陶 丹,劉澤源,王 賀,王勇剛

(昆明市兒童醫(yī)院眼科,昆明 650028)

隨著現階段人口老齡化和城市化進程的加劇，糖尿病發(fā)生率呈現逐年升高的趨勢。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)屬于糖尿病主要眼部并發(fā)癥類型，同時也是致盲的主要因素之一[1]。目前為止，我國糖尿病患者已超過1億，且在這其中有相當一部分患者可能發(fā)生DR。糖尿病患者DR發(fā)病機制主要包括糖基化終末產物堆積、視網膜生長因子異常表達、炎性因子增加、視網膜毛細血管血流變化等[2]。糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是糖醛基與蛋白質氨基二者經非酶糖基化反應生成，屬于不可逆的異源大分子物質，在視網膜神經細胞組織中堆積是致使DR發(fā)生的主要病因之一[3]。糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)是一種膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，糖尿病、炎癥、腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮極其重要的作用。近年來，隨著分子生物學、遺傳學的飛速發(fā)展，以及人類基因組計劃的開展，疾病發(fā)生和發(fā)展中易感基因型的作用越來越受到研究人員的關注和重視，從遺傳學的角度來討論基因突變與DR疾病發(fā)生發(fā)展的關系，具有深遠且重大的意義[4]。作為研究DR的候選基因之一，RAGE基因序列的改變可能影響AGEs-RAGE間的作用，進而影響疾病進程。云南省有25個少數民族，本研究選擇昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)傣族人群分別探討其RAGE基因多態(tài)性與DR發(fā)生的關系，旨在早期發(fā)現DR易感人群，采取相應措施。

1 對象與方法

1.1 病例來源

本研究采用多階段分層抽樣的方法，以云南省第一人民醫(yī)院、西雙版納傣族自治州人民醫(yī)院、景洪市第一人民醫(yī)院3家醫(yī)院收治患者及體檢為抽樣對象，分別選取2020年3月至2021年2月昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)傣族人群各150例，每個地區(qū)或民族中包括正常對照人群50例，糖尿病未合并視網膜病變50例，糖尿病合并視網膜病變50例，分別納入對照組、NDR組和DR組。糖尿病患者均符合1999年WHO糖尿病診斷標準[5]，糖尿病確診時年齡≥30歲，DR患者符合糖尿病視網膜病變治療指南相關標準[6]，納入對象相互間不具備血緣關系；排除肝功能異常、糖尿病酮癥、急性心力衰竭、腦梗死、腦出血等患者。

1.2 主要試劑

基因組DNA提取試劑：全血基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技)，瓊脂糖(Invitrogen公司)，2×Taq PCR Master Mix(北京全式金生物工程技術)，5 000 bp DNA分子量marker(TaKaRa公司)，溴化乙錠(北京鼎國公司)，5 000 bp DNA分子量marker(TaKaRa公司)，其他試劑：無水酒精，異丙醇等(國產分析純產品)。

1.3 基因組DNA提取

抽取納入對象5 ml空腹靜脈血，加入2～3倍體積紅細胞裂解液，用血液基因組試劑盒提取DNA，得到高質量的基因組DNA，樣本檢測純度合格后，-80 ℃保存直至檢測。引物序列：①RAGE基因-374T/A位點上游：5′-GGGGCAGTTCTCTCCTC-ACT-3′，下游：5′-GGTTCAGGCCAGACTGTTGT-3′；②RAGE基因2184A/G位點上游：5′-TAATTTCCTGCCCCATTCTG-3′，下游：5′-CATCGCAATCTATGCCTCCT-3′；③RAGE基因2245G/A位點上游：5′-ACACTTTGGGAGGCTGCTGC-3′，下游：5′-CCACCATGCCTGGCTAATTTTGT-3′。引物合成由上海生工公司進行。

1.4 基因型分析

目的基因片段的PCR擴增及測序：①PCR反應體系：PCR反應總體系10 μl，其中RAGE基因374T/A位點、2184A/G位點、2245G/A位點上游引物與下游引物各0.2 μl、PCR Mix 5.0 μl、模板DNA 1.0 μl、滅菌雙蒸水2.6 μl；②PCR擴增循環(huán)過程：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，共進行35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min；③PCR擴增產物的凝膠電泳鑒定：PCR反應后，取4 μl PCR擴增產物與1.0 μl SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合，上樣，3.0% TAE瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳30 min，以5 000 bp DNA Marker為分子量標準，結束后凝膠成像系統(tǒng)照相；④PCR產物測序：將擴增出目的條帶DNA產物純化后送上海生工測序。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件，計數資料通過百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率分析，比較昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)傣族人群RAGE基因374T/A位點、2184A/G位點、2245G/A位點基因型和基因頻率分布差異，并根據患者糖尿病以及DR發(fā)生情況，對比同一地區(qū)同一民族下對照組、NDR組和DR組RAGE基因374T/A位點、2184A/G位點、2245G/A位點基因型和基因頻率分布差異；采用Logistic分析糖尿病患者視網膜病變發(fā)生的危險基因型；P<0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 聚合酶鏈反應-直接測序分析

RAGE基因-374T/A、2184A/G、2245G/A多態(tài)性的PCR擴增產物使用2.0%TAE瓊脂糖凝膠進行電泳，以5 000 bp DNA Marker為分子量標準，所得RAGE基因-374T/A、2184A/G、2245G/A多態(tài)性的PCR擴增片段長度分別為250 bp(見圖1)、396 bp(見圖2)、116 bp(見圖3)。由電泳結果可見PCR擴增產物的含量尚可、無明顯雜帶，可用于下一步的測序分析。

1. 5 000 bp DNA Marker；2～7. PCR擴增產物圖1 RAGE基因-374T/A多態(tài)性的PCR產物電泳結果Figure 1 Electrophoresis results of PCR products in RAGE -374T/A polymorphisms

1. 5 000bp DNA Marker;2～5. PCR擴增產物圖3 RAGE基因2245G/A多態(tài)性的PCR產物電泳結果Figure 3 Electrophoresis results of PCR products in RAGE 2245G/A polymorphisms

2.2 DR組、NDR組以及對照組RAGE -374T/A基因多態(tài)性分析

昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群和西雙版納地區(qū)傣族人群中正常對照組、DR組及NDR組之間的RAGE -374T/A基因型分析顯示，TT、TA和AA的分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(P>0.05)。西雙版納地區(qū)傣族人群中DR組RAGE -374T/A位點TT基因型的分布頻率與對照組及NDR組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中DR組TT頻率低于對照組和NDR組，TA和AA基因型的分布頻率在三組間無顯著差異；而DR組RAGE -374T等位基因分布頻率較對照組(χ2=4.934，P<0.05)和NDR組(χ2=4.058，P<0.05)顯著降低，A等位基因分布頻率較對照組(χ2=7.812，P<0.05)和NDR組(χ2=5.922，P<0.05)顯著增加。昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群中對照組、DR組及NDR組間RAGE -374T/A位點基因型和等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 DR組、NDR組以及對照組RAGE -374T/A基因多態(tài)性分析 (%)

2.3 DR組、NDR組以及對照組RAGE 2184A/G基因多態(tài)性分析

昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)傣族人群中正常對照組、DR組及NDR組之間的RAGE2184A/G基因型分析顯示，AA、AG和GG的分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(P>0.05)。西雙版納地區(qū)傣族人群中DR組RAGE 2184A/G位點GG基因型的分布頻率與對照組及NDR組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中DR組GG頻率高于對照組和NDR組，AA和AG基因型的分布頻率在三組間無顯著差異；而DR組RAGE 2184A等位基因分布頻率較對照組(χ2=13.781，P<0.05)和NDR組(χ2=5.604，P<0.05)顯著降低，G等位基因分布頻率較對照組(χ2=11.416，P<0.05)和NDR組(χ2=4.596，P<0.05)顯著增加。昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群中對照組、DR組及NDR組RAGE 2184 A/G位點基因型與等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。

表2 DR組、NDR組以及對照組RAGE 2184A/G基因多態(tài)性分析 (%)

2.4 DR組、NDR組以及對照組RAGE 2245G/A基因多態(tài)性分析

昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)傣族人群中正常對照組、DR組及NDR組之間的RAGE 2245G/A基因型分析顯示，三組均有GG和GA基因型存在，且RAGE 2245G/A基因型GG和GA的分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(P>0.05)。西雙版納地區(qū)傣族人群中DR組RAGE 2245G/A位點GG、GA基因型的分布頻率與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中DR組GG頻率低于對照組(P<0.05)，GA頻率高于對照組(P<0.05)；而DR組RAGE 2245G等位基因分布頻率較對照組顯著降低(χ2=1.52，P<0.05)，A等位基因分布頻率較對照組顯著增加(χ2=2.11，P<0.05)；而NDR組RAGE 2245G/A位點GG、GA基因型的分布頻率與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中NDR組GG頻率低于對照組(P<0.05)，GA頻率高于對照組(P<0.05)，NDR組RAGE 2245G等位基因分布頻率較對照組顯著降低(χ2=1.86，P<0.05)，A等位基因分布頻率較對照組(顯著增加χ2=2.01，P<0.05)。昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群中對照組、DR組及NDR組RAGE 2245G/A位點基因型與等位基因頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

表3 DR組、NDR組以及對照組RAGE 2245G/A基因多態(tài)性分析 (%)

2.5 西雙版納地區(qū)傣族糖尿病患者RAGE基因多態(tài)性與DR發(fā)生風險關聯(lián)分析

利用非條件Logistic回歸模型計算校正性別、年齡、糖尿病病程后的OR及95%CI，結果顯示RAGE -374T/A位點TA+AA基因型是西雙版納地區(qū)傣族糖尿病患者DR發(fā)生的危險基因型，OR值為1.619(95%CI：1.172～2.238)；RAGE 2184G/A位點AG+GG基因型是西雙版納地區(qū)傣族糖尿病患者DR發(fā)生的危險基因型，OR值為1.667，95%CI：1.140～2.438(見表4)。

表4 西雙版納地區(qū)傣族糖尿病患者RAGE基因多態(tài)性與DR發(fā)生風險關聯(lián)分析

3 討論

DR的發(fā)生、發(fā)展與多種因素相關，包括血糖控制效果、糖尿病病程、血壓水平、環(huán)境因素、遺傳因素等[7]。相關研究顯示[8]，有效的血糖和血壓控制可延緩或減輕DR發(fā)生和發(fā)展，卻不能徹底阻止。除了高血糖及環(huán)境因素外，遺傳因素也在DR的發(fā)生與發(fā)展中具有相當重要的作用[9]。

RAGE屬免疫球蛋白超家族多配體受體，在肺臟外的多個組織器官中均呈現低表達，作為跨細胞膜信息傳遞通道，于多種細胞表面表達，可引起大量生成反應性氧化基團，產生強烈的氧化應激反應，后者又可激活轉錄因子，與炎癥反應、細胞黏附、凝血、組織生長等密切相關，最終導致病理性改變。人RAGE基因位于6p21.3，含外顯子11個，原始翻譯產物含氨基酸殘基383個，氨基端22個氨基酸殘基均為信號肽。相關研究結果顯示[10,11]，無論是糖尿病患者還是糖尿病動物模型，在視網膜、腎小球系膜等組織中AGEs積聚的區(qū)域，RAGE均呈現高表達。Chen等[12]研究發(fā)現阻斷RAGE與AGEs結合可減輕血-視網膜屏障破壞，改善小鼠DR病變程度，間接證實RAGE在DR的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

本研究中昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)傣族人群不同地區(qū)或民族RAGE基因-374T/A、2184A/G、2245G/A基因位點基因分型與等位基因分布無明顯差異。西雙版納傣族人群中DR組RAGE基因啟動子區(qū)-374T/A位點A等位基因頻率分布顯著高于NDR組及對照組，但NDR組與對照組的各基因型及等位基因頻率分布比較無差異，說明A等位基因可能是促進西雙版納地區(qū)傣族人群DR發(fā)生和進展的因子，但并非是致使糖尿病發(fā)生發(fā)展的因素。Logistic回歸分析結果顯示，RAGE -374T/A位點TA+AA基因型的西雙版納地區(qū)傣族糖尿病患者DR發(fā)生風險是TT基因型的1.619倍，由此推測RAGE基因-374T/A位點多態(tài)性與西雙版納地區(qū)傣族糖尿病患者DR的發(fā)生有關，且A等位基因是DR發(fā)生的危險因素。這可能是由于RAGE啟動子區(qū)-374T置換為A可提高轉錄因子對RAGE基因啟動區(qū)的親和力，誘導轉錄因子結合，形成復合體，影響轉錄活性。 Li等[13]研究認為RAGE基因2184A/G位點多態(tài)性與2型糖尿病DR發(fā)生相關，其中G等位基因是引起DR的危險因素。本研究顯示昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群中DR組、NDR組及對照組RAGE基因2184A/G位點基因型及基因頻率比較無明顯差異，但西雙版納地區(qū)傣族人群中DR組2184A/G位點G等位基因頻率高于NDR組與對照組，Logistic回歸分析發(fā)現，AG+GG基因型患者DR發(fā)生風險達到AA基因型號的1.667倍，由此推測RAGE基因2184A/G多態(tài)性與西雙版納地區(qū)傣族DR的發(fā)生有一定的相關性，且G等位基因為DR發(fā)生的危險因素。2184A/G位點基因多態(tài)性與機體血清抗氧化劑水平相關，而糖尿病血管病變又與血清抗氧化劑水平有關，RAGE基因2184A/G位點A-G置換可能通過影響機體內的抗氧化劑血清水平增加糖尿病血管病變發(fā)生風險[14]。

本研究中從其基因型及基因頻率分布結果可知，正常對照組中昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)傣族人群G等位基因頻率為89.0%，91.0%，92.0%；A等位基因頻率為11.0%，9.0%，8.0%，不同地區(qū)或民族G、A基因頻率分布比較無顯著差異。Tao等[15]對馬來西亞人群研究顯示，RAGE基因2245G/A位點多態(tài)性與2型糖尿病患者視網膜病變發(fā)生的風險無關。本研究中，昆明地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)漢族人群、西雙版納地區(qū)傣族人群DR組與NDR組比較RAGE基因2245G/A位點基因型及基因頻率分布比較無明顯差異，與上述研究結果一致，說明RAGE基因2245G/A位點多態(tài)性不影響糖尿病患者DR的發(fā)生發(fā)展。值得注意的是，本研究對于西雙版納地區(qū)傣族人群的研究顯示DR組與NDR組RAGE基因2245G/A位點A等位基因頻率均高于對照組，GG基因型頻率低于對照組，GA基因型頻率高于對照組，說明RAGE基因2245G/A位點A等位基因雖不增加糖尿病患者視網膜病變發(fā)生，但其增加了糖尿病發(fā)生風險，從而也就增加了DR的發(fā)生。

綜上所述，云南西雙版納地區(qū)傣族人群RAGE基因-374T/A位點A等位基因、2184A/G位點G等位基因增加了糖尿病患者視網膜病變發(fā)生風險，2245G/A位點多態(tài)性雖與糖尿病患者視網膜病變的發(fā)生無關，但其A等位基因增加了正常人群發(fā)生糖尿病的風險，進而可能影響DR的發(fā)生。