李 潔，馬力天，金兆豐，鄭偉杰，王敬博，毛培軍#，葉 欣*

(1空軍第986醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 710054；2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科；3濰坊醫(yī)學(xué)院心理學(xué)院；468003部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)；*通訊作者,E-mail:joannaxye@126.com；#共同通訊作者，E-mail：myhao2002@163.com)

研究顯示，全球約有4.25億人患有糖尿病，我國約有1.15億人患有糖尿病[1]。糖尿病不僅給患者本人帶來極大痛苦，同時(shí)也增加了社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在糖尿病的并發(fā)癥中，由神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的臨床綜合征是最普遍的，具有高發(fā)病率和治療困難的特點(diǎn)。糖尿病神經(jīng)病變可累及全身周圍神經(jīng)系統(tǒng)任何部分，是一種獨(dú)特的外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病，優(yōu)先靶向感覺軸突、自主神經(jīng)軸突，較小程度上靶向運(yùn)動軸突[1]。英國的一項(xiàng)大型研究表明，約30%～50%的糖尿病神經(jīng)病變患者會出現(xiàn)神經(jīng)性疼痛[2]。這種周圍神經(jīng)病變引起的糖尿病神經(jīng)痛，迄今為止仍是疼痛治療領(lǐng)域的一大難題，其機(jī)制尚不明確，現(xiàn)有的治療方法也不能有效緩解糖尿病神經(jīng)痛，因此有必要進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制。

脊髓背角是各種感覺的初級整合中樞，其中含有豐富的神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽及受體等[3]。現(xiàn)有的研究表明，脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，及細(xì)胞因子的釋放可能是維持糖尿病神經(jīng)痛的重要機(jī)制[4]；不僅如此，脊髓背角中的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)釋放減少和/或其受體表達(dá)及功能降低導(dǎo)致的抑制性突觸傳遞減弱也促進(jìn)了該病的發(fā)生[5]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究了1型糖尿病病理性神經(jīng)痛大鼠脊髓背角中基因表達(dá)的變化，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、主要儀器和試劑

清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g(購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，4只/籠，光照12 h/12 h明暗交替，室溫(23±2)℃，濕度40%～60%，自由飲食。本研究實(shí)驗(yàn)動物的使用及處置方法符合3R原則，實(shí)驗(yàn)開展前經(jīng)過空軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。動物的生產(chǎn)許可證號為：No. SCXK(Shaan)2019-001；動物實(shí)驗(yàn)倫理審批號：IACUC-20201022。

Qubit 2.0熒光計(jì)(Invitrogen，Q32866)，微型旋渦混合儀(上海滬西，WH-3)，臺式高速低溫離心機(jī)(Thermo，Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R)，電泳儀(北京六一，DYY-11)，生物電泳圖像分析系統(tǒng)(復(fù)日科技，F(xiàn)R-980A)，高通量轉(zhuǎn)錄組測序儀(Illumina)。Qubit RNA檢測試劑盒(Life，Q32855)，Total RNA Extractor(Trizol)(上海生工，B511311)。

1.2 1型糖尿病病理性神經(jīng)痛大鼠模型的建立

參考文獻(xiàn)所用方法[6,7]先建立1型糖尿病大鼠。40只清潔級健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成兩組:對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只。領(lǐng)回動物后，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔單次注射1%鏈脲佐菌素(STZ)65 mg/kg，注射前需禁食12 h，對照組注射等體積生理鹽水。注射后第4天用魚躍血糖儀檢測大鼠空腹血糖濃度，若空腹血糖大于16.7 mmol/L，則認(rèn)為1型糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功；之后采用von Frey細(xì)絲(詳見1.3)分別測定兩組大鼠后爪機(jī)械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，MWT低于自身基礎(chǔ)水平85%則認(rèn)為1型糖尿病病理性神經(jīng)痛大鼠模型構(gòu)建成功[6,8]。

1.3 機(jī)械刺激縮足反射閾值測定

將1.2中成模的1型糖尿病大鼠及對照組大鼠分別置于15 cm×15 cm×20 cm的有機(jī)玻璃罩內(nèi)，底部為金屬絲制成的網(wǎng)格墊，將不同粗細(xì)的von Frey細(xì)絲[9]通過底部金屬網(wǎng)格刺激大鼠足底。8根von Frey纖維絲對應(yīng)的機(jī)械力值依次為1.4，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，15.0，26.0 g。將大鼠置于金屬篩網(wǎng)架上，測試前先將大鼠放于鼠箱內(nèi)適應(yīng)30 min，待其安靜后開始實(shí)驗(yàn)。動物反應(yīng)包括縮足、舔腳等。每一批大鼠檢測完成后，將金屬篩網(wǎng)和鼠箱清理干凈，鼠箱需噴灑75%酒精消毒，待酒精全部揮發(fā)后進(jìn)行測試。從最小強(qiáng)度開始，每個(gè)強(qiáng)度測試5次，每次均記錄出現(xiàn)縮足反射的閾值，間隔3～5 s，出現(xiàn)縮足反射3次以上的刺激強(qiáng)度即為大鼠對機(jī)械刺激的反應(yīng)閾值，計(jì)算每組的平均值。1型糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功后，分別在第30，60天進(jìn)行機(jī)械痛閾的測定。在第60天痛閾檢測結(jié)束后，選取MWT低于自身基礎(chǔ)水平85%的1型糖尿病大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 測序步驟、數(shù)據(jù)評估及質(zhì)控

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-sequencing，RNA-Seq)是利用新一代測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)，可全面獲得樣本幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息和表達(dá)信息，包括編碼蛋白質(zhì)的mRNA和各種非編碼RNA。收取大鼠脊髓背角的組織樣本時(shí)，使用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理過的磷酸鹽緩沖液經(jīng)心臟進(jìn)行灌注，并使用無RNA酶的剪刀小心剪取脊髓背角組織，經(jīng)液氮速凍后放入-80 ℃進(jìn)行保存，之后使用Illumina公司開發(fā)的Hiseq高通量測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序獲得的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別后分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列。使用數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件Trimmomatic進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，主要步驟為：①去除帶N堿基的序列；②去除序列中的接頭序列；③從序列3′到5′方向開始去除低質(zhì)堿基(Q<20)；④從序列5′到3′方向開始去除低質(zhì)堿基(Q<20)；⑤使用滑窗法去除序列尾部質(zhì)量值在20以下的堿基(窗口大小為5 bp)；⑥去除序列長度小于35 nt的序列本身及其配對序列。質(zhì)控結(jié)束后，使用序列相似性比對工具Blast從質(zhì)控后的數(shù)據(jù)中抽取10 000條序列與美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的核酸序列資料庫(Nucleotide Sequence Database，NT)進(jìn)行比對，并進(jìn)行污染檢測。

1.5 樣本間相關(guān)性分析

生物學(xué)重復(fù)是任何生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所必需的，樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)，計(jì)算出Pearson相關(guān)系數(shù)后繪制樣本間相關(guān)性分析熱圖，相關(guān)系數(shù)越接近1，表示樣品之間表達(dá)模式的相似度越高。

1.6 PcoA主坐標(biāo)分析和層次聚類樹分析

為了使數(shù)據(jù)相似性或差異性可視化，使用主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis，PcoA)觀察數(shù)據(jù)間的差異。PcoA是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可以找到距離矩陣中最主要的坐標(biāo)，它沒有改變樣品點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系，只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。

此外，還使用層次聚類分析構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，得到樹狀關(guān)系形式用于可視化分析。層次聚類分析反映的是使用統(tǒng)計(jì)算法bray curtis計(jì)算所得的樣本間距離，該距離反映樣本間總體特征分布上的差異。

1.7 組間表達(dá)差異分析

為了使不同樣本間估計(jì)的基因表達(dá)水平具有可比性，引入了TPM的概念。TPM(transcripts per million)是計(jì)量在RNA池中某個(gè)轉(zhuǎn)錄本的比例，使不同組、不同樣品間估計(jì)的基因表達(dá)水平具有可比性。TPM同時(shí)考慮了測序深度和基因長度，是常用的基因表達(dá)水平估算方法[10]。據(jù)TPM值分析數(shù)據(jù)，使用得到的P值以及基因在兩組樣本中的FoldChange值繪制兩組樣本數(shù)據(jù)的顯著性差異的火山圖，可宏觀展示兩組樣本間基因上下調(diào)情況。進(jìn)一步，根據(jù)P值的大小，列出上下調(diào)最顯著的15個(gè)基因。

1.8 差異基因功能富集分析

使用GO富集分析進(jìn)行差異基因功能的富集分析，能夠識別出與生物現(xiàn)象最相關(guān)的生物學(xué)途徑。除了GO富集分析之外，還使用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因所參與的通路進(jìn)行富集。采用超幾何分布(不放回抽樣)對基因進(jìn)行富集分析，使用富集分析軟件(clusterProfiler)進(jìn)行功能富集分析。校正后的P<0.05時(shí)，該功能存在顯著富集的情況。富集結(jié)果用散點(diǎn)圖表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 采用腹腔單次注射STZ可使血糖顯著升高

與對照組相比，到第4天，20只實(shí)驗(yàn)組大鼠中有19只血糖升高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05，見圖1)；到第30天時(shí)，19只大鼠中有2只死亡，還剩17只大鼠血糖升高；這17只大鼠順利存活到第60天，說明實(shí)驗(yàn)組中共有17只大鼠1型糖尿病模型構(gòu)建成功。

與對照組相比，*P<0.05圖1 造模后不同時(shí)間的血糖值Figure 1 Blood glucose values at different time points after modeling

2.2 機(jī)械痛閾的測定

分別在注射STZ后的第30，60天檢測對照組與2.1中1型糖尿病大鼠的機(jī)械痛閾，其閾值低于自身基礎(chǔ)水平85%的1型糖尿病大鼠被認(rèn)為是1型糖尿病神經(jīng)痛大鼠。結(jié)果表明，第30天，在17只1型糖尿病大鼠模型中，有8只大鼠的痛閾降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05，見圖2)；第60天時(shí)，這8只大鼠的痛閾依然降低，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05，見圖2)。

與對照組相比，*P<0.05圖2 1型糖尿病神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛閾Figure 2 MWT of type 1 diabetic neuropathy pain rats

2.3 各樣本質(zhì)量控制后數(shù)據(jù)信息

通過對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后，去除其中帶接頭的、低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，保證數(shù)據(jù)質(zhì)量。其中Q20以上代表了堿基錯(cuò)誤率在1%以下，Q30以上代表了堿基錯(cuò)誤率在1‰以下。質(zhì)控后的數(shù)據(jù)中，各樣本的堿基錯(cuò)誤率和N堿基的比例極低(見表1)，確保本研究采集到的數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)分析。

表1 各樣本質(zhì)量控制后數(shù)據(jù)信息

2.4 樣本間相關(guān)性分析

樣品間的相關(guān)性反映了樣品間的相似情況，即不同樣品在表達(dá)水平的相似度。相關(guān)系數(shù)越接近1，樣品間的相似度越高，樣品間的差異基因越少。樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)。結(jié)果表明，同一組之間的樣本相關(guān)性較好(圖中顏色偏黃的區(qū)域)；不同組之間的樣本相關(guān)性指數(shù)較低(圖中顏色灰白的區(qū)域)(見圖3)。說明分組可靠，樣本選擇合理。

顏色塊代表相關(guān)性指數(shù)值，顏色越灰表示樣本間相關(guān)性指數(shù)越低，顏色越黃則相關(guān)性指數(shù)越高圖3 重復(fù)相關(guān)性分析熱圖Figure 3 Heatmap of repeated correlation analysis

2.5 PcoA主坐標(biāo)分析和層次聚類樹分析

通過PCoA可以研究數(shù)據(jù)的相似性或差異性。結(jié)果表明，對照組和1型糖尿病神經(jīng)痛模型組的樣本間的差異較大，距離較遠(yuǎn)(見圖4)。層次聚類樹分析表明，1型糖尿病神經(jīng)痛組和對照組大鼠可以明顯分開，且每組組內(nèi)樣本重復(fù)性很好(見圖5)。結(jié)合PcoA主坐標(biāo)分析和樣本層次聚類樹分析可以說明1型糖尿病神經(jīng)痛組和對照組的確存在基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異。

紅色代表對照組，藍(lán)色代表1型糖尿病神經(jīng)痛組圖4 PcoA主坐標(biāo)分析組內(nèi)數(shù)據(jù)的相似性與組間數(shù)據(jù)的差異性Figure 4 PcoA of the similarity within the group and the difference between two groups

樹枝的長度代表樣本間距離，越相似的樣本會越靠近，樣本按分組以不同顏色區(qū)分，紅色代表對照組，藍(lán)色代表1型糖尿病神經(jīng)痛組圖5 層次聚類樹分析樣本間的相似性Figure 5 Hierarchical clustering tree analysis of the similarity between samples

2.6 1型糖尿病神經(jīng)痛組與對照組之間差異表達(dá)分析

與對照組相比，1型糖尿病神經(jīng)痛組共有42個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了上調(diào)，有51個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了下調(diào)?；鹕綀D顯示兩組樣本數(shù)據(jù)有顯著性差異(見圖6)，上下調(diào)最為顯著的15個(gè)基因見表2、表3。

圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，紅色代表上調(diào)的基因，綠色代表下調(diào)的基因，黑色代表非差異基因圖6 1型糖尿病神經(jīng)痛組與對照組間差異基因表達(dá)火山圖Figure 6 The volcano plot of differential gene expression between two groups

表2 1型糖尿病神經(jīng)痛組中發(fā)生上調(diào)的基因

表3 1型糖尿病神經(jīng)痛組中發(fā)生下調(diào)的基因

2.7 差異基因功能富集分析

GO富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)的基因富集于?；姿崦富钚?、主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)和MHC Ⅰ類蛋白復(fù)合物3個(gè)GO分類條目(見圖7)，提示在1型糖尿病神經(jīng)痛大鼠模型中，差異表達(dá)的基因可能與?；姿崦富钚?、MHC蛋白復(fù)合物和MHCⅠ類蛋白復(fù)合物三個(gè)功能類群有關(guān)。除了對基因本身功能的注釋，我們使用KEGG數(shù)據(jù)庫對基因所參與的通路進(jìn)行富集。結(jié)果表明，在1型糖尿病神經(jīng)痛大鼠模型中，差異表達(dá)的基因主要富集在5條通路上，分別是：抗原加工和提呈、氨基苯甲酸酯降解、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞黏附分子(CAM)和吞噬體上(見圖8)。

P值的大小用點(diǎn)的顏色表示，P值越小則顏色越接近紅色，每個(gè)功能下包含的差異基因的多少用點(diǎn)的大小來表示圖7 1型糖尿病神經(jīng)痛組和對照組間差異基因的GO富集分析Figure 7 GO enrichment analysis of differential genes between two groups

P值的大小用點(diǎn)的顏色表示，P值越小則顏色越接近紅色，每個(gè)功能下包含的差異基因的多少用點(diǎn)的大小來表示圖8 1型糖尿病神經(jīng)痛組和對照組間差異基因的KEGG富集分析Figure 8 KEGG enrichment analysis of differential genes between two groups

3 討論

糖尿病神經(jīng)痛易發(fā)生于糖尿病后期，高血糖會引起周圍神經(jīng)損傷并誘發(fā)疼痛，長期高血糖是主要致病因素[11]。我們成功建立了基于STZ導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞損害的1型糖尿病模型，該模型會使縮足閾值顯著下降[12]，與正常大鼠相比，1型糖尿病神經(jīng)痛組大鼠的機(jī)械痛閾顯著降低，并漸趨平穩(wěn)。

既往的研究表明，高血糖會增強(qiáng)神經(jīng)纖維的氧化應(yīng)激，隨之而來的炎性反應(yīng)會影響雪旺氏細(xì)胞的結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子和傷害性感覺神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[13]。因此，在某種程度上，糖尿病所致的神經(jīng)疼痛和神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)痛具有一些潛在相似的機(jī)制和特性。在1型糖尿病神經(jīng)痛大鼠中，和坐骨神經(jīng)損傷模型(SNI)相似，脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞的激活也促進(jìn)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的敏化并參與了疼痛的發(fā)生[13,14]；在SNI模型中，脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化同樣也參與了糖尿病神經(jīng)痛[15-17]。因此，有必要進(jìn)一步研究糖尿病神經(jīng)痛中脊髓背角基因表達(dá)的差異，為進(jìn)一步明確其機(jī)制提供參考。

在此次研究中，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序明確了1型糖尿病神經(jīng)痛大鼠腰膨大處的脊髓背角中共有42個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了上調(diào)，有51個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了下調(diào)。在上調(diào)的基因中，S100鈣結(jié)合蛋白A11(S100 calcium binding protein A11，S100a11)是S100家族重要成員之一，可以調(diào)節(jié)酶活性、調(diào)控炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡等[18]。Yuan等[19]通過蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提示，S100a11參與了肩袖損傷和肩痛的發(fā)生，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶2(Hmgcs2)為酮體生成的關(guān)鍵酶，主要存在于肝臟、腎臟及神經(jīng)細(xì)胞等的線粒體中[20]。現(xiàn)有的研究表明[21]，背根神經(jīng)節(jié)中的Hmgcs2參與了阿片類藥物誘導(dǎo)的痛覺過敏，干預(yù)Hmgcs2的表達(dá)可以在一定水平上緩解芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏的發(fā)生。其在DNP中的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

為了檢驗(yàn)差異表達(dá)的基因是否富集于某些功能中，我們進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)在DNP中，差異基因的改變可能與?；姿崦富钚?、MHC蛋白復(fù)合物和MHC Ⅰ類蛋白復(fù)合物的功能相關(guān)。近年來，多篇文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了MHC在神經(jīng)病理性痛[22]、骨癌痛[23,24]中的重要作用，包括：在小鼠SNI模型的脊髓背角中MHC-I的表達(dá)顯著增高，進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)元的興奮性而降低其異質(zhì)性，加劇了疼痛刺激[22]；骨癌通大鼠脊髓中的MHC-I的表達(dá)增加且與GABA能神經(jīng)元雙標(biāo)，抑制MHC-I的表達(dá)能緩解骨癌痛大鼠的痛覺過敏[23]。酰基磷酸酶活性與疼痛之間的關(guān)系尚缺乏研究。在KEGG富集分析中，差異表達(dá)的基因主要富集在5條通路上，分別是：抗原加工和提呈、氨基苯甲酸酯降解、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞黏附分子(CAM)和吞噬體。脊髓背角中這些通路所發(fā)生的變化與疼痛之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，脊髓背角在1型糖尿病神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究從整體上揭示了其中的差異基因以及功能，為后續(xù)研究提供參考和部分證據(jù)，但由于疼痛的發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，因此需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來揭示其機(jī)制。