張偉東 張偉威 黨曉健 魏穎 王莉 李靜 王娜

胸腺作為免疫系統(tǒng)的主要調(diào)控器官，功能狀態(tài)直接決定機(jī)體細(xì)胞免疫功能，此外還有維持自身免疫、免疫調(diào)節(jié)及屏障保護(hù)等功能。胸腺本身也極易受到損害，眾多引起胸腺衰老因素中，年齡是公認(rèn)的主要因素，即“胸腺增齡性萎縮(age-related thymic involation)”[1]。但實(shí)際臨床工作中放化療藥物通常被認(rèn)為是損害胸腺最大因素，通過胸腺雙陽性T細(xì)胞巨大殺傷性作用，使胸腺細(xì)胞大量死亡與空竭，這也是引起胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，直接引起T細(xì)胞生存環(huán)境受損的主要因素[2]。最終引起免疫系統(tǒng)自我修復(fù)能力顯著降低，最終引起此類患者感染及腫瘤復(fù)發(fā)率高于普通人群，甚至引發(fā)嚴(yán)重感染或二次腫瘤。脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)屬干細(xì)胞家族，源于發(fā)育早期中胚層/外胚層，屬多能干細(xì)胞，具備多分化潛能。ADSCs在全身脂肪組織均有分布，臨床可通過吸脂手術(shù)獲得，取材簡(jiǎn)便，創(chuàng)傷小。研究發(fā)現(xiàn)ADSCs因其多分化潛能生物特性廣泛應(yīng)用于臨床治療，如自體ADSCs軟組織缺損修復(fù)，在心肌缺血及神經(jīng)退行性病變治療應(yīng)用等[3]。既往不斷有研究證實(shí)ADSCs對(duì)經(jīng)放化療照射小鼠胸腺上皮細(xì)胞有再生修復(fù)增殖作用[4]，但迄今缺乏相關(guān)機(jī)制報(bào)道及體外人體細(xì)胞模型相關(guān)研究。因此，本研究基于ADSCs生物學(xué)特性及既往臨床應(yīng)用研究基礎(chǔ)，以人脂肪源ADSCs作為體外細(xì)胞研究模型，觀察其對(duì)化療損傷后胸腺上皮細(xì)胞增殖修復(fù)作用并對(duì)其進(jìn)行機(jī)制探討，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞標(biāo)本來源:提取細(xì)胞脂肪組織由我院普外科手術(shù)切除廢棄脂肪組織提供，用含硫酸慶大霉素0.9%氯化鈉溶液充分沖洗切除組織后放置PBS液中，于 30 min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。入選供體均知情同意并簽署知情同意書，獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠胸腺上皮細(xì)胞源于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫教研室贈(zèng)送。

1.1.2 主要儀器與試劑:①儀器：恒溫飽和濕度CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂公司)，Rotor-Gene QPCR儀(德國(guó)凱杰公司)，熒光倒置顯微鏡(BX51，日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，旋渦離心機(jī)(北京醫(yī)療設(shè)備廠)，MUSE 細(xì)胞分析儀(德國(guó) Merk Millipore公司),Megafuge 離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)。②實(shí)驗(yàn)試劑：OPTI-MEM培養(yǎng)基/胎牛血清/胰蛋白酶/P/S雙抗(GIBCO公司)，PE anti-human CD34/FITC anti-human CD44(美國(guó)eBioscience 公司)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒/細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Merk Millipore 公司)，兔抗人GADPH多克隆抗體(康成生物工程公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔LgG (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，Real Master Mix (SYBR Green)(北京TIANGEN 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定:將脂肪組織放入無菌培養(yǎng)皿中，取出筋膜及血管。以剪刀將脂肪組織剪碎約1 mm3將其放入100 ml離心管中，25～35 ml/管，并加入Ⅰ型膠原酶并封閉處理。37℃水浴、離心、消化、離心、棄去上清，加入含15%胎牛血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至25 ml無菌培養(yǎng)瓶中，于37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后首次換液，以后2～3 d 換1次液。細(xì)胞貼壁80%～90%瓶底進(jìn)行細(xì)胞傳代(1∶2傳代)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好第3代細(xì)胞進(jìn)行消化離心，監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度并計(jì)數(shù)，調(diào)整至1×106個(gè)/ml，分裝至EP管，并加入CD44、CD34抗體孵育，用PBS緩沖液沖洗3次，棄上清，重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子，EXP032.V.1.2軟件分析。

1.2.2 siRNA 序列設(shè)計(jì):美國(guó)國(guó)立數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)查詢KGF序列。siRNA序列設(shè)計(jì)遵循序列大小19～21 nt，GC 含量在40%～60%；避免可能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域；從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始,搜尋下游AA序列,記錄跟每個(gè)AA3’端相鄰的 19 個(gè)核苷酸作為候選的 si RNA 靶位點(diǎn)等原則，使用BLAST進(jìn)行序列同源性分析，排除和其他編碼序列同源的序列，根據(jù)以上原則及Ambion公司siRNA target Designer 設(shè)計(jì)軟件，經(jīng)BLAST 對(duì)比后,提交序列給廣東瑞博公司分別合成靶向 KGF 基因的KGF-si RNA NC-si RNA及熒光標(biāo)記的 NC-si RNA。

1.2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染、篩選最佳KGF-siRNA濃度:選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)人脂肪源ADSCs細(xì)胞，PBS反復(fù)沖洗，胰酶消化將細(xì)胞數(shù)控制在1×105個(gè)/ml，取2ml接種至6孔板放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別制備AB液并室溫下孵育30 min加入對(duì)應(yīng)6孔板中，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后吸出上清液，更換為DMEM培養(yǎng)基2 ml,放回培養(yǎng)箱中以RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)。KGF-siRNA濃度分組：20 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L及100 μmol/L。

1.2.4 成脂誘導(dǎo)并增殖曲線分析:選取第3代人脂肪源ADSCs，以胰蛋白酶消化接種至6孔板中，細(xì)胞濃度1×105個(gè)/孔，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。貼壁后將培養(yǎng)基更換為成脂細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，換液培養(yǎng)2周后將細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色證實(shí)細(xì)胞中是否有脂滴形成。

1.2.5 FITC-Brdu測(cè)定人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將人脂肪源ADSCs分為脂肪干細(xì)胞沉默組、脂肪干細(xì)胞未沉默組及單純胸腺上皮增殖組。將3組細(xì)胞種植于Transwell小室下層，12 h后可以看到脂肪干細(xì)胞基本完全貼壁，將人的胸腺上皮細(xì)胞種植與小室的上層，將小室放于培養(yǎng)箱培內(nèi)培養(yǎng)，測(cè)定胸腺上皮細(xì)胞增殖情況(主要測(cè)第1、2、3天)。

2 結(jié)果

2.1 人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定 將從脂肪組織分離出來的人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，顯微鏡下觀察到大量脂滴，可見少量紅細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，接種48 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)可呈棒槌狀，部分細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)形似纖維狀，72 h后細(xì)胞逐漸分離、融合成單層成簇分布。應(yīng)用ADSCs表面抗原測(cè)定提示表面抗原CD44陽性率93.0%,CD34呈0.405%，確定為ADSCs細(xì)胞。見圖1、2。

圖1 ADSCs種植第1天及第3天

圖2 ADSCs 流式細(xì)胞圖；A CD44；B CD34

2.2 KGF-siRNA 轉(zhuǎn)染、濃度篩選、下游蛋白表達(dá)

2.2.1 KGF-si RNA轉(zhuǎn)染、濃度篩選:RT-PCR比較 KGF-siRNA轉(zhuǎn)染ADSCs后KGF表達(dá)，證實(shí)KGF-siRNA-2轉(zhuǎn)染ADSCs中KGF表達(dá)下降了81.88%，干擾效果明顯且與KGF-siRNA-1,空質(zhì)粒組及未轉(zhuǎn)染組比較存在顯著差異(P<0.001)。KGF-siRNA-2分0.1 μg,0.3 μg,0.5 μg,1.0 μg濃度進(jìn)行人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染篩選最佳濃度，mRNA水平依次下降33.22%，46.60%，81.06%，42.35%，結(jié)果提示0.5 μg為KGF-siRNA最佳轉(zhuǎn)染濃度，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表1、2。

表1 篩選KGF-siRNA沉默質(zhì)粒最佳序列濃度 %

表2 KGF-siRNA-2作用最佳濃度篩選比較

2.2.2 KGF-si RN-2轉(zhuǎn)染對(duì)下游蛋白表達(dá)影響:KGF-siRNA 0.5 μg轉(zhuǎn)染48 h/72 h，比較沉默組、空白組及空質(zhì)粒組下游蛋白表達(dá)差異。結(jié)果提示沉默組下游蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照及空質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 不同時(shí)間、KGF-siRNA轉(zhuǎn)染前后下游蛋白表達(dá)比較

圖3 KGF-siRNA 0.5 μg轉(zhuǎn)染48、72 h，沉默組、空白組及空質(zhì)粒組下游蛋白表達(dá)

2.3 人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胸腺修復(fù)增殖影響

2.3.1 人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能測(cè)定:經(jīng)成脂誘導(dǎo)6 d后，通過倒置顯微鏡發(fā)現(xiàn)少量細(xì)胞胞漿且有圓形小顆粒，細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形，且脂滴逐漸增多。誘導(dǎo)12 d后細(xì)胞體積內(nèi)充滿圓形脂滴，應(yīng)用油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)存在紅色脂滴顆粒，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)仍呈梭形且胞質(zhì)內(nèi)無脂滴。結(jié)果提示人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞具備分化潛能，應(yīng)用Brdu測(cè)試KGF-siRNA干擾沉默后脂肪干細(xì)胞增殖情況，證實(shí)1～3 d內(nèi)增殖79.3%、93.7%、99.5%。

2.3.2 人胸腺上皮細(xì)胞增殖情況:應(yīng)用Brdu法測(cè)定沉默組、對(duì)照組及單純細(xì)胞組情況。證實(shí)對(duì)照組增殖顯著高于沉默組及細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表4。

表4 人胸腺上皮細(xì)胞增殖情況的測(cè)定

2.3.3 小鼠胸腺上皮細(xì)胞增殖情況:應(yīng)用Brdu法測(cè)定沉默組、對(duì)照組及單純細(xì)胞組情況。證實(shí)對(duì)照組增殖顯著高于沉默組及細(xì)胞組增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表5。

表5 小鼠胸腺上皮細(xì)胞增殖情況

2.4 胸腺上皮細(xì)胞增殖S期測(cè)定分析

2.4.1 人胸腺上皮細(xì)胞增殖S期測(cè)定分析：PI法測(cè)定3 d內(nèi)人胸腺上皮細(xì)胞增殖S期細(xì)胞增殖情況。證實(shí)對(duì)照組增殖顯著高于沉默組及細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 人胸腺上皮細(xì)胞增殖S期測(cè)定

2.4.2 小鼠胸腺上皮細(xì)胞增殖S期測(cè)定分析:PI法測(cè)定3 d內(nèi)小鼠胸腺上皮細(xì)胞增殖S期細(xì)胞增殖情況。證實(shí)對(duì)照組增殖顯著高于沉默組及細(xì)胞組增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

表7 小鼠胸腺上皮細(xì)胞增殖S期測(cè)定

3 討論

20世紀(jì)初通過體外培養(yǎng)ADSCs首次證實(shí)其可分泌一系列生長(zhǎng)因子進(jìn)入培養(yǎng)基，形成ADSCs條件培養(yǎng)基促進(jìn)組織細(xì)胞增殖[5]。目前已報(bào)道分泌細(xì)胞因子主要有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角質(zhì)生長(zhǎng)因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等[5-7]。作為公認(rèn)多分化潛能干細(xì)胞，可定向分化為中胚層各種細(xì)胞，已報(bào)道的有脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞[8]。有研究指出并證實(shí)放化療損傷胸腺損傷小鼠模型通過體外輸注ADSCs達(dá)到快速修復(fù)胸腺結(jié)構(gòu)與功能作用，從而改善了放化療后小鼠免疫能力及感染發(fā)生率，延長(zhǎng)了小鼠生存時(shí)間[9,10]。但相關(guān)機(jī)制研究及體外研究報(bào)道甚少。

人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose derived mesenchymal stem cells,hAD-MSC)多以人脂肪組織為供體，有著與ADSCs相似的多分化潛能、自我更新及高度繁殖的生物學(xué)特性[11]。同時(shí)hAD-MSC取材損害小、來源豐富、方便取材、活性持久。為保障實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系含量及純度，我們以CD34及CD44 分子進(jìn)行表面抗體鑒定[12]，為機(jī)制探討奠定研究基礎(chǔ)。成脂誘導(dǎo)6 d、14 d后，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞體積內(nèi)可見逐漸充滿圓形脂滴，油紅O染色體印證為紅色脂肪顆粒，證實(shí)hAD-MSC具備良好分化潛能。

角質(zhì)生長(zhǎng)因子是既往報(bào)道ADSCs旁分泌修復(fù)機(jī)制中主要分子，因?qū)俪衫w維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGFs)，也稱為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7(fibroblast growth factor 7,FGF-7)，本身有促進(jìn)小鼠角質(zhì)細(xì)胞有絲分裂作用[13]。KGF在胃腸、口腔黏膜、胸腺、肺、腎、膀胱、肝等器官損傷修復(fù)過程中起到重要作用[14]。KGF與KGFR信號(hào)途徑在胸腺間質(zhì)-上皮相互聯(lián)系作用提示KGF在胸腺細(xì)胞發(fā)育及成熟過程有重要作用[15]。即胚胎期KGF受體缺失小鼠因TEC缺乏增殖及分化能力而出現(xiàn)明顯胸腺生成障礙，伴胸腺細(xì)胞數(shù)量下降；與KGF受體缺失不同，KGF缺失小鼠表現(xiàn)正常胸腺發(fā)育正常，但經(jīng)照射后KGF缺失小鼠表現(xiàn)胸腺恢復(fù)能力下降，提示KGF是生后小鼠胸腺再生必須因素[16]。同時(shí)，KGF對(duì)胸腺增殖修復(fù)功能在老齡鼠萎縮胸腺中也得到證實(shí)，并發(fā)現(xiàn)有促進(jìn)成熟T細(xì)胞向外周免疫器官輸出的功能[17]。我們發(fā)現(xiàn)眾多證實(shí)KGF促進(jìn)胸腺上皮增殖修復(fù)功能機(jī)制研究中，多以在小鼠/大鼠作為在體研究模型，體外細(xì)胞模型研究較少[18]。本研究在KGF-siRNA成功轉(zhuǎn)染后，依次從RNA及下游蛋白表達(dá)證實(shí)經(jīng)小RNA轉(zhuǎn)染人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞KGF表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組及空質(zhì)粒組，且具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而空白對(duì)照組及空質(zhì)粒組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，小RNA沉默處理細(xì)胞下游蛋白水平表達(dá)同RNA水平表達(dá)變化一致，即低于空白對(duì)照組及空質(zhì)粒組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在眾多KGF參與胸腺上皮細(xì)胞修復(fù)機(jī)制報(bào)道中，KGF與其表達(dá)于TEC細(xì)胞上KGF受體結(jié)合促進(jìn)胸腺上皮增殖，同時(shí)這種受體-配體結(jié)合激活下游眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活對(duì)胸腺上皮增生、分化及發(fā)揮生理效應(yīng)極為重要[19-21]。本研究證實(shí)hAD-MSC通過KGF完成對(duì)放化療損傷胸腺萎縮細(xì)胞增殖。

綜上所述，我們充分證實(shí)hAD-MSC對(duì)萎縮胸腺上皮細(xì)胞有修復(fù)作用，通過KGF-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)其可簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確進(jìn)行hAD-MSC修復(fù)萎縮胸腺機(jī)制研究，該機(jī)制研究及明確為促進(jìn)hAD-MSC應(yīng)用于臨床治療，盡早改善放化療因素引起的患者萎縮細(xì)胞修復(fù)并改善免疫功能有重要臨床意義。