望雪雪,劉寧寧,王?，?張莉蕓,高晉芳,溫曉婷,郭瑞團(tuán),和 平,任麗民,高文琴,張麗中,張改連,2*

(1山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，山西白求恩醫(yī)院，山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，同濟(jì)山西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，太原 030032；2山西醫(yī)科大學(xué)第五醫(yī)院，山西省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；*通訊作者,E-mail:13754820091zgl@sina.com)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病，其病理特點(diǎn)為大量炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致滑膜增生、血管翳形成，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞[1]。破骨細(xì)胞異常活化介導(dǎo)的骨侵蝕在RA骨破壞中發(fā)揮重要作用。核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)與表達(dá)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK配體(RANK ligand，RANKL)結(jié)合，可促進(jìn)破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞分化成熟和活化，是破骨細(xì)胞存活、分化、激活過程中的主要介質(zhì)。骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)是調(diào)節(jié)RANKL-RANK信號的兩種主要蛋白。OPG是RANKL的誘導(dǎo)受體，可以阻斷RANKL-RANK信號，減少破骨細(xì)胞的產(chǎn)生。在RA患者滑膜組織中RANKL/OPG比值明顯增加，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞過度分化、激活，引起骨質(zhì)破壞[2]。TRAF6是一種銜接分子，在RANKL-RANK信號通路的初始階段被招募，并通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、NF-κB和活化蛋白-1(AP-1)介導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化[3,4]。

臭氧(ozone，O3)具有抑制病原微生物、激活氧代謝、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用，且副作用小[5]，被廣泛用于治療各種疾病，如病毒性疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、退行性病變、風(fēng)濕性疾病/關(guān)節(jié)炎、艾滋病等[6]。RA動物模型的研究表明，經(jīng)O3處理可減輕關(guān)節(jié)炎癥，抑制促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-6)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，此外還可重建細(xì)胞氧化還原平衡[7-10]。目前臭氧治療對RA骨破壞的作用及其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。我們的前期研究顯示，O3關(guān)節(jié)腔注射可延緩CIA大鼠的關(guān)節(jié)影像學(xué)進(jìn)展，降低血清RANKL水平及RANKL/OPG比值[11]，由此推測O3治療也可能通過影響骨代謝等非炎癥靶向機(jī)制發(fā)揮治療RA的作用。本研究采用O3關(guān)節(jié)腔注射對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠進(jìn)行干預(yù)，評估其對關(guān)節(jié)滑膜組織的影響，檢測各組CIA大鼠滑膜組織TRAF6蛋白的表達(dá)，以及滑膜組織、淋巴結(jié)、脾臟組織中RANKL、OPG、RANKL/OPG和TRAF6 mRNA水平，從破骨細(xì)胞相關(guān)分子角度探討臭氧治療RA骨破壞的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 所有實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)步驟均按照山西醫(yī)科大學(xué)動物護(hù)理和使用委員會指南進(jìn)行。健康雌性Wistar大鼠40只(年齡7周左右，體質(zhì)量160～180 g)，飼養(yǎng)條件：20 ℃室溫，50%相對濕度，定時喂食，自由攝水，光照周期(8 h光線和16 h黑暗)。

1.1.2 主要試劑與儀器 牛Ⅱ型膠原蛋白：Sigma公司(美國)。完全弗氏佐劑(CFA)：Sigma公司(美國)。TRAF6單克隆抗體：Abcam有限公司(美國)。Rotor-Gene SYBR Green PCR試劑盒：Qiagen公司(德國)。醫(yī)用臭氧發(fā)生儀：赫爾曼公司(德國)。X射線攝影設(shè)備：美國飛利浦公司。LEICA RM-2235型切片機(jī)：LEICA公司(德國)。Image-ProPlus 5.1圖形軟件分析系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司。Olympus BX41照相顯微鏡：美國Media Cybernetics公司。Rotor-Gene Q實(shí)時熒光定量PCR儀：QIAGEN公司(德國)。

1.2 方法

1.2.1 CIA大鼠模型的制備 大鼠被隨機(jī)分為正常對照組(n=8)和模型組(n=32)，CIA模型的制備參照以往文獻(xiàn)[12]。牛Ⅱ型膠原蛋白在0.1 mol/L的冰乙酸中溶解，濃度為2 mg/ml，在4 ℃冰箱過夜，用完全弗氏佐劑(CFA)等量乳化。制成含牛Ⅱ型膠原1 mg/ml的乳化液。用5%的水合氯醛5 ml/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，初次免疫分別在大鼠背部3點(diǎn)(上背部2點(diǎn)、下背部1點(diǎn))、尾根部和任一后足掌皮內(nèi)注射乳化液共0.5 ml(含牛Ⅱ型膠原0.5 mg)。加強(qiáng)免疫于1周后在大鼠腹腔注射0.2 ml乳化液(含牛Ⅱ型膠原蛋白0.2 mg)，誘導(dǎo)建立CIA模型。正常對照組注射等量0.9%氯化鈉注射液。32只雌性大鼠中24只成功建立CIA模型。

1.2.2 分組及干預(yù)方案 造模成功的24只大鼠被隨機(jī)分為3組(8只/組)：CIA模型組(CIA組)、甲氨蝶呤組(MTX組)和臭氧組(O3組)。CIA組指造模成功且未注射任何藥物的CIA大鼠；MTX組給予腹腔注射甲氨蝶呤(MTX)0.9 mg/kg，每周1次，連續(xù)3周；O3組在大鼠后足雙踝關(guān)節(jié)局部注射O3(40 μg/ml)1 ml，每周1次，連續(xù)3周[2]。正常對照組和CIA組不予以任何藥物處理。

1.2.3 滑膜、淋巴結(jié)及脾臟組織標(biāo)本的來源及處理 各組Wistar大鼠在初次免疫后第5周時腹腔注射5%的水合氯醛(5 ml/kg)麻醉，采用頸椎脫位法處死，解剖獲取新鮮雙踝關(guān)節(jié)滑膜、淋巴結(jié)和脾臟。一部分組織浸泡在4%多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋進(jìn)行免疫組化檢測；另一部分在液氮中儲存以便進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.2.4 免疫組化檢測雙踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TRAF6蛋白的表達(dá) 滑膜組織經(jīng)冰凍石蠟包埋后，用切片機(jī)切成5 μm切片，黏附于清潔載玻片上，放置在烤箱30 ℃恒溫干燥4 h以上。石蠟切片在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液中分梯度脫蠟各10 min，3% H2O2室溫下孵育10 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性?？乖迯?fù)，4 ℃過夜，然后用抗TRAF6單克隆抗體室溫孵育40 min，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗后，切片與聚合物輔助劑孵育20 min，PBS沖洗，滴加羊抗兔IgG多聚體抗體在37 ℃孵育30 min后用PBS洗滌，用二氨基聯(lián)苯胺沖洗切片，然后用清水反復(fù)沖洗，蘇木精染色，脫水封片，在光學(xué)照相顯微鏡上獲取放大200倍的圖像，并使用Image-ProPlus 5.1軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 RT-PCR檢測雙踝關(guān)節(jié)滑膜組織、淋巴結(jié)、脾臟組織中RANKL、OPG、TRAF6 mRNA表達(dá)水平 用RT-PCR技術(shù)檢測各組CIA大鼠雙踝關(guān)節(jié)滑膜、淋巴結(jié)、脾臟組織中RANKL、OPG、TRAF6 mRNA表達(dá)水平。總RNA提取過程如下：用Trizol試劑對組織樣品裂解，裂解液在12 000 r/min和4 ℃下離心15 min。用苯酚-氯仿混合物從上清液中提取RNA，用異丙醇沉淀，7 500 r/min,4 ℃離心5 min，棄上清。將RNA沉淀重新溶解在焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過的水中，瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA。利用Primer 3.0軟件設(shè)計PCR引物，序列見表1。RT-PCR采用Rotor-Gene SYBR Green PCR試劑盒，在Rotor-Gene Q實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)分析。

表1 引物名稱及序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；若不符合正態(tài)分布，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，兩樣本比較用Man-whttey檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 O3治療可抑制CIA模型大鼠雙踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TRAF6蛋白表達(dá)

免疫組化分析顯示，在各組大鼠滑膜組織中TRAF6為胞漿型表達(dá)；正常對照組大鼠滑膜組織可見2～3層滑膜細(xì)胞，核周淡黃色著色，TRAF6呈陰性表達(dá)(見圖1A)；CIA模型組大鼠滑膜組織可見20～30層滑膜細(xì)胞，顯示滑膜增生，核周胞漿彌漫分布深褐色著色，TRAF6呈強(qiáng)陽性表達(dá)(見圖1B)；O3治療組大鼠滑膜組織可見2～3層滑膜細(xì)胞，幾乎接近正常的滑膜組織，胞漿呈藍(lán)色染色，TRAF6呈近似陰性表達(dá)(見圖1C)；MTX治療組大鼠滑膜組織可見4～6層滑膜細(xì)胞，增生較CIA組減輕，胞漿呈褐色著色，TRAF6呈弱陽性表達(dá)(見圖1D)。經(jīng)O3和MTX治療后，TRAF6表達(dá)水平明顯下降，表現(xiàn)為陽性免疫染色區(qū)域面積減少且染色變淺。以上結(jié)果表明，與MTX作用相似，O3治療可抑制CIA模型大鼠滑膜組織中TRAF6蛋白表達(dá)。

A.正常對照組 B.CIA模型組 C.O3組 D.MTX組圖1 免疫組化檢測大鼠滑膜組織TRAF6的表達(dá) (蘇木精染色，×200)Figure 1 Expression of TRAF6 in synovial tissue of rats by immunohistochemical staining (hematoxylin staining,×200)

2.2 O3治療可抑制雙踝關(guān)節(jié)滑膜組織、淋巴結(jié)和脾臟組織中RANKL、TRAF6 mRNA表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對照組相比，CIA組大鼠滑膜、淋巴結(jié)、脾臟組織中RANKL、TRAF6 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，O3組和MTX組大鼠滑膜、淋巴結(jié)、脾臟組織中RANKL、TRAF6 mRNA的表達(dá)水平均顯著低于CIA組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，O3組與MTX組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖2，圖3)。

與正常對照(Con)組比較，*P<0.05；與CIA組比較，#P<0.05圖2 不同組織中RANKL mRNA表達(dá)水平Figure 2 The expression levels of RANKL mRNA in different tissues

與正常對照組(Con)比較，*P<0.05；與CIA組比較，#P<0.05圖3 不同組織中TRAF6 mRNA表達(dá)水平Figure 3 The expression levels of TRAF6 mRNA in different tissues

CIA組大鼠脾臟組織中OPG mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對照組(P<0.05)，O3組和MTX組大鼠脾臟組織中OPG mRNA的表達(dá)水平均顯著低于CIA組(P<0.05)，而在滑膜和淋巴結(jié)中各組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05，見圖4)。O3組RANKL/OPG比值在滑膜和淋巴結(jié)中顯著低于CIA組(P<0.05)，與MTX組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖5)。這些結(jié)果表明，與MTX治療效果相似，O3關(guān)節(jié)腔注射可能通過下調(diào)CIA大鼠關(guān)節(jié)局部和免疫系統(tǒng)RANKL、RANKL/OPG水平，抑制TRAF6表達(dá)，介導(dǎo)骨破壞。

與正常對照組(Con)比較，*P<0.05；與CIA組比較，#P<0.05圖4 不同組織中OPG mRNA表達(dá)水平Figure 4 The expression levels of OPG mRNA in different tissues

與正常對照組(Con)比較，*P<0.05；與CIA組比較，#P<0.05圖5 不同組織中RANKL/OPG水平Figure 5 The levels of RANKL /OPG in different tissues

3 討論

MTX是治療RA的一線用藥，其作用機(jī)制多樣，包括抑制嘌呤和嘧啶的合成，促進(jìn)腺苷和一些細(xì)胞因子的釋放，抑制ROS，降低RANKL/OPG比率等，但長期使用可能會引起病理性多器官毒性，包括胃腸道毒性、肺間質(zhì)纖維化，骨髓毒性、心臟毒性、腎毒性和肝毒性，從而限制了其治療潛力[13,14]。研究表明精確治療劑量的O3可以使人體產(chǎn)生適度的氧化應(yīng)激，激活抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，發(fā)揮抗炎作用且無明顯副作用，被用于治療RA、纖維肌痛綜合征等自身免疫病中[15]。有臨床研究顯示MTX聯(lián)合O3治療RA患者比MTX單藥治療更能降低疾病的活動度[16]。國內(nèi)外對O3治療CIA大鼠的研究主要集中于相關(guān)炎癥因子水平的探討[6,8,9,17]。研究發(fā)現(xiàn)O3關(guān)節(jié)腔注射可抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)滑液中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-12的產(chǎn)生，促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生，改善CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥，且多次O3關(guān)節(jié)腔注射比單次應(yīng)用更加有效[6]。O3關(guān)節(jié)腔注射可減輕RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹及關(guān)節(jié)損傷，降低RA大鼠脾臟、滑膜組織中TNF-α水平[8,9]。另一項(xiàng)由弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中也有類似發(fā)現(xiàn)，O3關(guān)節(jié)腔注射可改善大鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀及組織病理學(xué)表現(xiàn)[17]。目前，O3對RA骨破壞的作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)O3關(guān)節(jié)腔注射可延緩CIA大鼠的關(guān)節(jié)影像學(xué)進(jìn)展，降低血清RANKL及RANKL/OPG比值，與MTX療效相當(dāng)[11]。本研究進(jìn)一步證實(shí)O3關(guān)節(jié)腔注射可以減輕CIA大鼠的滑膜增生，降低CIA大鼠滑膜組織、淋巴結(jié)中RANKL、TRAF6及RANKL/OPG水平，降低脾臟組織中RANKL、TRAF6、OPG水平，且與MTX作用相當(dāng)，這一發(fā)現(xiàn)為臭氧治療RA相關(guān)骨侵蝕的機(jī)制提供了依據(jù)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)O3治療可抑制CIA模型大鼠滑膜組織增生，降低滑膜組織、淋巴結(jié)和脾臟RANKL的mRNA表達(dá)水平，且療效與MTX治療相當(dāng)。RANKL在破骨細(xì)胞分化中起著重要作用，它的表達(dá)升高可預(yù)測局部骨侵蝕和骨質(zhì)疏松的發(fā)生[4]。因此，抑制RANKL表達(dá)可能是一種預(yù)防RA模型大鼠骨丟失的潛在治療策略[18]。有報道稱，抗炎治療可抑制RANK/RANKL軸[19]，IL-27可通過影響RANKL信號抑制破骨細(xì)胞的生成[20]。因此，我們推測RANKL抑制骨破壞可能是通過抗炎作用引起的。目前以炎癥因子為靶點(diǎn)的多種生物制劑，如英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗、托珠單抗等，它們在抑制炎癥的同時還可以延緩骨破壞，這可能進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。OPG可通過競爭性結(jié)合可溶性RANKL來抑制破骨細(xì)胞的形成[21]。正常情況下，RANKL和OPG表達(dá)的平衡可維持正常骨代謝；但在RA滑膜組織中，RANKL和OPG表達(dá)失衡[2]。本研究顯示O3治療可降低滑膜和淋巴結(jié)RANKL/OPG比值和脾臟OPG mRNA表達(dá)，提示O3治療可重建CIA模型大鼠滑膜微環(huán)境和免疫系統(tǒng)的RANKL/OPG平衡，這可能為O3延緩RA關(guān)節(jié)破壞及骨侵蝕的機(jī)制提供線索。

TRAF6是RANKL/RANK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK及其前體細(xì)胞結(jié)合，誘導(dǎo)TRAF6與RANK的特定位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而啟動下游信號，激活細(xì)胞內(nèi)MAPKs、NF-κB和AP-1，導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化和激活[4]。RA患者滑膜組織中TRAF6的表達(dá)與血清骨形成指數(shù)(I型膠原N端前肽)、骨轉(zhuǎn)換指數(shù)(骨鈣素N端中間片段)以及滑膜炎癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。此外，滑膜組織中TRAF6的表達(dá)促進(jìn)了滑膜炎癥細(xì)胞的浸潤及促炎細(xì)胞因子的分泌。這些證據(jù)表明，TRAF6不僅影響骨代謝，還可參與RA的炎癥反應(yīng)[22-25]。因此，TRAF6可能成為治療RA的潛在靶點(diǎn)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)O3治療降低了CIA模型大鼠滑膜、淋巴結(jié)和脾臟組織中TRAF6 mRNA的表達(dá)，且TRAF6 mRNA表達(dá)降低與滑膜增生減低有關(guān)。

骨免疫學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)RANKL/OPG-TRAF6信號通路可調(diào)節(jié)疾病相關(guān)的骨代謝紊亂和免疫異常[26,27]，在RA中存在相似的調(diào)控機(jī)制。針對RA骨免疫學(xué)角度的靶向治療藥物，將大大提高RA的療效并改善預(yù)后。總之，這一系列證據(jù)表明，O3治療可能通過RANKL/OPG-TRAF6信號通路來抑制CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥和骨破壞，有望成為RA的一種可選擇的新的治療方法。但本研究尚未探究不同濃度O3對CIA大鼠破骨細(xì)胞相關(guān)分子的作用，O3關(guān)節(jié)腔注射對CIA大鼠破骨細(xì)胞相關(guān)分子的作用是否具有劑量依賴性？這需要進(jìn)一步的研究。