王 玥,王建剛

(1山西醫(yī)科大學麻醉學院麻醉教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:2676083197@qq.com)

膿毒癥是由細菌等病原微生物侵入機體導致的全身性炎癥反應綜合征，而腸道是膿毒癥全身反應的啟動器官[1]。據(jù)報道，膿毒癥可激活Wnt/β-catenin信號通路并損傷腸黏膜機械屏障，大量炎癥因子釋放引起瀑布效應促進膿毒癥惡化[2,3]。右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)具有抗炎、保護腸道通透性和腸道屏障等功能[4]，但具體機制尚不明確。本研究擬探究DEX對腸源性膿毒癥產(chǎn)生保護作用的機制，對于臨床治療膿毒癥提供依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及分組

8～9周齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，SPF級，生產(chǎn)許可證號SCXK(晉)2019-0005。實驗前禁食24 h，不限飲水。按照隨機數(shù)字表法分為對照組、膿毒癥組和DEX組，每組20只。膿毒癥組和DEX組均以盲腸結扎穿孔法建立膿毒癥模型，DEX組腹腔注射DEX，對照組僅暴露盲腸，不做結扎及穿孔。

1.2 主要試劑

右美托咪定(200 μg/2 ml)，批號：210804BC，國藥準字：H20090248，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Wnt3a蛋白單克隆抗體、β-連環(huán)蛋白單克隆抗體、細胞周期蛋白D1單克隆抗體、閉合蛋白單克隆抗體以及閉鎖蛋白單克隆抗體均購自英國Abcam公司；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)IL-1β、TNF-α、IL-6試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 膿毒癥大鼠模型的建立

結扎盲腸并穿孔建立SD大鼠膿毒癥模型[1]。具體操作方法：腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉大鼠：切開腹壁，暴露盲腸，于回盲瓣的遠端(距盲腸尖端1 cm處)將盲腸用4-0絲線緊密結扎并用針穿刺造成腸道損傷，從損傷口輕輕擠壓擠出穿孔部位少許糞便，盡量保證擠出糞便量一致(直徑約為1 mm的小液滴)，完成后閉合手術切口。對照組僅暴露盲腸遠端，不做結扎、不穿孔。給予無菌生理鹽水溶液(24 ml/kg)皮下注射；模型建立成功后，DEX組即刻腹腔注射40 μg/kg DEX(8 ml/kg，5 μg/ml)，對照組以及膿毒癥組腹腔注射等體積的生理鹽水后使大鼠自然蘇醒。實驗期間不使用任何抗生素。

1.4 腸組織病理學觀察

分別于膿毒癥模型建立成功24 h后使用戊巴比妥鈉腹腔注射處死大鼠(每組5只)，手術切取空腸組織，甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。光學顯微鏡下觀察腸組織切片。

1.5 ELISA試劑盒檢測大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β的濃度

末次給藥后24 h，尾靜脈采血1.5 ml，3 000 r/min，4 ℃離心20 min后收集上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，包被后封閉、加樣、孵育酶標抗體(抗體稀釋比例均為1 ∶100)，加底物工作液、終止液，測量血清中炎癥因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)的濃度。

1.6 Western blot檢測大鼠腸組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、ZO-1、Occludin蛋白的表達量

將空腸組織蛋白(RIPA試劑提取)與上樣緩沖液(SDS)混合煮沸；電泳分離蛋白樣品；凝膠轉至聚偏氟乙烯膜；膜在室溫下加脫脂奶粉封閉；加入一抗：兔抗Wnt3a單克隆抗體、兔抗β-catenin單克隆抗體、兔抗Cyclin D1單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體，兔抗ZO-1單克隆抗體、兔抗Occludin單克隆抗體(稀釋比例均為1 ∶4 000)，冰箱冷藏孵育過夜；加入山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，化學發(fā)光法顯色，灰度值分析后得到各蛋白相對表達水平。

1.7 免疫組化染色觀察大鼠腸組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1的表達

石蠟切片脫蠟至水；抗原修復；過氧化氫處理；牛血清白蛋白(BSA)封閉；加入一抗：兔抗Wnt3a單克隆抗體、兔抗β-catenin單克隆抗體、兔抗Cyclin D1單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體，兔抗ZO-1單克隆抗體、兔抗Occludin單克隆抗體(稀釋比例均為1 ∶200)；加入山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；復染細胞核；脫水封片；置于顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.8 統(tǒng)計學分析

計量資料符合正態(tài)分布，均以均值±標準差表示，使用SPSS24.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，以P<0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE染色觀察腸黏膜病理學表現(xiàn)

HE染色檢查結果顯示，對照組大鼠腸黏膜完整，絨毛結構排列規(guī)律且緊密，不存在腸黏膜損傷；膿毒癥組腸組織結構混亂，存在嚴重的黏膜絨毛水腫和上皮細胞脫落以及中性粒細胞浸潤；與膿毒癥組比較，DEX組可見腸道病理損傷明顯改善，組織水腫得到顯著改善，絨毛排列較為整齊，腸道黏膜屏障較好，中性粒細胞浸潤明顯減少(見圖1)。

圖1 各組大鼠腸道黏膜病理學變化 (×200)Figure 1 HE staining of intestinal mucosa in each group (×200)

2.2 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度結果

與對照組相比，膿毒癥組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平增高(P<0.01)；與膿毒癥組相比，DEX組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.01，見表1)。

表1 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度 (pg/ml，n=20)

2.3 Western blot檢測各組大鼠腸黏膜組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、ZO-1、Occludin蛋白表達結果

與對照組相比，膿毒癥組大鼠腸黏膜組織β-catenin、Cyclin D1、Wnt3a的蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，ZO-1和Occludin蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)；與膿毒癥組相比，DEX組大鼠腸黏膜組織β-catenin、Cyclin D1、Wnt3a的蛋白表達水平均明顯降低(P<0.01)，ZO-1和Occludin蛋白表達水平明顯增高(P<0.01，見圖2)。

與對照組比較，**P<0.01;與膿毒癥組比較，##P<0.01圖2 大鼠腸道組織Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、ZO-1、Occludin蛋白表達Figure 2 Expression of Wnt3a, β-catenin, Cyclin D1, ZO-1 and Occludin in rat intestinal tissue

2.4 免疫組化染色各組大鼠腸黏膜組織Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達結果

免疫組化法觀察顯示，Wnt3a蛋白主要位于細胞質(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(呈深褐色)，β-catenin蛋白主要位于細胞質(zhì)和細胞骨架中(呈黃褐色)，Cyclin D1蛋白主要位于細胞質(zhì)中(呈黃褐色,見圖3)。與對照組比較，膿毒癥組腸黏膜組織Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)；與膿毒癥組相比，DEX組腸黏膜組織β-catenin、Cyclin D1、Wnt3a表達水平均明顯降低(P<0.01，見圖4)。

圖3 大鼠腸組織Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達結果 (×400)Figure 3 Expression of Wnt3a, β-catenin and Cyclin D1 in rat intestinal tissue (×400)

與對照組比較，**P<0.01；與膿毒癥組比較，##P<0.01圖4 免疫組化染色檢測各組大鼠腸組織Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達Figure 4 Immunohistochemical staining of Wnt3a, β-catenin and Cyclin D1 protein expression in the intestinal tissues of rats in each group

3 討論

膿毒癥是國內(nèi)外重癥醫(yī)學界研究的熱點問題。世界衛(wèi)生組織2017報告中指出年全世界有4 800萬例膿毒癥病例和1 100萬例膿毒癥相關的死亡，占全球死亡總數(shù)的近20%。全世界大約85%的膿毒癥病例發(fā)生在低收入和中等收入國家。腸道作為人體內(nèi)最大細菌貯存的場所，在膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。機體健康的情況下，腸道內(nèi)的細菌無損害作用；腸黏膜被損害時，細菌遷移進入腸系膜及其淋巴組織甚至血液中，引發(fā)全身性的膿毒癥[5]。因此，腸黏膜屏障的結構及功能至關重要，保護其完整性可緩解腸源性膿毒癥的癥狀，改善預后[6]。

膿毒癥發(fā)生時內(nèi)毒素入血，刺激血液中的炎性細胞分泌炎癥因子，這些因子一方面可對機體的組織細胞產(chǎn)生炎性損傷；另一方面，可進一步刺激機體產(chǎn)生更多的炎癥因子，最終導致“瀑布效應”，這種惡性循環(huán)進一步導致膿毒癥惡化[7]。而Wnt/β-catenin信號通路可調(diào)控炎癥因子釋放，并有研究證實抑制Wnt/β-catenin信號通路中Wnt3a、β-catenin和cyclin D1蛋白的表達可以降低TNF-α等炎性因子的產(chǎn)生，緩解膿毒癥所導致的機體器官損傷[2，8]。大量文獻及臨床研究表明，DEX的抗炎等作用對膿毒癥的治療具有積極意義[9]。本實驗HE染色結果證明膿毒癥組大鼠腸道組織結構混亂，存在嚴重的黏膜絨毛水腫，上皮細胞脫落，中性粒細胞浸潤。與膿毒癥組比較，DEX組可見腸道組織水腫減輕，絨毛排列較為整齊，腸道病理損傷明顯緩解。同時本研究ELISA結果與文獻中[10]DEX對膿毒癥釋放炎癥因子的調(diào)控作用結果一致，即與膿毒癥組相比，DEX組TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低，DEX可有效減少促炎因子的釋放，從而改善膿毒癥預后。

本實驗同時對Wnt/β-catenin信號通路與緊密連接蛋白進行了檢測，探討在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中DEX是否會通過影響Wnt/β-catenin信號通路與緊密連接蛋白緩解膿毒癥癥狀。Western blot檢測結果和免疫組化染色結果共同提示：與對照組相比，膿毒癥組大鼠腸黏膜中Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1的蛋白表達水平顯著升高；與膿毒癥組相比，腹腔注射DEX的大鼠腸黏膜中Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1的蛋白表達水平明顯降低。表明DEX可能參與并抑制了Wnt/β-catenin信號通路，從而減少了炎性因子的表達，發(fā)揮對腸黏膜的保護作用。

在腸源性膿毒癥導致機體應激時，細胞間的連接遭到破壞，腸黏膜屏障功能缺失，細菌經(jīng)過細胞旁間隙進入機體，這將促進膿毒癥的發(fā)展進程[11]。腸黏膜細胞與細胞間的常見連接方式有緊密、黏附、縫隙連接等[12]。ZO-1是緊密連接結構的骨架成分，Occludin在維持緊密連接屏障中起關鍵作用，研究表明，在體內(nèi)和體外腸上皮細胞中，Occludin的缺失將導致大分子的選擇通透性增加[13，14]，造成腸道屏障功能損傷。本實驗Western blot檢測結果提示：與對照組相比，膿毒癥組大鼠腸黏膜中ZO-1蛋白和Occludin蛋白表達水平顯著降低，與膿毒癥組相比較，DEX組大鼠腸黏膜中ZO-1蛋白和Occludin蛋白表達水平明顯升高。表明DEX參與促進緊密連接蛋白的表達，證實了DEX的腸道黏膜保護作用。

綜上所述，本實驗初步證明膿毒癥大鼠腸損傷有Wnt/β-catenin信號通路參與，DEX參與并抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而發(fā)揮對腸道的保護作用，并調(diào)控相關炎癥介質(zhì)的釋放。同時，DEX對緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的調(diào)控作用，可改善腸道黏膜屏障的完整性，并抑制內(nèi)毒素和細菌的移位。因此得出結論，右美托咪定通過Wnt/β-catenin信號通路及緊密連接蛋白對膿毒癥腸黏膜屏障損傷產(chǎn)生保護作用，這對于臨床治療膿毒癥具有積極意義。