.05）；空白對(duì)照組下游基因CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA 相對(duì)表達(dá)量與陰性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=0.13、0.19、0.33，P均＞0.05）。

3 討論

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全部惡性腫瘤的8%～12%[7]。我國(guó)雖然是乳腺癌發(fā)病率較低的國(guó)家，但近年來其發(fā)病率呈快速增加，有年輕化趨勢(shì)[8]。乳腺癌是一類特異質(zhì)明顯的惡性腫瘤，在免疫表型、形態(tài)、治療反應(yīng)等方面均存在較大差異[9]。三陰性乳腺癌組織分化程度多較差，復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高[10]；由于雌激素受體、孕激素、原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2 均為陰性，不適用于內(nèi)分泌藥物、注射用曲妥珠單抗等治療[11]，化療仍是三陰性乳腺癌的主要輔助治療手段，但患者對(duì)化療藥物的敏感性存在較大的個(gè)體差異[12]，分子靶向治療是改善三陰性乳腺癌患者預(yù)后的研究新方向，但目前相關(guān)研究報(bào)道較為少見。

本次研究使用脂質(zhì)體2 000 向BT20 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染Notch3 siRNA 后，Notch3 mRNA 表達(dá)水平明顯降低，且培養(yǎng)第2～5 天時(shí)，Notch3 siRNA 組細(xì)胞增殖水平明顯低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（P均＜0.05），提示siRNA 介導(dǎo)的Notch3 能夠明顯下調(diào)BT20細(xì)胞中Notch3表達(dá)水平，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖。癌細(xì)胞的遷移和侵襲是患者不良預(yù)后的主要原因[13]。相關(guān)研究顯示，Notch3 在卵巢上皮性癌變、大腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤組織中均存在高表達(dá)，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與癌細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲等過程明顯相關(guān)[14]；但關(guān)于Notch3對(duì)三陰性乳腺癌的影響仍鮮有研究報(bào)道。本次研究顯示，Notch3 siRNA組遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P均＜0.05），提示下調(diào)Notch3 表達(dá)可有效降低BT20 細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

Notch3 信號(hào)通路與NF-κB 均能夠介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等過程[15]。有研究顯示，在轉(zhuǎn)染Notch3反義寡核苷酸的大鼠體內(nèi)，NF-κB表達(dá)水平明顯下降；重新導(dǎo)入活化的Notch3基因片段后，NF-κB表達(dá)水平也逐漸恢復(fù)正常[16]。本次研究結(jié)果顯示，Notch3 siRNA 組細(xì)胞核內(nèi)NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（P均＜0.05）；提示Notch3 表達(dá)下調(diào)可有效降低BT20 細(xì)胞的NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，NF-κB 可能作為Notch3 的下游靶基因參與Notch3 介導(dǎo)的生物學(xué)功能。同時(shí)，NF-κB 活化后在細(xì)胞核中與相應(yīng)的靶基因特異性結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性，調(diào)節(jié)CyclinD1、BCL-2、BCL-xl 等下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。其中CyclinD1 為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，與雌激素受體陰性的乳腺癌患者預(yù)后有關(guān)[17]；BCL-2、BCL-xl 屬于BCL 家族成員，BCL-2 具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，抑制凋亡的活性，BCL-xl 在癌細(xì)胞化療耐藥性發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[18]。本次研究顯示，Notch3 siRNA組下游基因CyclinD1、BCL-2、BCL-xl mRNA表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P均＜0.05），提示Notch3 表達(dá)下調(diào)可能通過降低CyclinD1、BCL-2、BCL-xl 表達(dá)來抑制BT20細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，Notch3 siRNA 下調(diào)Notch3 表達(dá)能夠有效抑制BT20 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與Notch3 表達(dá)下調(diào)降低了NF-κB 蛋白及CyclinD1、BCL-2、BCL-xl基因表達(dá)有關(guān)。