劉偉悅

北京張一元金橋茶葉有限公司（北京 101102）

我國是茶樹原產(chǎn)地，茶葉生產(chǎn)歷史悠久。茶葉作為一種健康飲品，深受全世界消費(fèi)者的喜愛。茶葉中不僅富含茶多酚及兒茶素，還含有鉀、鈣、鎂、錳等多種礦物質(zhì)。茶葉也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和出口農(nóng)產(chǎn)品。作為我國茶葉的重要進(jìn)口國，歐洲和日本制定了極為嚴(yán)苛的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。歐盟標(biāo)準(zhǔn)和日本肯定列表中關(guān)于茶葉的農(nóng)殘項目分別為480種[1-2]和276種，農(nóng)殘限量在0.01～30.0 mg/kg之間，國際食品法典委員會農(nóng)殘限量（CAC）在0.01～50.0 mg/kg之間，對于沒有明確規(guī)定農(nóng)藥殘留限量的農(nóng)藥一律采用不得大于0.01 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國最新版國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[3]中涉及茶葉中農(nóng)藥最大殘留限量已經(jīng)達(dá)到106種，農(nóng)藥殘留限量在0.01～50.0 mg/kg之間，對未涉及農(nóng)藥殘留限量的農(nóng)藥沒有具體規(guī)定。

為了提高茶葉產(chǎn)量，農(nóng)藥在茶葉病蟲防治中得到了廣泛使用，敵敵畏、樂果和喹硫磷均為有機(jī)磷類農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于茶葉中的殺蟲、殺螨劑，由此帶來的農(nóng)藥殘留可能危害消費(fèi)者健康。隨著生活水平日益提高，人們對茶葉的質(zhì)量和安全性都有了更高的要求[4]。農(nóng)藥殘留分析作為一項對復(fù)雜混合物中痕量組分的分析技術(shù)。目前，國內(nèi)外農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[5-6]。其中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法利用被測樣品離子質(zhì)荷比，定性定量更加準(zhǔn)確，檢測靈敏度更高，對于茶葉類復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留檢測有其獨特的技術(shù)優(yōu)勢。

研究建立了適用于檢測茶葉中農(nóng)藥殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法簡單快速、分離度好、重現(xiàn)性好、精密度高，可滿足同時檢測茶葉中敵敵畏、樂果和喹硫磷3種農(nóng)藥殘留的要求[7-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丙酮中敵敵畏、樂果、喹硫磷質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）；乙腈、丙酮、甲醇、甲苯、甲酸[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；純凈水（杭州娃哈哈有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，北京化工廠），經(jīng)550 ℃灼燒4 h，儲存于干燥器中，冷卻后備用；Cleanert TPT固相萃取柱（Agela公司）；0.22 μm尼龍微孔過濾膜（津騰公司）。

UPLC/TSQ Quantum U1tra超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀[配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur工作站軟件，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Hypersil GOLD C8色譜柱[100 mm×2.1 mm，1.9 μm，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；QL-901渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；XHF-DY高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KH-100DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；SE202F電子分析天平（奧豪斯）；TDL-40B臺式低速離心機(jī)（飛鴿牌）；HY-5A型回旋式振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 待測液制備

稱取粉碎均勻的試樣5 g（精確至0.01 g），用20.0 mL的乙腈振蕩提取1 h，在4 000 r/min下離心5 min。取4 mL上清液，過Cleanert TPT固相萃取柱（萃取柱中加入約2 cm高無水硫酸鈉，用10 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脫液預(yù)洗，棄去流出液）凈化，用20 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脫，收集洗脫液，40 ℃條件下水浴，旋蒸至近干，乙腈+水（3+2，V/V）定容1 mL，過0.22 μm微孔過濾膜，混勻，待UPLC-MS/MS測定，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線定量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：將1 000 μg/mL丙酮中敵敵畏、樂果、喹硫磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于-20 ℃保存。分別吸取樂果和喹硫磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL加入10.0 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度，得到1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液A，同樣方法得到1 μg/mL的敵敵畏、樂果、喹硫磷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液B，于-20 ℃保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：同1.2.1小節(jié)待測液制備的方法，用未檢出待測農(nóng)藥的綠茶樣品制作基質(zhì)空白溶液，分取16 mL上清液過柱，20 mL乙腈+甲苯（3+1）洗脫，用乙腈+水（3+2）定容至8 mL，過0.22 μm濾膜，所得溶液為基質(zhì)空白溶液。準(zhǔn)確配制基質(zhì)空白中3種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為10，20，50，100，200，400和600 μg/L進(jìn)行測定。

1.2.3 液相色譜條件

Hypersil GOLD C8色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。流動相組成：流動相A為0.1%甲酸，流動相B為乙腈。流動相梯度洗脫程序見表1；色譜柱溫度40oC，進(jìn)樣量為5 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件

電離方式ESI+；噴霧電壓：3 200 V；離子傳輸管溫度：320 ℃；蒸發(fā)溫度300 ℃；鞘氣：氮氣，流量630 L/h；輔助氣：氮氣，流量180 L/h；碰撞氣：氬氣，碰撞氣壓力1.5 mTorr；氮氣和氬氣純度均大于99.999%；選擇離子多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描（SRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在優(yōu)化好的色譜條件下，采用全掃描Full Scan方式對單一標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μg/mL進(jìn)樣，獲得化合物的特征離子，選擇離子豐度最高的[M+H]+m/z作為母離子；然后進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，找到特征離子及其最佳CE。試驗選擇每種化合物豐度較高的兩個離子分別作為定量離子和定性離子?；衔镉⑽拿Q、保留時間及質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

2.2 提取過程的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

在農(nóng)藥殘留提取的過程中，根據(jù)農(nóng)藥的極性、性質(zhì)等因素選擇合適的提取溶劑。在農(nóng)藥殘留檢測的過程中，常見的提取溶劑有乙腈、丙酮、甲醇、正己烷、石油醚等，研究以回收率為參考指標(biāo)，回收試驗添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為0.1 mg/kg，用乙腈、丙酮和甲醇3種有機(jī)溶劑作為提取溶劑分別做3平行試驗，回收率見圖1。

從圖1可以看出，甲醇作為提取劑時樂果和喹硫磷回收率極低，敵敵畏回收率為零。由于甲醇的溶解性較好，在提取的過程中，提取液比較渾濁，最后定容，待上機(jī)的溶液會分層，這可能是導(dǎo)致三種農(nóng)殘回收率都很低的原因。乙腈和丙酮提取的回收率比較接近，但是乙腈對于色素和油脂的提取能力不強(qiáng)，因此可以減小雜質(zhì)的干擾，提取的回收率整體更優(yōu)于丙酮，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

圖1 三種提取溶劑農(nóng)殘回收率對比（n=3）

2.2.2 提取方式的優(yōu)化

研究以回收率為參考指標(biāo)，回收試驗添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為0.1 mg/kg，用超聲、振蕩和均質(zhì)三種方式提取，分別做3組平行試驗，回收率見圖2。

圖2 三種提取方式農(nóng)殘回收率對比（n=3）

從圖2可以看出，超聲提取方式對樂果的回收率相對較低，均質(zhì)提取方式對喹硫磷的回收率相對較高，這可能是超聲和均質(zhì)提取方式使一部分干擾物被提取出來，增強(qiáng)了茶葉的基質(zhì)干擾。而通過振蕩提取的方式，三種農(nóng)藥的回收率表現(xiàn)良好。因此，試驗選擇振蕩提取。

2.2.3 洗脫液提體積的優(yōu)化

研究以回收率為參考指標(biāo)，回收試驗添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為0.1 mg/kg，用乙腈+甲苯（3+1，V/V）作洗脫液，Cleanert TPT固相萃取柱進(jìn)行凈化，洗脫液體積分別為10，15，20，25和30 mL，分別做3組平行試驗，回收率見圖3。

從圖3可以看出，喹硫磷的回收率受洗脫液體積影響較小。對于樂果和敵敵畏，隨著洗脫液體積的增加，其平均回收率總體呈上升趨勢；但超過20 mL之后，隨著洗脫液體積的增加，其回收率變化不明顯?；谔砑踊厥章室蠛驮囼灢僮鞯膶嶋H需求，選擇20 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）作為洗脫液。

圖3 洗脫液體積對農(nóng)殘回收率的影響（n=3）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

按上述方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以目標(biāo)組分的響應(yīng)面積（y）和對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度在10～600 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以10倍信噪比（S/N）計算方法的定量限[14-20]，茶葉中三種農(nóng)藥線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和限值見表3。

表3 茶葉中3種農(nóng)藥線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和限值

2.4 加標(biāo)回收和精密度

選擇空白樣品進(jìn)行加標(biāo)處理，處理方法同待測液的制備方法。按照所建立的方法處理、測定，加標(biāo)水平為0.01，0.02，0.1和0.4 mg/kg，每個加標(biāo)量重復(fù)6次，驗證方法的精密度?？瞻讟悠分?種農(nóng)藥加標(biāo)回收結(jié)果見表4。從表4中可以看出，3種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率在68.7%～114.9%之間，精密度為2.7%～10.8%。回收率和精密度均符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

表4 農(nóng)藥加標(biāo)回收率及精密度

2.5 5種茶葉樣品加標(biāo)回收率分析

對綠茶、紅茶、茉莉花茶、大紅袍和普洱生茶5種茶葉進(jìn)行3種農(nóng)殘加標(biāo)試驗。制備均勻樣品，采用此方法提取、凈化、上機(jī)測試，添加水平及回收率見表5。從表5中可以看出，5種茶葉中3種農(nóng)藥的回收率在66.6%～113.6%之間，表明此方法可用于茶葉中3種農(nóng)藥殘留的同時檢測。

表5 5種茶葉加標(biāo)回收

2.6 樣品測定

隨機(jī)抽取綠茶、紅茶、黑茶、烏龍茶、白茶、茉莉花茶等六種茶樣，共198批次，采用上述建立的檢測方法對樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，敵敵畏、樂果和喹硫磷均未被檢出。

3 結(jié)論

用乙腈振蕩提取1 h，Cleanert TPT固相萃取柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，建立了茶葉中同時測定樂果、敵敵畏和喹硫磷殘留量的測定方法，且方法線性相關(guān)性好、簡單快捷、靈敏度高，在回收率、定量限和精密度等方面均能滿足我國、歐盟和日本等國家對于茶葉中農(nóng)藥殘留量的檢測要求。研究一方面可為茶葉產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的完善提供數(shù)據(jù)，另一方面可為監(jiān)管部門對茶葉產(chǎn)品的風(fēng)險監(jiān)測提供方法參考。