周紅敏 彭輝 成向榮 童冉 李求潔

(龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江·龍泉，323700)(百山祖國(guó)家公園龍泉保護(hù)中心)(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所)(龍泉市林業(yè)局)

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是生物圈能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)的驅(qū)動(dòng)者[1]，在土壤有機(jī)質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化、土壤養(yǎng)分循環(huán)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。微生物是地球上現(xiàn)存多樣性最多、分布最廣泛的生命形式，幾乎涉及到地球上的所有生境[3-5]。細(xì)菌作為土壤微生物重要的組成部分，對(duì)土壤養(yǎng)分的形成與植被凋落物分解有促進(jìn)作用[6-8]。土壤中的菌群不僅可以促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而且還能促進(jìn)植株的生長(zhǎng)[9-10]，而土壤中的氮磷鉀等營(yíng)養(yǎng)成分和pH等[11-13]也對(duì)菌群結(jié)構(gòu)影響較大。不同林齡對(duì)土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性等[14-17]也有重要影響。

紅豆樹(OrmosiahosieiHemsl. et Wils.)又稱鄂西紅豆樹、花梨木、花櫚木，是蝶形花科紅豆樹屬的常綠或半落葉喬木，為我國(guó)特有樹種，被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[18-19]。紅豆樹樹形優(yōu)美，葉色濃綠蒼翠，具有極高的景觀和森林文化價(jià)值；紅豆樹心材深褐色，堅(jiān)硬有光澤，切面光滑，且木材組織的色調(diào)和排列形成很別致的花紋，是上等家具、工藝雕刻、特種裝飾和鑲嵌的珍貴用材。近年來，浙江省珍貴彩色森林建設(shè)實(shí)施，紅豆樹作為珍貴鄉(xiāng)土樹種，在珍貴彩色森林建設(shè)中發(fā)揮重要作用。但目前對(duì)不同林齡紅豆樹與土壤微生物多樣性關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。因此，本文通過依諾米那平臺(tái)(Illumina Miseq)的測(cè)序技術(shù)，對(duì)中亞熱帶地區(qū)不同生長(zhǎng)過程中紅豆樹人工林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行分析，探討土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨著林齡變化規(guī)律及驅(qū)動(dòng)土壤細(xì)菌群落變化的主要環(huán)境因子，以期為紅豆樹人工林的培育和可持續(xù)經(jīng)營(yíng)提供技術(shù)支持。

1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)研究地點(diǎn)位于浙江省龍泉市蜜蜂嶺林區(qū)，該地區(qū)海拔252 m，屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候，年均降水量為1 647 mm，年均溫17.7 ℃，極端最高氣溫為41.5 ℃，極端最低氣溫為-8.5 ℃,年均相對(duì)濕度79%。年均無霜期為261 d。該林區(qū)森林資源豐富，主要分布有紅豆樹、杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.)、木荷(SchimasuperbaGardn. et Champ.)等。

2 研究方法

2.1 樣地設(shè)置和樣品采集

2020年5月，以空間代替時(shí)間的方法，在A(幼齡林，林齡7 a)、B(中齡林，林齡20 a)、C(成熟林，林齡45 a)3個(gè)林齡的紅豆樹人工林中各選取3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣地，面積為20 m×20 m，按照5點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣，去除地表枯枝落葉，取0～20 cm土層樣品，將5個(gè)樣點(diǎn)的土樣等量混合，去除土壤中植物根系等雜質(zhì)，分別標(biāo)記為A1、A2、A3；B1、B2、B3；C1、C2、C3。將土樣分為兩份，一份放入無菌自封袋中，放在冷藏箱內(nèi)4 ℃保存，并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，放入冰箱內(nèi)-80 ℃保存，用于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性測(cè)定；另一份風(fēng)干后過2 mm篩用于土壤理化性質(zhì)分析。

2.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

根據(jù)《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[20]，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用凱氏定氮法；全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用氫氧化鈉熔融--鉬銻抗比色法；全鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法；有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用重鉻酸鉀-外加熱法；速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用乙酸銨浸提-火焰光度法；有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用堿解擴(kuò)散法；pH采用電位法(V(土)∶V(水)=1∶2.5)測(cè)定。

2.3 土樣DNA(脫氧核糖核酸)測(cè)序和PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增測(cè)序

土壤總DNA提取采用美國(guó)Omega Bio-Tek公司的E.Z.N.A.? Soil DNA Kit試劑盒，在每個(gè)土壤樣品中稱取0.5 g，按照試劑盒說明書進(jìn)行抽提。用1%瓊脂糖凝脂電泳進(jìn)行DNA的完整性檢驗(yàn)，用Nano Drop2000檢測(cè)DNA的純度和濃度。用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGG)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行V4-V5區(qū)擴(kuò)增。PCR為20 μL的反應(yīng)體系，包括：5×Fast Pfu緩沖液和Fast Pfu緩沖液各4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板10 ng。ddH2O 20 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min預(yù)變性，9個(gè)循環(huán)(95 ℃ 30 s變性，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s)，最后72 ℃延伸10 min。通過Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

2.4 數(shù)據(jù)分析

使用fastp[21]軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH[22]軟件進(jìn)行拼接：使用UCHIME軟件剔除嵌合體，得到優(yōu)化序列[23]。使用Uparse軟件[24-25]對(duì)優(yōu)質(zhì)Effective Tags序列按照97%的相似度進(jìn)行運(yùn)算分類單位(OTUs)聚類分析，根據(jù)OTUs豐度信息，利用Mothur(1.30.2)軟件對(duì)樣品進(jìn)行多樣性分析。在門分類水平上統(tǒng)計(jì)細(xì)菌群落的組成。利用冗余分析(RDA)對(duì)土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落之間關(guān)系進(jìn)行評(píng)估。土壤理化性質(zhì)采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析，利用LSD法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤理化性質(zhì)

由表1可知，土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH在3個(gè)林齡間差異不顯著(P>0.05)。中齡林的土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，隨著林齡增加呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)；全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著種植年限的增加逐漸減少；中齡林土壤的pH值最小。全鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)在幼齡林土壤中最高，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在中齡林土壤中最大；全氮和速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著種植年限的增加而增大；有效磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3個(gè)林齡的土壤中顯著差異(P<0.05)，成熟林土壤中有效磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

表1 不同林齡紅豆樹土壤化學(xué)性質(zhì)

3.2 細(xì)菌高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

稀釋曲線是用來描述隨著樣品量的加大，可能檢測(cè)到的物種種類隨之增加的狀況，被廣泛應(yīng)用于判斷樣品量是否充分并估計(jì)物種豐度[4]。由圖1可知，3個(gè)林齡的9個(gè)土壤樣品的稀釋曲線均趨于平緩，說明測(cè)序數(shù)據(jù)合理，能夠較真實(shí)反映3個(gè)林齡紅豆樹林土壤中細(xì)菌群落組成，置信度高。

A．幼齡林，林齡7 a；B.中齡林，林齡20 a；C.成熟林，林齡45 a。

3.3 土壤細(xì)菌群落的α多樣性

由表2可知，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，9個(gè)土壤樣品中有效序列為463 169條，序列平均長(zhǎng)度為376 bp。各樣品的細(xì)菌Coverage指數(shù)均在0.99以上，說明測(cè)序結(jié)果能反映該樣品中細(xì)菌群落的真實(shí)情況。3個(gè)林齡的Shannon指數(shù)和Shannoneven指數(shù)均為成熟林最大，中齡林最小，但差異均不顯著。中齡林紅豆樹土壤中Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)均最低，說明中齡林土壤中細(xì)菌數(shù)量較少，但3個(gè)林齡間細(xì)菌數(shù)量差異不顯著。

表2 不同林齡土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)

3.4 細(xì)菌群落組成分析

由圖2a可知，3個(gè)不同林齡紅豆樹林土壤樣品中共檢測(cè)出31個(gè)細(xì)菌門，其中有27個(gè)細(xì)菌門在3個(gè)不同林齡紅豆樹林土壤樣品中共同存在，占總量的87.1%；3個(gè)不同林齡的土壤樣品中細(xì)菌門分別有29、29、30個(gè)。3個(gè)樣品中豐度超過1%的細(xì)菌門有7個(gè)，且優(yōu)勢(shì)菌門在3個(gè)樣品中的豐度大小排序一致。

由圖2b可知，3個(gè)不同林齡紅豆樹林土壤樣品中共檢測(cè)出96個(gè)細(xì)菌綱，其中有67個(gè)細(xì)菌綱在3個(gè)不同林齡紅豆樹林土壤樣品中共同存在，占總量的69.79%；3個(gè)不同林齡的土壤樣品中細(xì)菌綱分別有80、73、91個(gè)。3個(gè)不同林齡的土壤優(yōu)勢(shì)菌在細(xì)菌綱水平上排序略有不同。

圖2 門和綱水平下的細(xì)菌物種Venn圖

由表3可知，按照細(xì)菌豐度優(yōu)勢(shì)菌門由高到低的順序?yàn)椋鹤冃尉T(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、Myxococcota和擬桿菌門(Bacteroidetes)。成熟林土壤中變形菌門豐度顯著低于幼齡林和中齡林(P<0.05)。幼齡林土壤中放線菌門的豐度顯著低于中齡林和成熟林(P<0.05)。幼齡林土壤中浮霉菌門的豐度顯著高于中齡林和成熟林(P<0.05)；酸桿菌門、綠彎菌門、Myxococcota和擬桿菌門在各林齡間均差異不顯著。

優(yōu)勢(shì)菌綱主要有：酸桿菌綱(Acidobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、浮霉菌綱(Planctomycetes)、放線菌綱(Actinobacteria)、嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)。其中，酸桿菌綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌綱在3個(gè)林齡土壤中的排序相同，但纖線桿菌綱在3個(gè)林齡土壤中排序與其他3個(gè)綱不同。在菌綱水平上，幼齡林土壤中嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)豐度顯著低于中齡林和成熟林(P<0.05)，幼齡林土壤中浮霉菌綱豐度顯著高于中齡林和成熟林(P<0.05)。

表3 門和綱水平下不同林齡土壤優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度

林齡/a綱水平下優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的相對(duì)豐度/%酸桿菌綱α-變形菌綱纖線桿菌綱γ-變形菌綱浮霉菌綱放線菌綱嗜熱油菌綱7(21.73±1.92)a(20.95±2.16)a(12.92±3.59)a(9.61±2.65)a(8.02±0.62)a(6.54±0.44)a(4.17±1.24)b20(22.71±3.05)a(21.61±1.90)a(10.70±2.75)a(9.98±1.35)a(3.43±0.11)b(7.70±1.04)a(6.13±0.13)a45(20.45±2.08)a(19.64±1.53)a(14.35±1.65)a(8.72±0.83)a(3.53±0.70)b(7.63±0.11)a(5.77±0.52)a

3.5 土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖3可知，第一、二排序軸累計(jì)解釋率分別為49.36%和25.40%，兩者結(jié)合解釋為74.76%，具有顯著的生物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全鉀和速效鉀對(duì)第一排序軸的貢獻(xiàn)較大，速效鉀和全磷對(duì)第二排序軸貢獻(xiàn)較大。

由表4可知，土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)各優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落的影響不同，全鉀與放線菌門(Actinobacteria)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.683*)，有效磷、全磷與浮霉菌門(Planctomycetes)顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.75*和-0.667*)，速效鉀與浮霉菌門極顯著負(fù)相關(guān)(r為-0.82** )。

表4 不同林齡土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(門水平)相對(duì)豐度和土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)關(guān)系

TK-全鉀，TP-全磷，TN-全氮，AP-有效磷，AK-速效鉀，AN-堿解氮，OM-有機(jī)質(zhì)。

4 討論

本研究中，9個(gè)土壤樣品中共檢測(cè)到細(xì)菌有31個(gè)門、96個(gè)綱、221個(gè)目、531個(gè)科、1011個(gè)屬。變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)是豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌門，3者的細(xì)菌豐度為結(jié)論中說68.4%～69.4%，與顧松松等[26]對(duì)茶園土壤細(xì)菌群落的研究結(jié)果相同，變形菌門(Proteobacteria)豐度最大也與很多研究的結(jié)果相似[27-28]；幼齡林特有菌門為Abditibacteria。本研究中變形菌門(Proteobacteria)在土壤細(xì)菌中相對(duì)豐度最大，因?yàn)樽冃尉T包括自由生活的固氮菌，而紅豆樹是豆科植物，具有較強(qiáng)的固氮能力。酸桿菌門(Acidobacteria)在中齡林中豐度最大，跟中齡林土壤pH最低有關(guān)，酸性土壤利于酸桿菌門生存。綠彎菌門是可以通過光合作用產(chǎn)生能量，更適宜在有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的土壤中生長(zhǎng)[29]，綠彎菌門在有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的幼齡林和成熟林土壤中豐度相對(duì)較高。酸桿菌綱的豐度在3個(gè)林齡土壤中均最高，且酸桿菌綱在pH最低的中齡林土壤中豐度最大，與相關(guān)研究酸桿菌門適生于酸性土壤中的研究結(jié)果一致[30-31]。

土壤細(xì)菌群落的多樣性隨著紅豆樹林齡的增加先減小后增大的趨勢(shì)，與郭春蘭等[32]研究油茶種植年限和土壤微生物多樣性變化趨勢(shì)一致。本研究中3個(gè)林齡間土壤細(xì)菌多樣性差異不顯著，說明3個(gè)林齡間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，與3個(gè)林齡的立地條件、海拔、氣候等因子相近有關(guān)。Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)隨著林齡的增加表現(xiàn)為先減小后增大，與張文文等[33]對(duì)引黃灌區(qū)不同種植年限紫花苜蓿的研究結(jié)果類似，說明長(zhǎng)期種植單一植物土壤中細(xì)菌豐度及多樣性會(huì)降低，但隨著林分凋落物的增加，有機(jī)質(zhì)增多，細(xì)菌的豐度和多樣性又會(huì)有所增加。

土壤的化學(xué)性質(zhì)對(duì)土壤微生物多樣性和植物的生長(zhǎng)有重要作用，是土壤肥力高低的重要指標(biāo)[34-35]。通過優(yōu)勢(shì)菌門和土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)分析可知，土壤有效磷、全鉀、pH和速效鉀是影響細(xì)菌群落的主要因子。本研究中土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)中齡林最高，幼齡林最低；土壤中全氮和堿解氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3個(gè)林齡土壤的排序與土壤有機(jī)質(zhì)在3個(gè)林齡土壤的排序相同，與牛沙沙等[36]對(duì)不同林齡樟子松人工林土壤理化性質(zhì)的研究結(jié)果相似。原因是林分中土壤的全氮和有機(jī)質(zhì)來源于枯枝落葉，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)跟有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小變化趨勢(shì)相一致，幼齡林枯枝落葉層較少，所以土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮和堿解氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。放線菌門(Actinobacteria)與全鉀顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，浮霉菌門(Planctomycetes)與有效磷、全磷和速效鉀顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

5 結(jié)論

變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門的豐度占細(xì)菌總量的68.4%～69.4%，是3個(gè)林齡土壤的優(yōu)勢(shì)菌門；優(yōu)勢(shì)菌綱為酸桿菌綱(Acidobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)和纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)；成熟林土壤中細(xì)菌多樣性高且分布較均勻。土壤有效磷、全鉀、pH和速效鉀是影響細(xì)菌群落的主要因子，全鉀與放線菌門顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，浮霉菌門(Planctomycetes)與有效磷、全磷顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與速效鉀極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。