董 楠， 曹穎男

（廣州新華學(xué)院a.醫(yī)學(xué)公共課教學(xué)研究部，b.藥學(xué)院，廣州 510520）

0 引 言

生物化學(xué)實(shí)驗作為重要的實(shí)踐教學(xué)環(huán)節(jié)，在鞏固和加深理論知識、鍛煉學(xué)生掌握實(shí)驗操作技能、提高學(xué)生分析和解決問題能力、培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)治學(xué)的態(tài)度以及創(chuàng)新能力等綜合素質(zhì)的培養(yǎng)上，有著不可替代的作用［1-3］。傳統(tǒng)的生化實(shí)驗教學(xué)檢測手段單一，學(xué)生能掌握到的檢測方法有限，在生化檢測技術(shù)方面的知識得不到拓展，學(xué)生做實(shí)驗缺乏積極性和主動性，達(dá)不到理想的教學(xué)效果，所以將部分研究型儀器拓展到實(shí)驗教學(xué)應(yīng)用中，已成為近年來改進(jìn)實(shí)驗教學(xué)方法的重要手段之一［4-6］。酶標(biāo)儀作為生物檢測技術(shù)常規(guī)儀器被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗、生命科學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域［7-10］，所以掌握該技術(shù)對應(yīng)用型人才的培養(yǎng)至關(guān)重要，但目前酶標(biāo)儀大多應(yīng)用于科研領(lǐng)域，在本科教學(xué)中少有涉及，本研究在生物化學(xué)實(shí)驗教學(xué)過程中引進(jìn)酶標(biāo)儀檢測技術(shù)，該技術(shù)具有操作簡便快速、節(jié)約耗材成本、減少對環(huán)境和儀器污染等優(yōu)點(diǎn)，在教學(xué)過程中能夠提高實(shí)驗效率，激發(fā)學(xué)生實(shí)驗興趣，培養(yǎng)學(xué)生科研創(chuàng)新能力，為學(xué)生今后走向工作崗位打下良好的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗教學(xué)改革設(shè)計依據(jù)

由于酶標(biāo)儀的工作原理與紫外分光光度計的原理類似［11］，基于此可將原來用紫外分光光度計測試的實(shí)驗改進(jìn)后應(yīng)用酶標(biāo)儀進(jìn)行測試。本科生物化學(xué)實(shí)驗涉及用紫外分光光度計測試多為定量測定實(shí)驗，根據(jù)實(shí)驗項目可操作性，將實(shí)驗“3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測還原糖含量”改進(jìn)后，應(yīng)用酶標(biāo)儀代替分光光度計，對番茄汁中總糖含量進(jìn)行測試，并與紫外分光光度計測試方法進(jìn)行對比，體現(xiàn)酶標(biāo)儀檢測方法在實(shí)驗教學(xué)過程中的優(yōu)越性。

2 實(shí)驗部分

2.1 實(shí)驗儀器和試劑

SpectraMax iD3 型酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；HH-ZK8 型恒溫水浴鍋（鄭州英峪予華儀器有限公司）；移液器（上海寶予德科學(xué)儀器有限公司）。

番茄汁（新鮮）；實(shí)驗用水均為arium mini plus 超純水機(jī)制備。

HCl溶液（6 mol/L）；NaOH 溶液（6 mol/L）；酚酞指示劑；3，5-二硝基水楊酸溶液（DNS）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲液（0.2 mg/mL）；總糖樣品（濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL）。

2.2 實(shí)驗操作方法

（1）番茄總糖溶液制備。番茄榨汁后放入離心管中，3 000 r/min 離心10 min，取出。取番茄上清液1 mL加入大試管中，再加入6 mol/L 鹽酸5 mL，沸水浴30 min，取出，冷卻后轉(zhuǎn)移至100 mL 燒杯中，加入20 mL蒸餾水。滴入1 滴酚酞，用6 mol/L NaOH中和溶液后定容至100 mL 容量瓶中，即待測番茄總糖溶液。

（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0，20，40，…，200 μL到1 ～11 號小試管，每個試管中加蒸餾水至總體積200 μL，再加入200 μL DNS混勻，沸水浴4 min，取出冷卻，每管中加入1.600 mL蒸餾水混勻。各取200 μL 樣品依次加入酶標(biāo)板中（3 個平行樣），用酶標(biāo)儀在波長540 nm 下測試各樣品吸光度值，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值（A540）為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）番茄總糖含量測定。取200 μL 待測總糖溶液到小試管中，加入200 μL DNS，沸水浴4 min，取出冷卻，每管加入1.600 mL蒸餾水混勻，取200 μL樣品加入酶標(biāo)板中，540 nm 波長下用酶標(biāo)儀進(jìn)行測試，計算番茄總糖含量：

式中：C為總糖含量（g/L）；M為測得的糖含量（μg）；V為加樣體積（μL）；N為樣品稀釋倍數(shù)。

（4）加標(biāo)回收率試驗。量取5 種不同濃度總糖樣品各200 μL，加入到5 支小試管中，分別加入葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)儲液200 μL，再加入200 μL DNS，沸水浴4 min，取出冷卻，加入1.400 mL 蒸餾水混勻。各取200 μL樣品加到酶標(biāo)板中，540 nm 波長下用酶標(biāo)儀進(jìn)行測試，計算加標(biāo)回收率。

2.3 實(shí)驗教學(xué)實(shí)施方法

教師講解完實(shí)驗內(nèi)容后，帶領(lǐng)學(xué)生進(jìn)入儀器室講解演示酶標(biāo)儀的操作方法、測試注意事項以及數(shù)據(jù)的處理方法，之后學(xué)生回到課室進(jìn)行上述實(shí)驗操作內(nèi)容，2 人/組，15 組/班，完成實(shí)驗操作過程后，每組學(xué)生將加好樣品的酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中依次進(jìn)行測試。

為規(guī)范學(xué)生操作，統(tǒng)一規(guī)定酶標(biāo)板中加樣模式如圖1 所示，每個樣品均設(shè)置3 個平行樣呈垂直分布，綠色孔為空白樣（1 號標(biāo)準(zhǔn)樣作為空白樣）；粉色孔區(qū)依次為標(biāo)準(zhǔn)樣1 ～11 號；紅色孔區(qū)依次為未知樣1 ～6

號，標(biāo)紫色底線的1 號未知樣，即總糖含量待測樣，標(biāo)綠色底線的2 ～6 號未知樣，即加標(biāo)回收率試驗待測樣。學(xué)生需將所有樣品均加入酶標(biāo)板后一次完成測試。

圖1 酶標(biāo)板中加樣模式

2.4 結(jié)果與討論

葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程如圖2 所示，R2值為0.997 1，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，酶標(biāo)儀測得標(biāo)準(zhǔn)樣結(jié)果數(shù)據(jù)如表1 所示，1 ～11 號為標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗的標(biāo)準(zhǔn)樣測試結(jié)果，以1 號標(biāo)準(zhǔn)樣作為空白樣，測試時樣品與空白樣的吸光度值自動相減，差值即為樣品的吸光度測試結(jié)果值，因為酶標(biāo)儀精確度較高，測得的1號標(biāo)準(zhǔn)樣可能會有微小數(shù)值（可能為負(fù)值），同時因3個平行樣數(shù)值很小，即便微小差值也會導(dǎo)致CV 異常變大（如1 號標(biāo)準(zhǔn)樣CV）。檢測結(jié)果顯示SD 值在0.001 ～0.014 之間，CV 值基本小于5%，具有較好的精確度和準(zhǔn)確性，說明酶標(biāo)儀檢測方法適用于糖含量測定實(shí)驗。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

表1 標(biāo)準(zhǔn)樣品測試數(shù)據(jù)結(jié)果

1 ～6 號未知樣測試結(jié)果數(shù)據(jù)如表2 所示，1 號未知樣為番茄汁總糖含量測試結(jié)果，3 組平行樣均值為47.48 μg，代入式（1）中可計算出番茄汁中總糖含量為23.74 mg/mL。

表2 未知樣品測試數(shù)據(jù)

為培養(yǎng)學(xué)生科研創(chuàng)新能力，增設(shè)加標(biāo)回收率試驗，結(jié)果見表2 中2 ～6 號樣品數(shù)據(jù)，未知樣的SD值較小，CV值均小于5%，說明測試結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確性和精密度，回收率計算結(jié)果見表3，5 種總糖樣品回收率在97% ～110%之間，平均值為104.31%，且RSD ＜5%，說明采用酶標(biāo)儀檢測方法測試番茄汁中總糖含量方法準(zhǔn)確可靠。

表3 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果

DNS比色法是常用的多糖含量測試方法，一般采用紫外分光光度計為測定儀器，但由于其樣品池位數(shù)有限，樣品較多或多波長測定時，操作時間較長，步驟繁瑣，極大地影響了學(xué)生實(shí)驗效率［12］，同時因測試時間長，對于不穩(wěn)定的樣品可能會造成實(shí)驗結(jié)果誤差。本實(shí)驗采用酶標(biāo)儀代替分光光度計進(jìn)行總糖含量測試，在文獻(xiàn)［13-14］研究的基礎(chǔ)上，選取合適的測量波長和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度，同時通過前期實(shí)驗探索出總糖溶液制備最佳條件、回收率試驗5 種總糖樣品的適宜濃度以及可行的實(shí)驗操作實(shí)施方案，最后通過實(shí)踐測得實(shí)驗數(shù)據(jù)結(jié)果良好，大大提高學(xué)生實(shí)驗效率，與紫外分光光度計方法對比，酶標(biāo)儀檢測技術(shù)在測試時間、操作過程、實(shí)驗結(jié)果以及創(chuàng)新性等方面體現(xiàn)出優(yōu)良的特性，具體如表4 所示。

本實(shí)驗采用的SpectraMax iD3 型多功能酶標(biāo)儀具有光吸收、發(fā)光和熒光3 種功能，根據(jù)不同功能可以進(jìn)行生物化學(xué)實(shí)驗中的DNA、RNA及蛋白定量和純度檢測、ELISAS/酶學(xué)動力學(xué)檢測、細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖檢測、綠熒光蛋白檢測、激酶和ATP酶分析等實(shí)驗，為我校醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)的學(xué)生進(jìn)行科研實(shí)驗學(xué)習(xí)研究提供了有力保障。

表4 酶標(biāo)儀檢測方法與紫外分光光度法的對比

學(xué)生實(shí)驗課全程表現(xiàn)出較高的學(xué)習(xí)熱情，實(shí)驗操作過程認(rèn)真積極，并會針對感興趣的知識點(diǎn)及操作要點(diǎn)等提出問題，教學(xué)互動氛圍良好，普遍受到學(xué)生歡迎。后續(xù)可根據(jù)學(xué)生實(shí)驗教學(xué)內(nèi)容需要，以學(xué)生興趣班、選修課以及大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目等形式，開展相關(guān)生化實(shí)驗項目研究，拓展學(xué)生課外實(shí)驗操作技能，提高學(xué)生自主科研創(chuàng)新能力。

3 結(jié) 語

將科研儀器應(yīng)用到本科生物化學(xué)實(shí)驗教學(xué)當(dāng)中已成為現(xiàn)在高等教育改革中非常重要的環(huán)節(jié)之一［4］，隨著酶標(biāo)儀的廣泛使用，其被證實(shí)可替代分光光度計，測試的結(jié)果數(shù)據(jù)線性關(guān)系良好，具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性。采用酶標(biāo)儀檢測技術(shù)進(jìn)行本科生物化學(xué)實(shí)驗教學(xué)能夠提高學(xué)生實(shí)驗效率，培養(yǎng)學(xué)生科研實(shí)驗技能，拓寬學(xué)生專業(yè)知識面，同時也能激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，提高綜合素質(zhì)，更能適應(yīng)當(dāng)今社會對人才培養(yǎng)的需求。