金昱，呂璐

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，山東濟(jì)南 250011）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy）是糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]的一種特定微型血管并發(fā)癥，以視網(wǎng)膜血管改變?yōu)椴±硖卣?，主要臨床表現(xiàn)為眼底視網(wǎng)膜滲出水腫、新生血管、出血及增殖膜形成等，可導(dǎo)致患者視力下降甚至失明[2]。石斛作為名貴中藥材，性微寒，味甘，歸胃、腎經(jīng)，具有益胃生津，滋陰清熱之功效，可用于目暗不明、陰傷津虧、口干煩渴等癥。石斛的常用制劑方法有水提取和醇提取，可有效提取石斛中極性較大的成分。已有研究顯示，采用乙醇提取的石斛提取物較水提物的抑癌作用高[3]。石斛乙醇提取物也已被證實(shí)有提高機(jī)體自身免疫，抑制血管形成，緩解眼部疲勞，改善糖尿病及炎性癥狀、眼部循環(huán)等作用[4-7]。因此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建T2DM模型，探討石斛乙醇提取物對(duì)T2DM大鼠視網(wǎng)膜血管生成的作用及機(jī)制，以期為石斛乙醇提取物相關(guān)藥物的研發(fā)和T2DM的臨床治療提供基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取105只8周齡SPF級(jí)雄性健康大鼠，體質(zhì)量為180~220 g，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0002。大鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2018-0015，環(huán)境：溫度23~25℃，相對(duì)濕度50%~70%，光照晝夜交替循環(huán)12 h/12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物、試劑與儀器 鐵皮石斛（干燥莖），購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院藥房；羥苯磺酸鈣（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030087），南京長(zhǎng)澳制藥有限公司生產(chǎn)。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），北京Solarbio公司；白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，美國(guó)Abcam公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒，美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗大鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）多抗，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）多抗，美國(guó)Bioworld公司；羊抗兔二抗-辣根過(guò)氧化物酶（HRP），美國(guó)Abcam公司。光學(xué)顯微鏡，深圳市諾視奇科技有限公司；電泳儀、垂直電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 石斛乙醇提取物的制備參照文獻(xiàn)方法[8]，取鐵皮石斛干燥莖，用10倍量不同濃度的乙醇回流提取，合并提取液后減壓濃縮，經(jīng)濾過(guò)、萃取、減壓回收，硅膠柱色譜分離后，采用制備薄層及重結(jié)晶等方法進(jìn)行純化，得到提取物。

1.4 建模、分組與干預(yù)方法T2DM建模方法[9]：隨機(jī)選取85只大鼠禁食1 d，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，一次性給予尾靜脈注射35 mg·kg-1STZ溶液誘導(dǎo)T2DM模型，送回鼠籠飼養(yǎng)。3 d后血糖儀檢測(cè)血漿空腹血糖（FPG），F(xiàn)PG≥16.7 mmol·L-1即為建模成功。取建模成功的80只大鼠，隨機(jī)分為模型組，石斛提取物低、高劑量組與陽(yáng)性藥物組，每組20只；余下20只設(shè)為正常組。參照文獻(xiàn)研究[10]用量并根據(jù)黃繼漢等[11]的動(dòng)物與人體間等效劑量換算公式計(jì)算大鼠給藥劑量。石斛提取物低、高劑量組分別給予石斛乙醇提取物100、300 mg·kg-1灌胃，陽(yáng)性藥物組給予羥苯磺酸鈣5.4 mg·kg-1灌胃，正常組和模型組則給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，持續(xù)12周。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 糖尿病常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 分別在干預(yù)治療后6、12周，各組大鼠禁食1 d，取尾靜脈血，應(yīng)用血糖自動(dòng)檢測(cè)儀、碘（125I）胰島素放射免疫分析試劑盒分別檢測(cè)大鼠血漿FPG、血清空腹胰島素（FINs）含量。

1.5.2 視網(wǎng)膜組織血管變化 末次采血后，每組隨機(jī)選取4只大鼠，采用熒光素眼底血管造影術(shù)檢查（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）法觀察大鼠視網(wǎng)膜組織血管的變化情況。滴入復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，然后注射90 g·L-1特殊藥物熒光素鈉（1 mg·kg-1），采用血管造影儀觀察大鼠視網(wǎng)膜血管的變化情況。

1.5.3 組織樣品采集 FFA法檢查結(jié)束后，處死各組剩余16只大鼠，取視網(wǎng)膜組織，每組取4只大鼠的視網(wǎng)膜組織，置于4%多聚甲醛固定備用，余下大鼠視網(wǎng)膜組織則置于-80℃冰箱存儲(chǔ)備用。

1.5.4 蘇木素-伊紅染色法觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化 取4%多聚甲醛固定備用視網(wǎng)膜組織，石蠟包埋，切片（厚5μm），加熱脫蠟。蘇木素染色（3~5 min），清洗，切片置于1%（V/V）H2O2中浸泡10~30 s，水洗，伊紅染色（20 min）。脫水，透明，中性樹(shù)脂封固，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.5 ELISA法測(cè)定視網(wǎng)膜組織炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量 取-80℃存儲(chǔ)備用視網(wǎng)膜組織，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿、離心，取上清液。按IL-6、IL-1β、TNF-αELISA試劑盒說(shuō)明書步驟操作：抗體包被過(guò)夜（4℃）、洗滌，加入待測(cè)抗原和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗原（37℃、60 min），加底物液（37℃、20 min），加終止液。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算視網(wǎng)膜組織中IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.5.6 PCR法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF基因表達(dá) 取-80℃存儲(chǔ)備用視網(wǎng)膜組織研磨，TRIzol法提取總RNA，測(cè)定RNA純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：1μL Taq聚合酶、1μL上下游引物、4μL模板cDNA、18μL ddH2O。擴(kuò)增條件：預(yù)變性（95℃，300 s）、變性（95℃，30 s）、退火（60℃，30 s），共計(jì)40個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線，降溫（50℃，30 s）。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，重復(fù)3次，取Ct均值。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá) 取-80℃存儲(chǔ)備用視網(wǎng)膜組織，添加RIPA裂解緩沖液，離心，取上清液，以蛋白定量BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，上樣，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，置于5%脫脂牛奶（25℃，封閉2 h），加入HIF-1α（1∶500稀釋）、VEGF（1∶500稀釋）一抗孵育（4℃，24 h），TBST緩沖液洗膜，再加二抗（1∶1 000稀釋）孵育（25℃，2 h），洗膜，曝光，顯影。以ImageJ軟件測(cè)定HIF-1α、VEGF及β-actin條帶灰度值。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平用目標(biāo)條帶與β-actin條帶灰度比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本間進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FPG、FINs值比較表2結(jié)果顯示：干預(yù)后6、12周后FPG、FINs指標(biāo)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組FPG、FINs值升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽(yáng)性藥物組FPG、FINs值降低（P＜0.05）；與陽(yáng)性藥物組比較，石斛提取物低、高劑量組FPG、FINs值升高，但石斛提取物高劑量組與陽(yáng)性藥物組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINs）值比較Table 2 Comparison of FPG and FINs values of rats among various groups （±s）

表2 各組大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINs）值比較Table 2 Comparison of FPG and FINs values of rats among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽(yáng)性藥物組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽(yáng)性藥物組F值P值鼠數(shù)/只20 20 20 20 20 FPG/（mmol·L-1）干預(yù)6周4.76±0.61 17.82±0.97①16.35±0.92①②③12.28±0.85①②11.91±0.78①②740.281＜0.001干預(yù)12周4.64±0.62 17.35±0.94①15.56±0.90①②③11.41±0.52①②11.12±0.67①②863.216＜0.001 FINs/（μU·L-1）干預(yù)6周19.65±1.70 28.84±1.59①24.48±1.17①②③21.37±1.68①②20.98±1.57①②112.295＜0.001干預(yù)12周19.07±1.68 29.50±1.47①23.42±1.10①②③20.23±0.92①②20.02±0.83①②215.011＜0.001

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織血管變化比較圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠眼底血管分布均勻、熒光素?zé)o泄露；模型組大鼠視網(wǎng)膜組織有大量血管生成，且熒光素泄露嚴(yán)重；石斛提取物低劑量組大鼠眼底血管數(shù)量較模型組減少、熒光素泄露量降低，而石斛提取物高劑量組及陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織血管數(shù)量相對(duì)較少、幾乎無(wú)熒光素泄露。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織血管變化比較（FFA法）Figure 1 Comparison of vascular changes in rat retinal tissues among various groups（FFA method）

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化比較圖2結(jié)果顯示：正常組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及內(nèi)外界膜清晰、神經(jīng)纖維層排列整齊，無(wú)顯著病理學(xué)變化；模型組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)疏松、內(nèi)外核層細(xì)胞排列混亂，可明顯觀察到組織水腫；石斛提取物低劑量組視網(wǎng)膜組織細(xì)胞排列稍混亂，出現(xiàn)不同程度組織水腫，神經(jīng)纖維層增厚；石斛提取物高劑量組和陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，神經(jīng)纖維層排列相對(duì)整齊，出現(xiàn)輕微的組織水腫。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化比較（HE染色法，×400）Figure 2 Comparison of histopathologicalchanges in rat retina among various groups（HE staining method，×400）

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子含量比較表3結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05）；石斛提取物低、高劑量組視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平高于陽(yáng)性藥物組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子含量比較Table 3 Comparison of the inflammatory factor content in rat retinaltissues among various groups （±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子含量比較Table 3 Comparison of the inflammatory factor content in rat retinaltissues among various groups （±s，ng·L-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較；④P＜0.05，與石斛提取物低劑量組比較

組別對(duì)照組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽(yáng)性藥物組F值P值鼠數(shù)/只4 4 4 4 4 IL-6 86.24±1.69 131.04±1.76①116.08±1.24①②③97.50±1.58①②③④92.11±1.33①②584.507＜0.001 IL-1β 27.39±1.11 49.63±2.03①43.00±1.95①②③37.46±1.26①②③④32.28±1.87①②107.712＜0.001 TNF-α 285.17±35.12 507.82±42.37①450.69±43.69①②③402.11±38.33①②③④349.03±36.74①②19.245＜0.001

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF基因表達(dá)比較表4結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05）；與陽(yáng)性藥物組比較，石斛提取物低劑量組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量升高（P＜0.05），而石斛提取物高劑量組與陽(yáng)性藥物組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因表達(dá)比較Table 4 Comparison of HIF-1αand VEGF gene expression in rat retinaltissues among various groups （±s）

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因表達(dá)比較Table 4 Comparison of HIF-1αand VEGF gene expression in rat retinaltissues among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽(yáng)性藥物組F值P值鼠數(shù)/只4 4 4 4 4 HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量1.05±0.11 2.61±0.17①2.15±0.16①②③1.67±0.09①②1.76±0.10①②79.580＜0.001 VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量0.97±0.10 2.89±0.21①2.34±0.13①②③1.87±0.12①②1.96±0.17①②86.917＜0.001

2.6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)比較圖3、表5結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；與陽(yáng)性藥物組比較，石斛提取物低劑量組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），而石斛提取物高劑量組與陽(yáng)性藥物組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of HIF-1αand VEGF in rat retinaltissues among various groups （±s）

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of HIF-1αand VEGF in rat retinaltissues among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽(yáng)性對(duì)照組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽(yáng)性藥物組F值P值鼠數(shù)/只4 4 4 4 4 HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量0.60±0.08 0.97±0.10①0.83±0.04①②③0.72±0.05①②0.70±0.01①②19.350＜0.001 VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量0.23±0.05 0.59±0.09①0.47±0.03①②③0.34±0.02①②0.32±0.01①②33.083＜0.001

圖3 各組HIF-1α、VEGF蛋白的Western Blot電泳條帶Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of HIF-1αand VEGF proteins

3 討論

炎癥和血管生成為糖尿病視網(wǎng)膜病變的兩個(gè)主要機(jī)制，其更多地作為相互影響而不是獨(dú)立起作用[12]。本研究采用FFA法結(jié)果顯示：石斛提取物低劑量組大鼠眼底血管數(shù)量較模型組減少、熒光素泄露量降低，而石斛提取物高劑量組及陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織血管數(shù)量相對(duì)較少、幾乎無(wú)熒光素泄露；HE結(jié)果顯示，石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、內(nèi)外核層細(xì)胞排列以及細(xì)胞組織水腫均較模型組呈現(xiàn)出不同程度的改善，其中高劑量組和陽(yáng)性藥物組大鼠視網(wǎng)膜組織改善更為明顯，且療效相當(dāng)。結(jié)果表明，石斛乙醇提取物可有效抑制T2DM大鼠視網(wǎng)膜新生血管形成，改善大鼠視網(wǎng)膜病變。

炎癥是糖尿病和代謝綜合征發(fā)病過(guò)程的核心環(huán)節(jié)。慢性炎癥可引起胰島素抵抗增加和葡萄糖代謝紊亂[13]。本研究結(jié)果顯示：石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平較模型組降低，且高劑量組的改善效果與陽(yáng)性藥物組相當(dāng)。結(jié)果表明石斛乙醇提取物可減輕T2DM大鼠炎性反應(yīng)，改善視網(wǎng)膜病變。

HIF是一種成熟且有效的血管生成刺激劑，可誘導(dǎo)缺氧細(xì)胞促血管生成因子VEGF轉(zhuǎn)錄[14]。HIF-α信號(hào)在炎癥啟動(dòng)或調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[15]。VEGF是視網(wǎng)膜血管通透性和血管生成的有效誘導(dǎo)劑，通過(guò)與相對(duì)應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)并參與新生血管形成[16]。HIF因子蓄積可促進(jìn)VEGF基因表達(dá)，加劇以血管過(guò)度增殖或產(chǎn)生促癌作用為特征的病理變化[17]。本研究結(jié)果顯示，石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽(yáng)性藥物組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)較模型組降低，且高劑量組與陽(yáng)性藥物組療效相當(dāng)，表明石斛乙醇提取物可有效調(diào)控T2DM大鼠視網(wǎng)膜血管的生成作用靶點(diǎn)。

VEGF表達(dá)量與糖尿病視網(wǎng)膜病變程度存在顯著相關(guān)性[18]。已有研究[19]結(jié)果表明，對(duì)T2DM視網(wǎng)膜的保護(hù)作用可通過(guò)調(diào)控HIF-1α/VEGF軸實(shí)現(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照藥物羥苯磺酸鈣可作用于VEGF和相對(duì)應(yīng)受體信號(hào)通路抑制視網(wǎng)膜微血管形成[20]。本研究結(jié)果顯示，石斛乙醇提取物可有效降低T2DM大鼠HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)，效果與羥苯磺酸鈣相當(dāng)，表明石斛乙醇提取物可能通過(guò)抑制HIF-α和VEGF的蛋白表達(dá)，參與調(diào)節(jié)血管生成，從而抑制T2DM大鼠視網(wǎng)膜微血管生成。

綜上所述，石斛乙醇提取物可有效抑制T2DM大鼠眼底視網(wǎng)膜血管生成，其機(jī)制可能與調(diào)控HIF-1α/VEGF軸相關(guān)信號(hào)分子mRNA和蛋白表達(dá)及下游促炎癥因子有關(guān)。