閆 琰,張文文,董毅玲,覃志成

(1山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院腎內(nèi)科，太原 030012；2山西省腎臟病重點實驗室；*通訊作者,E-mail:taiyuantzc@163.com)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是由多種病因引起的腎功能快速下降,導(dǎo)致氮代謝(尿素和肌酐)和/或尿量減少而出現(xiàn)的臨床綜合征[1]，是慢性腎臟病(CKD)和終末期腎病(ESRD)發(fā)展的危險因素[2]。缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)是臨床上導(dǎo)致急性腎損傷的主要原因之一[3]，也是腎移植過程中不可避免的事件，可導(dǎo)致重要的腎實質(zhì)喪失[2]。而氧化應(yīng)激是缺血再灌注期間腎組織損傷的重要病理生理機制[4]。核因子紅細胞2相關(guān)因子2(Nrf2)是調(diào)節(jié)抗氧化防御系統(tǒng)以應(yīng)對氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[5]，Nrf2/HO-1通路的激活可減輕大鼠缺血再灌注損傷[6]。硫化氫(H2S)在腎臟中扮演重要的生理和病理角色，硫氫化鈉(NaHS)是H2S的外源性供體。我們前期研究表明，H2S可通過抑制氧化應(yīng)激減輕腎臟缺血再灌注損傷[7]。本研究通過建立腎缺血再灌注損傷模型，以NaHS作為預(yù)處理藥物，觀察H2S是否可通過Nrf2/HO-1通路減輕腎缺血再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠24只，購自山西省人民醫(yī)院實驗動物中心(動物許可證號：SYXK(晉)2019-0003)，6～8周齡，常規(guī)條件下飼養(yǎng)，自由進食和飲水，實驗前禁食12 h，自由飲水。

1.1.2 試劑 NaHS購于美國Sigma公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)試劑盒、尿素氮(BUN)及血肌酐(Scr)試劑盒均購于南京建成科技有限公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)熒光探針二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)試劑盒購于北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司；兔抗大鼠Nrf2一抗(AF7006)、抗HO-1一抗(10701-1-AP)、山羊抗兔IgG二抗(GB23303)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 動物建模及分組 選取24只雄性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組(sham組)、腎臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)組、I/R+NaHS組，每組8只。預(yù)處理：通過腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)進行麻醉，分離腎蒂周圍組織，暴露左腎動脈，結(jié)扎右腎蒂，切除右腎。左腎動脈插管，將硫化氫供體NaHS以300 nmol/min速度連續(xù)給藥10 min，I/R組和sham組左腎動脈注射同體積生理鹽水。I/R組及I/R+NaHS組用微動脈夾夾閉左腎蒂45 min后解除，建立缺血性急性腎損傷模型，sham組不給予夾閉。24 h后通過心臟穿刺采集血樣，檢測血液中Scr及BUN；采集左腎并分為兩份，一份浸泡于4%多聚甲醛常溫固定，經(jīng)石蠟包埋處理后存放，待腎組織標(biāo)本病理染色、TUNEL染色；另一份保存于-80 ℃冰箱，待腎組織標(biāo)本進行Western blotting檢測、ROS檢測、SOD及MDA檢測。

1.2.2 Western blot檢測Nrf2、HO-1蛋白表達 每組取適量存于-80 ℃冰箱的腎組織，加入適量預(yù)冷的蛋白裂解液勻漿，放置冰上裂解液30 min，用BCA試劑盒提取總蛋白并測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4 ℃條件下加入兔抗大鼠Nrf2一抗(1 ∶1 000)及兔抗大鼠HO-1一抗(1 ∶1 000)孵育過夜，TBST洗膜，在4 ℃下加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶3 000)，孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光。以GAPDH為內(nèi)參照，通過計算目標(biāo)蛋白與GAPDH的灰度值比值進行半定量分析。

1.2.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 取腎組織塊約50 mg，制作10%組織勻漿液，根據(jù)試劑盒說明書，比色法檢測腎組織SOD活性及MDA含量；腎組織冷凍，制作5 μm厚冰凍切片，按試劑盒說明書行DHE(dihydroethidium，二氫乙錠)染色，熒光顯微鏡觀察紅色熒光。

1.2.4 腎組織細胞凋亡檢測 為檢測缺血再灌注損傷凋亡情況，對不同處理組大鼠腎組織做切片后進行TUNEL染色和鏡下凋亡細胞統(tǒng)計。腎組織固定包埋，切片4 μm厚，根據(jù)TUNEL染色試劑盒說明書操作。4,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride staining，DAPI)所染細胞核在紫外激發(fā)波下呈藍色(即為視野所見所有腎小管上皮細胞)，陽性凋亡細胞核為綠色。使用Eclipse Ci-L熒光拍照顯微鏡選取切片的目的區(qū)域進行200倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，分別測量每張切片5個視野中陽性細胞數(shù)以及對應(yīng)的總細胞數(shù)，并計算出陽性率(%)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.5 腎功能檢測 收集各組大鼠血液，分離血清后用根據(jù)試劑盒說明書，采用比色法，用全自動生化分析儀檢測肌酐及尿素氮水平。

1.2.6 腎組織病理學(xué)檢測 取各組大鼠腎組織10%甲醛固定48 h后石蠟包埋制作切片，切片5 μm厚，行HE染色，在200倍熒光顯微鏡下觀察腎組織損傷情況，半定量評估腎小管間質(zhì)損傷程度。腎小管的損傷程度評分：0分，正常；1分，微創(chuàng)傷，外髓質(zhì)和皮質(zhì)破壞<5%；2分，輕度破壞，外髓質(zhì)和皮質(zhì)破壞5%～25%；3分，中度破壞，外髓質(zhì)和皮質(zhì)破壞25%～75%；4分，嚴(yán)重破壞，外髓質(zhì)和皮質(zhì)破壞>75%。

2 結(jié)果

2.1 Nrf2及HO-1蛋白表達水平

與sham組相比，I/R組Nrf2和HO-1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+NaHS組Nrf2和HO-1蛋白表達水平也明顯增高(P<0.05，見圖1)。

與sham組比較,*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05圖1 Western印跡法檢測各組大鼠腎組織HO-1、Nrf2蛋白的表達 (n=8)Figure 1 Expression of HO-1 and Nrf2 proteins in kidney tissues of rats in different groups by Western blot (n=8)

2.2 腎組織MDA及SOD表達

與sham組相比，I/R組腎組織SOD活性明顯降低(P<0.01)，MDA含量明顯增加(P<0.01)；與I/R組相比，NaHS處理后SOD活性明顯升高(P<0.01)，MDA含量減少(P<0.01，見表1)。

表1 各組大鼠腎組織SOD活性和MDA含量變化 (n=8，

2.3 腎組織ROS表達

與sham組比較，I/R組腎組織細胞內(nèi)有明顯的紅色熒光；與I/R組比較，I/R+NaHS組紅色熒光減弱(見圖2)。

與sham組比較，**P<0.01；與I/R組比較，##P<0.01圖2 各組大鼠腎組織ROS表達 (DHE染色，×200,n=8)Figure 2 ROS expression in rat kidney tissues in all groups (DHE staining,×200,n=8)

2.4 大鼠腎組織細胞凋亡情況

結(jié)果顯示：與sham組相比，I/R組可見凋亡細胞明顯增多(P<0.05)；與I/R組相比，I/R+NaHS組未見明顯凋亡特征(P<0.05，見圖3)。

與sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較,#P<0.05；箭頭所指為凋亡細胞圖3 各組大鼠腎組織凋亡細胞比較 (TUNEL染色，×200,n=8)Figure 3 Comparison of apoptotic cells in rat kidney tissue between groups (TUNEL staining,×200,n=8)

2.5 各組大鼠血肌酐及尿素氮水平

與sham組相比，I/R組Scr、BUN均明顯升高(均P<0.05)；與I/R組相比，I/R+NaHS組Scr、BUN均明顯下降(均P<0.05，見表2)。

表2 各組大鼠血清Scr、BUN水平比較

2.6 各組大鼠腎臟病理改變

sham組大鼠腎小球、腎小管未見明顯異常改變。與sham組相比，I/R組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)明顯受到破壞，腎小管上皮細胞壞死，管型形成，腎小管擴張可見核碎裂或溶解(黑色箭頭)及部分鈣化(紅色箭頭)，可見炎細胞浸潤(藍色箭頭)(P<0.01)；與I/R組相比，I/R+NaHS組腎小管間質(zhì)病理改變減輕，僅有少量空泡變性和管型，其間質(zhì)充血水腫減輕，僅有少量炎性細胞浸潤(P<0.01，見圖4)。

與sham組比較，**P<0.01；與I/R組比較,##P<0.01圖4 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變 (HE染色,×200,n=8)Figure 4 Histopathological changes of the kidney of rats in all groups (HE staining,×200,n=8)

3 討論

急性腎損傷是住院患者常見的并發(fā)癥之一，是終末期腎病的常見危險因素，常發(fā)展為慢性腎臟病[8]。腎缺血再灌注損傷是AKI的常見原因，其病理生理學(xué)包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、鈣超載、細胞自噬和凋亡以及內(nèi)皮細胞功能障礙等[9]。缺血再灌注損傷是腎移植過程不可避免的事件，可導(dǎo)致植物功能延遲、重要的腎實質(zhì)喪失，進而啟動免疫排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致植物功能喪失[2]。此外，血栓性疾病、膿毒癥、嚴(yán)重創(chuàng)傷、失血性休克、心搏驟停及體外循環(huán)手術(shù)等均可導(dǎo)致不可逆腎損傷及高病死率，已成為全球性公共衛(wèi)生問題。因此，預(yù)防和治療腎臟缺血再灌注損傷是臨床上迫切需要解決的問題。

H2S是一種無色、易燃、可溶于水的氣體，具有典型臭雞蛋味[10]。生化研究表明，腎臟是H2S的豐富來源，參與調(diào)節(jié)腎小球濾過率(GFR)、鈉吸收、腎素釋放和腎臟系統(tǒng)氧感應(yīng)等；胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚β-合成酶(CBS)和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)是腎臟中產(chǎn)生H2S的主要酶[11]。H2S對腎缺血再灌注損傷的有益作用主要是通過抗氧化、抗凋亡和抗炎作用實現(xiàn)[10]，且已被證明可以改善接受雙側(cè)腎切除術(shù)并隨后進行腎移植的大鼠的同種異體移植物存活率和腎功能[11]，表明其可能有助于在諸如腎移植、腎切除等情況下治療腎缺血再灌注損傷，保護腎功能[4]。除此之外，H2S可通過多種信號通路改善化療藥物所致急性腎損傷，并在泌尿系統(tǒng)腫瘤的治療有提示性作用[12-14]。

氧化應(yīng)激是腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展的重要惡化因素，缺血再灌注損傷誘導(dǎo)ROS生成是通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)的腎臟損傷，這是導(dǎo)致AKI的主要原因。在本實驗中，我們從腎功能角度證實，缺血再灌注處理情況下I/R組SD大鼠腎功能明顯受損，血肌酐及尿素氮含量高于sham組及NaHS組，表明大鼠缺血再灌注模型建立成功，缺血再灌注導(dǎo)致腎組織損傷和腎功能紊亂。而NaHS處理后SD大鼠血肌酐、尿素氮含量較I/R組降低，表明H2S對大鼠腎缺血再灌注后腎功能有保護作用。SOD是氧化應(yīng)激的重要酶，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物。故本實驗檢測大鼠腎組織SOD活性與MDA含量，觀察到腎缺血再灌注后SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加，同時ROS明顯增加，伴腎臟病理、腎功能損傷以及腎臟組織細胞凋亡增加，表明氧化應(yīng)激參與腎缺血再灌注損傷。而NaHS組SD大鼠MDA含量較I/R組降低，SOD活性增加，ROS明顯減少，大鼠腎臟病變情況和組織細胞凋亡情況改善，表明H2S可減輕腎臟氧化應(yīng)激損傷。

Nrf2/HO-1信號通路在機體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)關(guān)鍵位置，是抗氧化還原相關(guān)的重要通路，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的保護作用[6]。在此過程中，Nrf2與Kelch樣表氯醇相關(guān)蛋白1分離并轉(zhuǎn)移到細胞核，與抗氧化反應(yīng)元件相互作用，通過上調(diào)抗氧化酶基因如HO-1的轉(zhuǎn)錄和表達，減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的缺血再灌注損傷[15,16]。本研究檢測了Nrf2和HO-1蛋白水平的表達及下游氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、SOD、MDA的表達，發(fā)現(xiàn)Nrf2/HO-1信號通路在缺血再灌注過程中被激活，并可減輕氧化應(yīng)激損傷，與相關(guān)研究一致[5]。本實驗中，我們通過Western blot分析了三組大鼠腎組織Nrf2和HO-1蛋白水平的表達，發(fā)現(xiàn)與sham組比較，I/R組缺血再灌注大鼠腎組織中Nrf2和HO-1表達有所增高，表明Nrf2/HO-1信號通路可能參與腎缺血再灌注損傷。而NaHS預(yù)處理的大鼠Nrf2和HO-1蛋白表達水平較缺血再灌注組升高，SOD活性增加，MDA含量、ROS表達減少，伴腎功能、腎臟病理損傷好轉(zhuǎn)，腎組織凋亡降低，提示H2S可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路在大鼠腎缺血再灌注損傷中抑制氧化應(yīng)激，進而抑制下游的炎癥反應(yīng)與細胞凋亡，減輕缺血再灌注后的腎損傷。

綜上，本實驗通過建立大鼠腎缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)H2S可通過上調(diào)Nrf2/HO-1信號通路，抑制氧化應(yīng)激，對缺血性急性腎損傷起到保護作用，為急性腎損傷的治療提供新思路。