■毛 康 張?zhí)諠?李艷嬌 盧顧偉 瞿明仁 趙向輝 邱清華 歐陽(yáng)克蕙

（江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045）

瘤胃是反芻動(dòng)物區(qū)別其他單胃動(dòng)物最顯著的特征，瘤胃發(fā)酵功能的好壞直接影響反芻動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能。因此如何正確科學(xué)地調(diào)控瘤胃發(fā)酵功能，一直是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的關(guān)鍵。丙酮酸肌酸（creatine pyruvate，CrPyr）是一種新型的功能營(yíng)養(yǎng)素，具有肌酸的特性和丙酮酸的功能，其中肌酸的含量占60%，丙酮酸的含量占40%[1]。肌酸是能量代謝和蛋白質(zhì)代謝過(guò)程中重要的含氮化合物之一。在過(guò)去幾十年里，肌酸被廣泛運(yùn)用于反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)當(dāng)中，作為氮的補(bǔ)充劑。有研究表明，瘤胃細(xì)菌產(chǎn)生的肌酸酶將肌酸降解為尿素和肌氨酸，然后在尿素酶的作用下將尿素催化為CO2和NH3[2]。丙酮酸是能量轉(zhuǎn)化過(guò)程中重要的代謝產(chǎn)物[3]。對(duì)于反芻動(dòng)物而言，丙酮酸還是瘤胃微生物在對(duì)碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵后的一個(gè)重要中間產(chǎn)物[4]，瘤胃內(nèi)丙酮酸在轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）的過(guò)程中所釋放的ATP 又可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。在前期的研究中，山羊日糧中添加丙酮酸鈣可以提高瘤胃VFA的含量，降低日糧中蛋白質(zhì)的降解，并降低瘤胃氨態(tài)氮（ammonia nitrogen，NH3-N）濃度[5]。CrPyr 可以給機(jī)體提供丙酮酸和肌酸兩種代謝產(chǎn)物[6]，可以推測(cè)CrPyr能夠同時(shí)促進(jìn)瘤胃能量代謝和氮的供應(yīng)，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵功能。目前關(guān)于飼糧中添加CrPyr對(duì)肉牛體外瘤胃發(fā)酵的影響在國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道，因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)體外人工瘤胃發(fā)酵方法，探討CrPyr對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，為CrPyr在反芻動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 CrPyr

CrPyr 購(gòu)買(mǎi)于上海津力藥業(yè)股份有限公司，其中肌酸含量≥58.0%，丙酮酸含量≥30.0%。

1.1.2 發(fā)酵底物

發(fā)酵底物由粗料稻草，精料玉米、豆粕、麥麩等組成，將飼料原料充分粉碎后，按照精粗比2∶8進(jìn)行混勻配制，發(fā)酵底物混勻之后放在65 ℃烘箱當(dāng)中烘干備用。

1.1.3 緩沖液的配制

按順序添加520.2 mL 純化水+208.1 mL 緩沖液（B）+208.1 mL常量元素溶液（C）+ 0.1 mL微量元素溶液（A）+1.0 mL 刃天青溶液（D）+62.4 mL 還原液（E），通入CO2，直至溶液由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色。調(diào)整成人工唾液的A、B、C、D、E配方見(jiàn)表1。

表1 人工唾液的組成成分

1.1.4 瘤胃液供體動(dòng)物及其飼養(yǎng)管理

選取3 頭健康狀況良好的錦江公牛，體重300～350 kg，每天飼喂兩次（6:00 和18:00），自由飲水?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.1.5 瘤胃液的采集

于下午采食前，首先用牛鼻鉗固定牛頭，接著使用胃管式瘤胃液采集器采集瘤胃液，去除最初的50 mL瘤胃液（避免唾液的影響），然后將收集到的瘤胃液迅速裝入充滿(mǎn)CO2且經(jīng)過(guò)滅菌處理的保溫瓶中，收集完畢，蓋上保溫瓶蓋，帶回實(shí)驗(yàn)室。將4 層紗布過(guò)濾后的瘤胃液通入CO2氣體5 min，并向預(yù)先充滿(mǎn)CO2且加好發(fā)酵底物的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分別加入20 mL 瘤胃液和40 mL 人工唾液。連接好培養(yǎng)瓶和注射器后打開(kāi)通氣閥和振蕩開(kāi)關(guān)，培養(yǎng)開(kāi)始。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采取單因素設(shè)計(jì)，共設(shè)6 個(gè)組（分別添加0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、3.2%的CrPyr），設(shè)3個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)分別為0、12 h和24 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)有4個(gè)重復(fù)。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

發(fā)酵0、12、24 h，將對(duì)應(yīng)的發(fā)酵瓶放置冰盒中30 min，終止發(fā)酵。隨后測(cè)定發(fā)酵液的pH，接著發(fā)酵液用尼龍網(wǎng)布進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾好的瘤胃液分裝到10 mL離心管，然后放入-20 ℃的冰箱中保存，用于測(cè)定瘤胃發(fā)酵參數(shù)：NH3-N、微生物粗蛋白（microbial crude protein, MCP）、VFA以及丙酮酸和肌酸的含量。尼龍網(wǎng)布中的殘?jiān)M(jìn)行回收，65 ℃的烘箱中烘干，用于測(cè)定干物質(zhì)的消化率。

1.3.1 pH的測(cè)定

發(fā)酵液的pH 采用上海雷磁PHS-3C 型pH 計(jì)進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)定之前使用pH 4.01和pH 6.80的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液進(jìn)行校正。

1.3.2 NH3-N的測(cè)定

參考馮宗慈等[7]利用比色法測(cè)定發(fā)酵液中NH3-N的含量。

1.3.3 MCP的測(cè)定

MCP 采用考馬斯亮藍(lán)法[8]，使用752 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定。

1.3.4 VFA的測(cè)定采用GC-1690氣相色譜儀（杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司）FID 檢驗(yàn)器測(cè)定VFA，色譜柱：Nukol 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度220 ℃；檢測(cè)器溫度250 ℃；柱溫升溫程序：起始溫度60 ℃，然后以20 ℃/min的升溫速率升至190 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口壓力：100 kPa；SPL分流比：20∶1；氣體流速：載氣氮?dú)猓∟2）75 mL/min，氫氣（H2）70 mL/min，空氣50 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.5 干物質(zhì)消化率

式中：M1——發(fā)酵前底物重（g）；

M2——發(fā)酵后殘?jiān)兀╣）。

1.3.6 丙酮酸的測(cè)定

丙酮酸使用丙酮酸試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程研究所。

式中：M3——發(fā)酵前丙酮酸的含量（μmol/mL）；

M4——發(fā)酵后丙酮酸的含量（μmol/mL）。

1.3.7 肌酸的測(cè)定

肌酸使用比色法進(jìn)行測(cè)定[9]。肌酸可在堿性條件下與聯(lián)乙酰-α萘酚發(fā)生反應(yīng)，生成紅色產(chǎn)物，在520 nm形成吸收峰。

式中：M5——發(fā)酵前肌酸的含量（mg/L）；

M6——發(fā)酵后肌酸的含量（mg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行初步整理，統(tǒng)計(jì)結(jié)果使用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，使用GraphPad Prism 6.01繪圖。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。。

2 結(jié)果與分析

2.1 CrPyr 對(duì)瘤胃體外發(fā)酵pH、NH3-N、MCP、干物質(zhì)表觀消化率的影響（見(jiàn)表3、圖1）

由表3 可知，發(fā)酵0 h 和12 h，添加不同劑量的CrPyr 對(duì)瘤胃液pH 無(wú)顯著影響，但發(fā)酵24 h，添加組的pH呈現(xiàn)二次下降后上升的趨勢(shì)，1.6%組的pH顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），但處在正常水平。發(fā)酵0 h，添加CrPyr對(duì)NH3-N無(wú)顯著影響；發(fā)酵12 h，1.6%組和3.2%組的NH3-N濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；發(fā)酵24 h，3.2%組的NH3-N濃度極顯著高于其余各組（P＜0.01）。發(fā)酵0 h，不同CrPyr 添加量對(duì)MCP 的濃度無(wú)顯著影響；發(fā)酵12 h，1.6%組顯著降低了MCP 的含量（P＜0.05），但發(fā)酵24 h 之后添加組MCP 的含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在發(fā)酵過(guò)程中添加CrPyr對(duì)干物質(zhì)表觀消化率無(wú)顯著影響。由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各添加組NH3-N的濃度呈現(xiàn)先顯著性地下降后顯著性地升高的變化趨勢(shì)（P＜0.05）；與0 h相比，發(fā)酵12 h，1.2%組的MCP 濃度顯著性增加（P＜0.05），其余各添加量組的MCP 濃度無(wú)顯著性變化，但發(fā)酵24 h后，各組MCP的濃度顯著性升高（P＜0.05）。

圖1 添加不同劑量的CrPyr在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)NH3-N和MCP的影響

表3 CrPyr對(duì)肉牛體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)和干物質(zhì)表觀消化率的影響

2.2 CrPyr對(duì)發(fā)酵液中VFA含量的影響（見(jiàn)表4、圖2）

由表4可知，發(fā)酵0 h，添加組的總揮發(fā)性脂肪酸（Total VFA，TVFA）與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；發(fā)酵12 h，0.4%組的TVFA、乙酸和異戊酸的濃度極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；但與1.6%組相比，0.4%組的丙酸和異丁酸的濃度顯著升高（P＜0.05）、丁酸的濃度極顯著升高（P＜0.01）。發(fā)酵24 h，1.6%組的TVFA、乙酸和異戊酸濃度極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），異丁酸濃度顯著高于其余各組（P＜0.05）；發(fā)酵0 h和24 h，3.2%組的乙酸/丙酸值極顯著高于其余各組（P＜0.01）。由圖2可知，與發(fā)酵0 h相比，各組中乙酸、丙酸和TVFA的濃度在發(fā)酵12 h均顯著性增加（P＜0.05），但發(fā)酵24 h之后，1.6%組的乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和TVFA的濃度以及3.2%組的戊酸和異戊酸的濃度均顯著高于發(fā)酵12 h（P＜0.05）。而乙酸/丙酸值在發(fā)酵12 h時(shí)與對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.05），但其比值在發(fā)酵24 h之后與12 h相比無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 添加不同劑量的CrPyr在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)VFA的影響

表4 CrPyr對(duì)發(fā)酵液中VFA含量的影響

2.3 CrPyr 對(duì)發(fā)酵液中丙酮酸和肌酸含量的影響（見(jiàn)表5、圖3）

由表5可知，發(fā)酵0 h，1.2%、1.6%、3.2%組發(fā)酵液中丙酮酸濃度極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；發(fā)酵12 h，各組之間的丙酮酸濃度無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但發(fā)酵24 h后，與其余各組相比，1.2%組的丙酮酸濃度最低，3.2%組丙酮酸濃度極顯著高于其余各組（P＜0.01）。發(fā)酵0、12 h和24 h，1.2%、1.6%和3.2%組中肌酸濃度均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），且隨著添加量的增加肌酸濃度呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。由圖3可知，與發(fā)酵0 h 相比，發(fā)酵12 h 之后，0.8%、1.2%、1.6%和3.2%添加組的丙酮酸濃度顯著性下降（P＜0.05），但對(duì)照組和0.4%添加組丙酮酸的含量無(wú)顯著性變化，并且發(fā)酵24 h之后各組丙酮酸的濃度與發(fā)酵12 h相比，均無(wú)顯著性差異；與發(fā)酵0 h相比，各組肌酸的濃度在發(fā)酵12 h 后均無(wú)顯著性差異，但在發(fā)酵24 h 之后，1.2%、1.6%和3.2%添加組肌酸的濃度顯著低于發(fā)酵12 h的濃度（P＜0.05）。

圖3 添加不同劑量的CrPyr在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)丙酮酸和肌酸含量的影響

表5 CrPyr對(duì)發(fā)酵液中丙酮酸和肌酸含量的影響

3 討論

3.1 CrPyr對(duì)體外培養(yǎng)發(fā)酵液pH、干物質(zhì)表觀消化率的影響

瘤胃液pH 反映瘤胃的代謝狀態(tài)，是食糜中VFA與唾液緩沖液相互作用、瘤胃上皮對(duì)VFA吸收及食糜流出等綜合作用的結(jié)果[10]。因本試驗(yàn)是體外發(fā)酵，只有微生物對(duì)底物的發(fā)酵產(chǎn)生VFA的積累，從而造成對(duì)pH 的影響。pH 過(guò)高和過(guò)低都會(huì)影響瘤胃微生物的發(fā)酵。研究表明瘤胃內(nèi)正常pH的范圍是6～7[11]，本試驗(yàn)中各組的pH 均處在這個(gè)范圍之內(nèi)，表明人工瘤胃在試驗(yàn)中處于正常的發(fā)酵狀態(tài)，并且在發(fā)酵24 h 后，添加組pH 低于對(duì)照組，其原因可能是添加不同水平的CrPyr 提高了瘤胃內(nèi)VFA 的含量，從而降低了瘤胃pH。干物質(zhì)降解率反映了飼料原料被消化利用的難易程度，也可以體現(xiàn)飼用價(jià)值的高低以及被微生物和機(jī)體組織所利用的程度[12-13]，本試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵12 h和24 h，隨著CrPyr添加量的提高，干物質(zhì)表觀消化率在數(shù)值上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，表明低濃度CrPyr添加量在一定程度上能夠促進(jìn)干物質(zhì)消化，但濃度過(guò)高抑制干物質(zhì)消化。其原因可能是CrPyr在瘤胃當(dāng)中分解為丙酮酸和肌酸，丙酮酸是能量轉(zhuǎn)化過(guò)程中重要的代謝產(chǎn)物[3]，在瘤胃中直接作為VFA合成的前體物質(zhì)，CrPyr添加量過(guò)高可能降低了瘤胃微生物對(duì)碳水化合物的依賴(lài)。

3.2 CrPyr對(duì)體外培養(yǎng)發(fā)酵液丙酮酸、肌酸、NH3-N和MCP的影響

丙酮酸和肌酸都是能量代謝和蛋白質(zhì)代謝的重要中間產(chǎn)物。丙酮酸在轉(zhuǎn)化成VFA 的時(shí)候釋放ATP可以促進(jìn)瘤胃微生物的生長(zhǎng)，肌酸在瘤胃中的適應(yīng)性取決于氨的緩慢釋放，可以為MCP 合成提供直接原料。有研究表明，CrPyr 可以給機(jī)體提供丙酮酸和肌酸兩種代謝產(chǎn)物[14]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵0 h和24 h，3.2%組的丙酮酸含量極顯著高于其余各組，并且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，瘤胃液中丙酮酸的含量呈現(xiàn)一個(gè)先顯著性下降后保持平穩(wěn)的趨勢(shì)，表明發(fā)酵液中丙酮酸的降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，因?yàn)樘砑覥rPyr，導(dǎo)致發(fā)酵液中丙酮酸的含量增加，使瘤胃微生物可以充分利用丙酮酸，所以此時(shí)丙酮酸的消耗速率大于生成速率，并且丙酮酸的消耗速率與CrPyr 的添加量呈線性關(guān)系。12 h 之后，隨著添加的丙酮酸含量降低，瘤胃中生成丙酮酸的速率與消耗速率趨于平衡。發(fā)酵0、12、24 h，1.2%、1.6%和3.2%組的肌酸含量極顯著高于對(duì)照組，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，肌酸含量呈現(xiàn)一個(gè)先保持平穩(wěn)后顯著性下降的變化過(guò)程，并且肌酸的消耗量與CrPyr的添加量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系。分析其原因可能是剛開(kāi)始丙酮酸的大量存在減緩了肌酸的消耗。

NH3-N是瘤胃內(nèi)肽、氨基酸、蛋白質(zhì)、尿素和其他非蛋白氮共同分解的最終產(chǎn)物，也是瘤胃微生物合成MCP 的主要原料。瘤胃內(nèi)的最佳NH3-N 的含量在0.35～29.00 mg/dL[15]。有研究表明肌酸在瘤胃的降解分為兩步，第一步是瘤胃細(xì)菌產(chǎn)生肌酸酶使肌酸降解為尿素和肌氨酸，第二步是在尿素酶的作用下催化生成CO2和NH3[2]。本試驗(yàn)NH3-N 的含量均處在正常的范圍。發(fā)酵12 h 和24 h，隨著添加量的增加，其含量均高于對(duì)照組，其原因可能是肌酸的降解導(dǎo)致。由肌酸含量的變化可以看出，在發(fā)酵24 h后肌酸的含量顯著性低于0 h，說(shuō)明肌酸在這個(gè)時(shí)間段被降解生成氨，從而增加了處理組NH3-N在發(fā)酵24 h的濃度。

MCP是反芻動(dòng)物最主要的蛋白質(zhì)來(lái)源，其含量的高低取決于瘤胃中碳源和氮源的比例是否適宜。本試驗(yàn)發(fā)酵24 h添加組的NH3-N和MCP的含量均高于對(duì)照組，且MCP含量變化和NH3-N的變化趨勢(shì)是一致的，均呈現(xiàn)一個(gè)先升高后下降的趨勢(shì)，但3.2%組NH3-N的濃度極顯著地增高，而其對(duì)應(yīng)的MCP 的含量又下降，說(shuō)明過(guò)高的CrPyr會(huì)降低MCP的合成，適宜的CrPyr可以有效促進(jìn)NH3-N向MCP轉(zhuǎn)化，這與陳秀霞等[16]的研究結(jié)果相似。其原因可能是CrPyr進(jìn)入瘤胃之后分解為丙酮酸和肌酸兩種單體，肌酸降解提供MCP合成的原料，丙酮酸間接提供MCP 合成所需的能量，從而促進(jìn)瘤胃微生物的活動(dòng)，提高了MCP的合成量。

3.3 CrPyr對(duì)體外培養(yǎng)發(fā)酵液VFA的影響

VFA 的含量和組成比例是評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵方式和發(fā)酵能力的直接指標(biāo)，并且是反芻動(dòng)物能量利用的主要形式[17]。而VFA 主要由乙酸、丙酸和丁酸組成，占TVFA 的95%，乙酸有利于動(dòng)物的體脂率和乳脂率提高，丙酸有利于葡萄糖轉(zhuǎn)化和儲(chǔ)存，丁酸可為機(jī)體各組織供能[18]。本試驗(yàn)中，在發(fā)酵24 h，1.6%添加組的TVFA極顯著高于其余各組，而乙酸/丙酸值極顯著低于3.2%添加組，卻與其余組相比無(wú)顯著性差異，表明該添加劑量下可以促進(jìn)VFA的生成，并且優(yōu)化VFA的組成，提高能量的利用效率，為MCP的合成提供了碳源，并且分析本試驗(yàn)中隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)pH降低的現(xiàn)象，可能與發(fā)酵液中VFA含量升高有關(guān)。有研究表明，添加能量代謝中間產(chǎn)物蘋(píng)果酸可以提高瘤胃體外發(fā)酵VFA的濃度，改善瘤胃發(fā)酵能力[19]，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。然而張荃[10]在山羊飼糧中添加丙酮酸鈣，可以造成瘤胃液中乙酸的比例下降、丙酸和丁酸的比例上升，與本試驗(yàn)的結(jié)果有差異。分析其原因可能是添加量的不同造成的。

4 結(jié)論

①丙酮酸在12 h 內(nèi)降解的速率較快，而肌酸在12 h 之后才開(kāi)始快速降解，丙酮酸的降解率隨著CrPyr添加量的提高而增加，相反，肌酸的降解率隨著CrPyr添加量的提高而降低。

②飼糧中添加CrPyr 可以提高發(fā)酵液中MCP、NH3-N 和VFA 的濃度，改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，本試驗(yàn)條件下1.6%的CrPyr添加效果最好。