蘇嘯塵，王國(guó)強(qiáng)，李江波，姬 樂(lè)，李 萌，張銀剛，姬文晨*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，西安 710061；2陜西省人民醫(yī)院骨科;*通訊作者,E-mail:jiwenchenbaoyan@163.com)

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，車禍及高處墜落傷等暴力因素所導(dǎo)致的創(chuàng)傷越來(lái)越多，一旦發(fā)生爆裂性脊柱骨折，往往伴有脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)，會(huì)造成嚴(yán)重的肢體功能障礙，對(duì)于患者遠(yuǎn)期的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重危害[1]。胸腰段是脊柱的一個(gè)特殊節(jié)段，占脊柱骨折的90%，容易發(fā)生骨折并造成SCI[2]。原發(fā)性損傷往往在損傷即刻發(fā)生，無(wú)法逆轉(zhuǎn)；繼發(fā)性損傷則是后續(xù)功能紊亂的重要原因，一般包括炎癥反應(yīng)、過(guò)氧化反應(yīng)、自由基和細(xì)胞通道破壞等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是重中之重，早期抑制炎癥反應(yīng)對(duì)于SCI后期功能的恢復(fù)至關(guān)重要[3-5]。姜黃素治療SCI在既往研究中已經(jīng)被證實(shí)具有積極的意義，具備抗氧化、抗炎癥的作用[6-8]，但其抗炎的具體機(jī)制是什么，是否與調(diào)控NLRP3炎癥小體有關(guān)，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?；诖?，本課題擬采用姜黃素治療大鼠急性損傷，探討其在調(diào)控NLRP3炎癥小體中的作用，為臨床治療SCI提供一種參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用2月齡雌性SD大鼠，均為清潔級(jí)，體質(zhì)量200～220 g。動(dòng)物由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)12-018。本研究經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：2022-117。

1.2 主要儀器與試劑

IL-1β試劑盒(Abcam公司，美國(guó))，IL-6試劑盒(Abcam公司，美國(guó))，NLRP3(Abcam公司，美國(guó))，Caspase-1(Abcam公司，美國(guó))，ASC(Abcam公司，美國(guó))，蘇木精染色液(西安三浦化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))，伊紅染色液(武漢博士德生物工程有限公司，中國(guó))，石蠟切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))。

1.3 脊髓損傷模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組

按照課題組前期方法制作脊髓損傷動(dòng)物模型[9,10]。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，每組需存活10只大鼠，為防止術(shù)中和術(shù)后意外死亡，每組初始各使用15只大鼠。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組15只。對(duì)照組打開(kāi)椎板，不做任何處理；脊髓損傷組打擊造模成功，不做任何處理；姜黃素組打擊造模成功后，經(jīng)腹腔注射姜黃素(100 mg/kg)，連續(xù)7 d。

術(shù)前禁食6 h后，以10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后備皮消毒，以T10為中心行背部正中切口，長(zhǎng)約2.5 cm，逐層分離肌肉及組織，充分暴露T9～T11節(jié)段，生理鹽水沖洗止血，咬骨鉗去除T10棘突及椎板，保留硬膜完整，充分暴露T10脊髓后，假手術(shù)組直接逐層縫合切口，其他兩組則使用擊打器擊打T10，打擊能量60 cm·g，若觀察到損傷局部迅速出現(xiàn)充血水腫，雙后肢抽搐，尾巴擺動(dòng)，則造模成功。

1.4 BBB評(píng)分

術(shù)后1，2，4周進(jìn)行BBB評(píng)分，評(píng)估大鼠后肢功能的恢復(fù)，分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明功能恢復(fù)越好[11]。

1.5 HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況

術(shù)后4周，各組取3只大鼠，心臟灌注后，進(jìn)行如下操作：脊髓損傷組和姜黃素組，以打擊點(diǎn)為中心取脊髓組織2 cm，對(duì)照組取相同平面的正常脊髓組織2 cm，采用4%的多聚甲醛固定，制作蠟塊后常規(guī)切片(厚度為5 μm)，完成HE染色。

1.6 ELISA檢測(cè)組織炎癥因子IL-1β和IL-6

術(shù)后4周，各組取3只SD大鼠,切取包括脊髓損傷處上下各2 cm的組織，用PBS在冰上勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心30 min，隨后收集上清液進(jìn)行ELISA。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β和IL-6。

1.7 Western blot檢測(cè)NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)

術(shù)后4周，各組取4只SD大鼠,切除包括脊髓損傷處上下各2 cm的脊髓組織，進(jìn)行如下操作：RIPA裂解液提取脊髓總蛋白后進(jìn)行定量，取各組等量(50 μg)總蛋白在SDS-PAGE上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上后5%去脂奶粉封閉3 h，一抗NLRP3(1 ∶1 000稀釋)、Caspase-1(1 ∶1 000稀釋)和ASC(1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，按1 ∶2 000稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育，曝光洗片后，用Image Lab 8.0軟件檢測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后各組大鼠死亡率

對(duì)照組和脊髓損傷組各1只麻醉意外，脊髓損傷組1只泌尿系感染死亡，姜黃素組腹腔注射姜黃素后腹膜炎2只死亡(見(jiàn)表1)。由于術(shù)后護(hù)理得當(dāng)，給予補(bǔ)液，補(bǔ)充能量，抗感染治療，并輔助排便，護(hù)理泌尿系等措施，大鼠整體死亡率較低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)每組需要10只SD大鼠，對(duì)照組、脊髓損傷組和姜黃素組大鼠剩余數(shù)量多于10只，故采用隨機(jī)挑選法，從各組剩余大鼠內(nèi)挑選10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 術(shù)后各組SD大鼠死亡率

2.2 BBB評(píng)分

術(shù)后1周和2周，脊髓損傷組和姜黃素組大鼠后肢功能BBB評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后4周，姜黃素組BBB評(píng)分高于脊髓損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組BBB評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但脊髓損傷組和姜黃素組大鼠后肢功能BBB評(píng)分顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

與對(duì)照組相比，#P<0.05；與脊髓損傷組相比，*P<0.05圖1 不同組大鼠術(shù)后4周內(nèi)的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分Figure 1 BBB scores of rats within 4 weeks after operation in different groups

2.3 HE染色

術(shù)后4周，對(duì)照組脊髓組織形態(tài)正常，可見(jiàn)大量形態(tài)規(guī)則的神經(jīng)元，而脊髓損傷組和姜黃素組脊髓形態(tài)紊亂，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而且脊髓損傷組的炎癥細(xì)胞數(shù)量多于姜黃素組(圖2)。

圖2 術(shù)后4周各組脊髓組織HE染色 (×200)Figure 2 HE staining of spinal cord tissue at 4 week after operation in each group (×200)

2.4 ELISA檢測(cè)IL-1β和IL-6表達(dá)

術(shù)后4周，與對(duì)照組相比，脊髓損傷組和姜黃素組的炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-6表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與脊髓損傷組相比，姜黃素組炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-6表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與脊髓損傷組相比，#P<0.05圖3 術(shù)后4周各組脊髓組織炎癥介質(zhì)的表達(dá)Figure 3 Expression of inflammatory mediators in spinal cord tissue at 4 week after operation in each group

2.5 Western blot檢測(cè)NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)

術(shù)后4周，Western blot檢測(cè)各組蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，脊髓損傷組和姜黃素組的NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與脊髓損傷組比較，姜黃素組的NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

與對(duì)照組相比，*P<0.05；與脊髓損傷組相比，#P<0.05圖4 術(shù)后4周各組脊髓組織中蛋白的表達(dá)Figure 4 Protein expression in spinal cord tissue at 4 week after operation in each group

3 討論

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)作為脊柱骨折最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，致殘性高，治愈率低，如果損傷平面涉及上頸椎，部分患者在損傷后短時(shí)間內(nèi)死亡，給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。目前，臨床治療SCI主要有以下幾種方法：手術(shù)治療主要機(jī)制是減除骨塊對(duì)神經(jīng)的壓迫，恢復(fù)脊柱穩(wěn)定性，防止進(jìn)一步損傷；保守治療通常使用營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)藥物甲鈷胺，血管活性藥物前列地爾，以及類固醇激素甲強(qiáng)龍改善局部微環(huán)境；康復(fù)治療，通過(guò)理療、針灸、電刺激等方法促進(jìn)肢體功能恢復(fù)[13-15]。然而，上述方法對(duì)于SCI的治療雖然有一定效果，但離理想狀態(tài)還相差甚遠(yuǎn)，所以深入研究SCI的病理學(xué)機(jī)制，盡早給予干預(yù)，防止繼發(fā)性損傷顯得尤為重要。

炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是SCI微環(huán)境紊亂的重要原因，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)于抑制細(xì)胞凋亡、維持神經(jīng)元的存活有著重要意義[16]。有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在SCI后的炎癥反應(yīng)中起著重要作用，SCI可以促進(jìn)NLRP3、pro-Caspase-1及ASC蛋白的轉(zhuǎn)錄并發(fā)生寡聚化，組成為成熟的NLRP3-ASC-pro-Caspase-1蛋白復(fù)合體，即NLRP3炎癥小體，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能繼發(fā)性損傷，所以，抑制NLRP3炎癥小體的活化對(duì)于SCI的治療至關(guān)重要[17,18]。姜黃素是姜黃植物根莖的提取物，既往應(yīng)用姜黃素治療SCI取得了一定的成果[19,20]。郝琴等[21,22]認(rèn)為姜黃素可以促進(jìn)SCI大鼠后肢功能的恢復(fù)，最佳腹腔注射計(jì)量為100 mg/kg，主要是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡和減輕炎癥反應(yīng)來(lái)提高神經(jīng)功能。然而，姜黃素抑制炎癥反應(yīng)及發(fā)揮抗凋亡作用是否與調(diào)控NLRP3炎癥小體有關(guān)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

為了解決這一問(wèn)題及進(jìn)一步探討SCI的修復(fù)機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)完成此次課題，參照既往研究結(jié)果將姜黃素的給藥濃度定為100 mg/kg，給藥時(shí)間為術(shù)后連續(xù)7 d。術(shù)后4周，姜黃素組BBB評(píng)分高于脊髓損傷組，但低于對(duì)照組，這表明姜黃素組可提高SCI后動(dòng)物肢體的運(yùn)動(dòng)能力，是一種有效治療SCI的方法，但距離正常大鼠仍然差距較遠(yuǎn)。術(shù)后4周，相于對(duì)照組，姜黃素組的脊髓形態(tài)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較多，炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6升高，NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)增高，但相對(duì)于脊髓損傷組，姜黃素組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，炎癥介質(zhì)表達(dá)降低，NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)降低，這就說(shuō)明姜黃素可以顯著抑制SCI后的炎癥反應(yīng)，且與調(diào)控NLRP3小體有著重要關(guān)系，因?yàn)檠装Y介質(zhì)的降低與NLRP3相關(guān)蛋白的降低呈正相關(guān)。

與此同時(shí)，本課題研究中也發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題，首先是姜黃素溶解后通過(guò)腹腔注射會(huì)導(dǎo)致一部分大鼠死亡，通過(guò)解剖認(rèn)為腹膜炎是其死亡的重要原因，所以改進(jìn)姜黃素的使用方法是未來(lái)研究的方向之一，尤其近年來(lái)納米載體的逐步興起，為后續(xù)研究帶來(lái)新的思路，是否可以采用納米載體攜帶姜黃素通過(guò)尾靜脈注射，從而提高藥物的起效濃度，值得進(jìn)一步研究。其次是本實(shí)驗(yàn)在HE染色結(jié)果觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)，只是宏觀地進(jìn)行了判斷，只能初步確定腹腔注射姜黃素可以抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，后續(xù)研究我們會(huì)對(duì)其進(jìn)行定量計(jì)數(shù)，來(lái)深入探究其抑制炎癥的具體機(jī)制并推進(jìn)實(shí)驗(yàn)其他部分的進(jìn)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過(guò)抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)大鼠后肢功能的恢復(fù)，探討其可能的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)可能與調(diào)控NLRP3炎癥小體有關(guān)，這一結(jié)果對(duì)于后期進(jìn)一步研究SCI的修復(fù)機(jī)制有著重要意義。