林小楓 ， 劉梅雪 ， 袁瑋藝 ， 張瓊歌 ， 朱 磊 ， 杜 謙

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西 楊凌 712100 ； 2.楊凌金海生物技術(shù)有限公司 ， 陜西 楊凌 712100)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是目前嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原。PCV2感染能抑制機(jī)體免疫，導(dǎo)致豬圓環(huán)病毒病綜合征(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)，且PCV2在豬群中的持續(xù)存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失[1]。PCV2的單鏈環(huán)狀DNA基因組包含2個(gè)主要的編碼框(Open reading frame，ORF)，即ORF1和ORF2?？筛鶕?jù)ORF2基因序列的差異將PCV2分為8個(gè)不同的基因型，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d是主要的流行基因型[2]。豬群中最早流行PCV2a基因型，然后轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2b，目前正緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2d[3-4]。雖然有報(bào)道稱，目前市場上銷售的基于PCV2a基因型毒株的疫苗對于PCV2d基因型毒株的保護(hù)效果與PCV2a基因型毒株相當(dāng)，但臨床仍存在已接種PCV2a基因型毒株疫苗的豬發(fā)生PCVAD，因此PCV2臨床毒株可能突破疫苗免疫保護(hù)[5]。原核生物素連接酶(Prokaryotic biotin ligase，BirA)是原核生物調(diào)控生物素合成的酶，生物素受體肽(Biotin acceptor peptide，BAP)是一種廣泛使用的15 aa標(biāo)簽肽，其可被插入目的蛋白，使目的蛋白被BirA高效識別并標(biāo)記生物素[6]。利用BirA-BAP標(biāo)記系統(tǒng)獲得生物素化PCV2d毒株可為后續(xù)進(jìn)一步研究PCV2d感染突破疫苗免疫保護(hù)的具體機(jī)制提供材料。

本試驗(yàn)從陜西咸陽某臨床發(fā)病豬場采集17頭仔豬的血清、脾臟和淋巴結(jié)等組織樣本，PCR檢測發(fā)現(xiàn)其中5頭仔豬為PCV2陽性，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)1頭仔豬感染了PCV2d基因型毒株。將PCV2d基因組orf2序列中226～246 bp替換為BAP編碼序列后，環(huán)化并轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞，經(jīng)連續(xù)傳代5次后，獲得生物素標(biāo)記的重組PCV2d基因型毒株，本結(jié)果將為后續(xù)開展PCV2d基因型毒株免疫逃避機(jī)制研究提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2頭臨床發(fā)病仔豬和15頭未發(fā)病仔豬的血清、脾臟和淋巴結(jié)等組織樣本均采集自陜西咸陽武功縣某養(yǎng)殖場。

1.2 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒 PK15細(xì)胞、大腸埃希菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞和pCI-neo-N1質(zhì)粒，由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD-18T質(zhì)粒，購自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑 2×TaqMaster Mix(Dye plus)和T4連接酶，均購自南京Vazyme公司；SacⅡ、BamH Ⅰ和XhoⅠ等內(nèi)切酶，均購自TaKaRa公司；M5 DL2 000 plus DNA Marker，購自北京聚合美公司；Lipo6000，購自碧云天公司；鼠抗BirA單克隆抗體，購自NOVUS公司；HRP標(biāo)記鏈霉親和素，購自Santa Cruz公司；鼠抗PCV2 Cap多克隆抗體，由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)已報(bào)道的PCV2(GenBank：MH492006)序列，設(shè)計(jì)PCV2全長擴(kuò)增引物PCV2-F和PCV2-R，以及PCV2檢測引物PCV2JC-F和PCV2JC-R；根據(jù)PCV2 Cap編碼序列的Loop CD區(qū)域(L75PPGGGSN82)，設(shè)計(jì)引入BAP標(biāo)簽(GLNDIFEAQKIEWHE)序列的Overlap引物BAP-F和BAP-R；根據(jù)大腸埃希菌的BirA基因序列(GenBank：M10123.1)設(shè)計(jì)引物BirA-F和BirA-R。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.2 基因組DNA的提取 將采集的組織樣本或細(xì)胞經(jīng)-80 ℃反復(fù)凍融，離心取上清。在收集的上清液中加入1%終體積SDS和0.5 mg/μL終濃度蛋白酶K，顛倒混勻1 min，56 ℃水浴30 min。加入等體積DNA提取液，震蕩混勻5 min后，12 000 r/min離心5 min。吸取上清，加入等體積氯仿，混勻5 min后，室溫12 000 r/min離心5 min。吸取上清，加入1/10體積2 mol/L乙酸鈉和2倍體積無水乙醇，-80 ℃過夜。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌2次，4 ℃離心棄上清，自然風(fēng)干后加入ddH2O溶解，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCV2基因組擴(kuò)增和遺傳進(jìn)化分析 利用PCV2檢測引物PCV2JC-F和PCV2JC-R對提取的17份組織DNA樣品進(jìn)行PCR檢測，設(shè)置陽性對照和陰性對照。對于PCV2陽性DNA樣品，利用PCV2全長引物進(jìn)行PCV2全基因組PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。為了明確所擴(kuò)增PCV2的基因型，利用MEGA 5.10軟件，采用鄰接(Neighbor-joining,NJ)法，并進(jìn)行1 000次自舉重復(fù)，對測序結(jié)果進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

1.4.4 重組質(zhì)粒T-PCV2d-BAP的構(gòu)建 根據(jù)獲得的PCV2d DNA中orf2的226～246 bp序列，分別利用Overlap引物BAP-F和PCV2-R、PCV2-F和BAP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物片段1和片段2，以片段1和片段2共同為模板，利用PCV2-F和PCV2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得重組PCV2d-BAP目的片段。將其克隆入pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α后挑取單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR及SacII酶切鑒定，并進(jìn)一步測序鑒定，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為T-PCV2d-BAP。

1.4.5 重組質(zhì)粒pCI-BirA的構(gòu)建 取3 mLE.coliDH5α飽和菌液，離心棄上清，STE洗滌1次，加入500 μL TE緩沖液，沸水浴10 min后，以12 000 r /min離心15 min，取上清作為PCR模板。利用BirA-F和BirA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為：95 ℃預(yù)變性10 min,94 ℃ 40 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)后，再于72 ℃延伸10 min?；厥誔CR產(chǎn)物，利用BamH I和XhoI雙酶切，同時(shí)對pCI-neo-N1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用T4連接酶于16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α后挑取單克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒命名為pCI-BirA。

1.4.6 穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定 將狀態(tài)良好的PK15細(xì)胞以6×104個(gè)/孔鋪制24孔細(xì)胞板，置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)，利用Lipo6000將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCI-BirA轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞，48 h后加入G418進(jìn)行篩選，獲得單細(xì)胞克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)。收取擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞，提取細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，PCR擴(kuò)增BirA基因編碼序列，同時(shí)Western blot檢測細(xì)胞中BirA蛋白的表達(dá)，PCR和Western blot陽性細(xì)胞克隆即為穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞系。

1.4.7 生物素標(biāo)記PCV2d基因型毒株的獲得及鑒定 利用內(nèi)切酶SacII將T-PCV2d-BAP酶切，獲得PCV2d-BAP編碼序列，將其以T4連接酶于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)純化后，轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞，盲傳5代后，收取細(xì)胞，裂解并收集上清，提取DNA，利用PCV2特異性引物進(jìn)行PCR檢測，同時(shí)將獲得的細(xì)胞上清再次感染PK15細(xì)胞，裂解細(xì)胞后，以鼠抗PCV2 Cap多克隆抗體和HRP標(biāo)記的鏈酶親和素進(jìn)行Western blot檢測，陽性毒株即為生物素標(biāo)記PCV2d基因型毒株。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本的檢測及PCV2d全基因組擴(kuò)增 將采集的2頭發(fā)病仔豬和15頭未發(fā)病仔豬樣本，分別提取DNA后，以PCV2特異性檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，2頭發(fā)病仔豬均為PCV2陽性，15頭未發(fā)病仔豬中有3頭為PCV2陽性(圖1A)。分別將5頭PCV2核酸陽性仔豬樣本中的PCV2全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到大小約為1 760 bp的目的條帶(圖1B)。對目的條帶進(jìn)行測序，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，擴(kuò)增的5條目的條帶中有1條為PCV2d序列，擴(kuò)增自1頭發(fā)病仔豬的組織樣本，其余4條為PCV2b序列，分別來源于另一頭發(fā)病仔豬和3頭未發(fā)病仔豬(圖1C)。

圖1 臨床樣本PCR檢測及PCV2d全基因組遺傳進(jìn)化分析Fig.1 PCR detection of clinical samples and genetic evolution analysis of PCV2d whole genomeA：17份臨床樣本PCV2特異性PCR擴(kuò)增(M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000 plus； 1:陽性對照； 2:陰性對照； 3～17:臨床未發(fā)病仔豬組織樣本； 18、19:臨床發(fā)病仔豬組織樣本);B:5份陽性樣本PCV2全基因組PCR擴(kuò)增(M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000 plus； 1:陽性對照； 2：陰性對照； 3～7：PCV2陽性臨床樣本)；C：PCV2全基因組遺傳進(jìn)化樹(▲：本試驗(yàn)擴(kuò)增序列)A：PCV2 specific PCR amplification of 17 clinical samples(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Positive control; 2:Negative control; 3-17:Clinical tissue samples from non-diseased pigs; 18,19:Clinical tissue samples from diseased pigs);B:PCV2 whole genome PCR amplification of 5 positive samples(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Positive control;2:Negative control; 3-7:PCV2 positive clinical samples);C:Phylogenetic tree of PCV2 genomes(▲:Sequences amplified in this study)

2.2 重組質(zhì)粒T-PCV2d-BAP的構(gòu)建 根據(jù)獲得的1株P(guān)CV2d全基因組DNA中orf2的226～246 bp序列，設(shè)計(jì)引入BAP序列的Overlap引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為842 bp的PCR片段1和大小約為1 028 bp的PCR片段2(圖2A)。以片段1和片段2同時(shí)為模板，用PCV2全基因組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約為1 790 bp的PCV2d-BAP目的條帶(圖2B)，將其克隆入pMD19-T載體，經(jīng)PCR及SacⅡ酶切鑒定，均獲得了預(yù)期大小的目的條帶(圖2C)，測序鑒定正確，表明重組質(zhì)粒T-PCV2d-BAP構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒T-PCV2d-BAP的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid T-PCV2d-BAPA：PCV2d片段1和片段2的PCR擴(kuò)增(M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000 plus； 1:片段1； 2:片段2); B:PCV2d-BAP的PCR擴(kuò)增(M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000 plus； 1:PCV2d-BAP);C:重組質(zhì)粒T-PCV2d-BAP的Sac Ⅱ酶切鑒定(M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000 plus； 1:Sac II酶切鑒定產(chǎn)物)A:PCR amplification of fragment 1 and fragment 2 of PCV2d(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:Fragment 1; 2:Fragment 2); B:PCR amplification of PCV2d-BAP(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:PCV2d-BAP);C:Identification of recombinant plasmid T-PCV2d-BAP by Sac Ⅱ enzymes digestion(M：DNA Marker DL2 000 plus; 1:Sac Ⅱ enzymes digestion products)

2.3 重組質(zhì)粒pCI-BirA的構(gòu)建 設(shè)計(jì)E.coliDH5αBirA基因特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得大小約為966 bp的目的條帶(圖3A)，將其克隆入pCI-neo載體，經(jīng)雙酶切鑒定，獲得大小約為966 bp的目的條帶(圖3B)，測序鑒定正確，表明已成功構(gòu)建pCI-BirA重組質(zhì)粒。

圖3 重組質(zhì)粒pCI-BirA的構(gòu)建Fig.3 Construction of recombinant plasmid pCI-BirAA：BirA基因的PCR擴(kuò)增(M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000 plus； 1:BirA);B:重組質(zhì)粒pCI-BirA的雙酶切鑒定(M:DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000 plus； 1:BamH I和Xho I雙酶切產(chǎn)物)A：PCR amplification of BirA gene(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:BirA);B:Identification of recombinant plasmid pCI-BirA by double enzymes digestion(M:DNA Marker DL2 000 plus; 1:BamH I and Xho I double enzymes digestion products)

2.4 穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定 將構(gòu)建好的pCI-BirA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，48 h后加入G418進(jìn)行篩選，獲得單細(xì)胞克隆后擴(kuò)大培養(yǎng)(圖4A)，提取細(xì)胞mRNA并反轉(zhuǎn)錄后，PCR擴(kuò)增BirA基因編碼序列，結(jié)果顯示獲得了大小約為966 bp的目的條帶(圖4B)；Western blot結(jié)果顯示，獲得的細(xì)胞克隆表達(dá)BirA蛋白(圖4C)，與預(yù)期大小一致，表明成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞系。

圖4 穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定Fig.4 Construction and identification of PK15 cell line stably expressing BirAA：G418篩選后單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)的PK15細(xì)胞(100×)；B：PK15細(xì)胞系BirA mRNA的PCR鑒定(M：DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2 000 plus； 1:BirA mRNA); C：PK15細(xì)胞系BirA蛋白的Western blot鑒定(WT:野生型PK15細(xì)胞； BirA:表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞A：Expanded PK15 cells after G418 screening (100×);B：PCR identification of BirA mRNA in PK15 cell line(M:DNA Marker DL2 000; 1:BirA mRNA);C：Western blot identification of BirA protein in PK15 cell line(WT：Wild-type PK15 cells; BirA:PK15 cells expressing BirA)

2.5 生物素標(biāo)記PCV2d基因型毒株的獲得及鑒定 將環(huán)化的PCV2d-BAP轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞，盲傳5代，經(jīng)檢測，成功獲得大小約為352 bp的目的片段(圖5A)。同時(shí)將獲得的上清感染PK15細(xì)胞，裂解細(xì)胞后進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，以鼠抗PCV2 Cap多克隆抗體和HRP標(biāo)記的鏈酶親和素均能檢測到大小約為29 kDa的目的條帶(圖5B)，表明成功獲得了生物素標(biāo)記PCV2d基因型毒株。

圖5 生物素標(biāo)記PCV2d基因型毒株的獲得及鑒定Fig.5 Obtain and identification of biotin-labeled PCV2d genotype strainA：細(xì)胞裂解上清PCV2特異性PCR鑒定(1：陽性對照； 2：細(xì)胞裂解上清； 3：陰性對照)；B：生物素標(biāo)記PCV2d基因型毒株的Western blot鑒定(1:PCV2陽性對照； 2:生物素標(biāo)記PCV2d基因型毒株； 3:陰性對照)A：PCV2 specific PCR identification of cell lysis supernatant(1:Positive control; 2:Cell lysis supernatant; 3:Negative control); B：Western blot identification of biotin-labeled PCV2d genotype strain(1:PCV2 positive control; 2:Biotin-labeled PCV2d genotype strain; 3:Negative control)

3 討論

PCV2是目前已知最小的動(dòng)物病毒，其基因組大小約為1 766～1 768 nt的單鏈環(huán)狀DNA。在單鏈DNA病毒中，PCV2基因組具有最高的突變概率，每年能達(dá)到約1.2×10-3突變/位點(diǎn)[7]。PCV2基因組的這些突變使其可以被分為不同基因型，分別為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e、PCV2f、PCV2g和PCV2h[2,5]。在目前已報(bào)道的PCV2序列中，PCV2b基因型最多，其次是PCV2d基因型，第三是PCV2a基因型，這3種PCV2基因型均呈世界性分布[2]。從PCV2序列報(bào)道的時(shí)間上來看，最早報(bào)道的是PCV2a基因型，但大約從2002年開始，PCV2b基因型的報(bào)道增多，特別是2005年以后，PCV2b基因型開始成為主要的流行基因型[2]。隨著PCV2基因組的持續(xù)突變，2010年以后PCV2d基因型的報(bào)道量急劇增加，并呈現(xiàn)逐漸取代PCV2b基因型成為主要流行基因型的趨勢[2]。更重要的是，有研究顯示，雖然目前廣泛使用的基于PCV2a基因型毒株的疫苗能使免疫后的仔豬在被PCV2a、PCV2b或PCV2d基因型毒株感染時(shí)具有相似的保護(hù)作用，但在PCV2b和PCV2d基因型毒株感染的仔豬體內(nèi)中和抗體的產(chǎn)生量相對較少[8]。目前，世界主要養(yǎng)豬國家已廣泛使用PCV2疫苗對豬群進(jìn)行免疫，但與此同時(shí)PCV2d基因型毒株報(bào)道增多，這可能與疫苗的選擇壓力有關(guān)[5]。事實(shí)上，早前已有報(bào)道顯示，PCV2在疫苗選擇壓力下已經(jīng)發(fā)生了免疫逃避進(jìn)化趨向[9]。因此，對豬群中PCV2流行情況的持續(xù)監(jiān)控，以及對流行PCV2基因型的進(jìn)一步深入研究，將有助于更好地防控豬圓環(huán)病毒病。在本試驗(yàn)中，對臨床發(fā)病的2頭仔豬和同豬群未發(fā)病的15頭仔豬的組織樣本進(jìn)行了PCV2核酸檢測，結(jié)果顯示，2頭發(fā)病仔豬均為PCV2陽性，15頭未發(fā)病仔豬中有3頭為PCV2陽性，經(jīng)進(jìn)一步測序發(fā)現(xiàn)，兩頭發(fā)病仔豬中一頭感染了PCV2d基因型毒株，另一頭感染了PCV2b基因型毒株，3頭未發(fā)病仔豬均為PCV2b基因型毒株感染，推測本試驗(yàn)檢測豬群中感染的PCV2基因型仍以PCV2b為主，但出現(xiàn)了PCV2d基因型毒株導(dǎo)致的感染和發(fā)病。

PCV2基因組有2個(gè)主要的ORF，分別編碼復(fù)制酶Rep/Rep′和衣殼蛋白Cap。前期研究發(fā)現(xiàn)，PCV2 Cap編碼序列的Loop CD區(qū)域(L75PPGGGSN82)可在不改變病毒衣殼結(jié)構(gòu)和入胞能力的情況下插入外源基因[10]。因此，本試驗(yàn)基于臨床獲得的PCV2d基因型毒株基因組，將Cap的Loop CD區(qū)域替換為生物素受體肽BAP編碼序列，構(gòu)建了能融合表達(dá)BAP標(biāo)簽的PCV2d基因型毒株全基因組。BAP是生物素連接酶BirA的底物，BirA-BAP系統(tǒng)是一種原核生物蛋白質(zhì)翻譯后生物素化修飾系統(tǒng)[11]。BirA可特異性地識別BAP，并將生物素分子共價(jià)結(jié)合至BAP的賴氨酸殘基上。這種利用BirA-BAP系統(tǒng)的生物素化標(biāo)記，已被用于純化蛋白、標(biāo)記抗體、蛋白功能研究和構(gòu)建生物素標(biāo)記重組病毒等[11-12]。本試驗(yàn)將構(gòu)建的能融合表達(dá)BAP標(biāo)簽的PCV2d全基因組DNA經(jīng)環(huán)化后，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)BirA的PK15細(xì)胞，利用BirA-BAP系統(tǒng)獲得了生物素標(biāo)記的PCV2d基因型毒株。這種生物素標(biāo)記的PCV2d基因型毒株將有助于進(jìn)一步研究PCV2d基因型毒株的感染與免疫逃避機(jī)制。但是，這種PCV2d基因型毒株衣殼上標(biāo)記的生物素能否持續(xù)穩(wěn)定的存在，還需要多代次的擴(kuò)增后進(jìn)一步檢測。

綜上所述，本試驗(yàn)從臨床發(fā)病豬群中獲得了1株P(guān)CV2d基因型毒株全基因組序列，以此毒株序列為基礎(chǔ)，利用BirA-BAP系統(tǒng)構(gòu)建了生物素標(biāo)記PCV2d基因型毒株感染性克隆，獲得了生物素標(biāo)記的PCV2d毒株，為后續(xù)開展PCV2d基因型毒株免疫逃避機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。