康正樾，馮瀟鈴，廖洪建，張志飛，杜永洪

(重慶醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院 超聲醫(yī)學工程國家重點實驗室重慶市生物醫(yī)學工程學重點實驗室，重慶 400016)

目前臨床對三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)多采用聯(lián)合治療[1]。高強度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound, HIFU)將超聲波聚焦于體內(nèi)病灶靶點區(qū)，通過熱效應、機械效應和空化效應對病灶進行消融[2]；但長時間HIFU輻照可致機體升溫，并存在聲通道損傷等安全問題。液態(tài)氟碳納米粒(nanoparticle, NP)可于HIFU輻照下發(fā)生液氣相變而產(chǎn)生空化核，降低空化效應閾值，增強其生物學效應[3]。本研究制備包載PFH并與AS1411適配體連接的特異性靶向TNBC可降解AS1411/PFH-NP[4]，觀察其與HIFU聯(lián)合治療TNBC的價值。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備 聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]-PEG50/50-COOH(濟南岱罡生物科技有限公司)；CHCl3，異丙醇(重慶市川東有限公司)；聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)，十四氟己烷(perfluorohexane, PFH)，1,1-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiI)，4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)， 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)，N-hydroxysuccinimide(NHS)，瓊脂糖(Sigma)；MES(Thermo Fisher Scientific)；核酸適配體AS1411，F(xiàn)AM熒光標記核酸適配體AS1411-FAM[生工生物工程(上海)股份有限公司]。細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8，Dojindo)，XL2020型聲振儀(Sonics)，透射電鏡(transmission electron microscope，TEM，Hitachi)，馬爾文激光粒度儀(Zetasizer)，光學顯微鏡(Olympus)，激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM，Nikon)，CytoFLEX(Beckman Counter，Inc.)，聚焦超聲腫瘤治療系統(tǒng)(JC200型，重慶海扶醫(yī)療科技股份有限公司)，Mylab 90(Esaote)，ImageJ軟件(美國國立衛(wèi)生研究院)，多功能酶標記儀器(ThermoFisher)。

1.2 制備AS1411/PFH-NP 取40 mg PLGA-PEG50/50-COOH完全溶解于2 ml CHCl3溶液作為油相，加入200 ml PFH作為水相，在冰浴中采用聲振儀乳化得到初乳，再加入4% PVA溶液4 ml，繼續(xù)在冰浴中以聲振儀乳化形成復乳，之后加入8 ml異丙醇溶液并攪拌、離心、洗滌，凍干后得到PFH/PLGA@NP。采用碳二亞胺法稱取20 mg PFH/PLGA@NP完全重懸于5 ml MES中(pH為5.5，0.1 mol/L)，并按PFH/PLGA@ NPs∶EDC∶NHS=1∶2∶2比例加入EDC、NHS，充分活化后重懸于5 ml MES中(pH為8.0，0.1 mol/L)，加入 1 ml AS1411(1 μmol/L)后置于搖床上振蕩過夜，經(jīng)離心(10 000 rpm，10 min)洗滌后得到靶向AS1411/PFH-NP。以雙蒸水為水相，采用雙乳化法得到空白NP。

1.3 檢測物理特性 采用馬爾文粒徑儀檢測AS1411/PFH-NP粒徑和Zeta電位，以TEM觀察其形態(tài)。以上述方法制備DiI熒光標記的AS1411-FAM/PFH-NP后，采用CLSM觀察經(jīng)FAM綠色熒光修飾的核酸適配體AS1411與經(jīng)DiI紅色熒光標記的AS1411/PFH-NP的連接情況，以流式細胞儀定量檢測其連接率。將1 ml AS1411/PFH-NP懸液(1 mg/ml)置于1.5 ml EP管，分別置于37、58及80℃水浴中30 s，以光學顯微鏡觀察其相變能力。

1.4 檢測細胞毒性 將處于對數(shù)生長期的MB-231 TNBC細胞和LO-2人正常肝臟細胞以2×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板并孵育24 h(37℃，5% CO2)，去除培養(yǎng)基后，以無血清細胞培養(yǎng)基(100 μl/孔)將消毒的AS1411/PFH-NP配制為不同濃度溶液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mg/ml)，置于96孔培養(yǎng)板中，各設6個重復孔；孵育24 h后，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌；再向每孔中加入含10% CCK-8試劑的無血清培養(yǎng)基100 μl，孵育 4 h后，以多功能酶標記儀器檢測細胞在450 nm波長下的吸光度，即光密度(optical density, OD)，計算各濃度下細胞存活率：細胞存活率=(ODNP-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100%；其中NP表示含細胞、培養(yǎng)基及AS1411/PFH-NP，blank表示含培養(yǎng)基、不含細胞及AS1411/PFH-NP，control表示含細胞及培養(yǎng)基、不含AS1411/PFH-NP。

1.5 檢測MB-231 TNBC細胞靶向能力 以1×105/孔將MB-231細胞接種于CLSM培養(yǎng)皿中孵育24 h；按照上述方法分別制備DiI熒光標記的PFH-NP和AS1411/PFH-NP；將所有細胞分為2組：①非靶向組，含DiI熒光標記PFH-NP的培養(yǎng)基(2 mg/ml)；②靶向組，含DiI熒光標記AS1411/PFH-NP的培養(yǎng)基(2 mg/ml)。將2組細胞分別與相應培養(yǎng)基共孵育4 h后，以4%多聚甲醛固定細胞15 min，再以DAPI進行細胞核染色10 min；每個步驟結(jié)束后均以PBS洗滌細胞3次。最后在CLSM下觀察NP與細胞的結(jié)合情況。

1.6 體外超聲成像 預先制備3%瓊脂糖凝膠體膜，內(nèi)有1.5 ml 離心管形狀的半開放凹槽，用于盛放樣品液。將1 ml PBS、1 ml 空白NP(2 mg/ml)及1 ml AS1411/PFH-NP(2 mg/ml)分別置于3%瓊脂糖凝膠體模中，即PBS組、NP組及AS1411/PFH-NP組；以HIFU輻照凹槽中心處(距開口20 mm，100 MHz，120 W/cm2，5 s)。于B-Mode和增強超聲造影(contrast enhanced ultrasound, CEUS)模式下以MyLab90采集超聲圖像，以ImageJ軟件定量測量CEUS圖像中的ROI(HIFU輻照焦點及凹槽內(nèi)垂直于聲束方向的圓形截面，Φ=12.7 mm)的平均灰度值。

1.7 HIFU聯(lián)合AS1411/PFH-NP消融離體牛肝組織 以真空脫氣裝置去除3塊長方體離體牛肝組織(12 cm×10 cm×8 cm)中的空氣，分別針對超聲聚焦超聲換能器聲束方向距牛肝組織表面4 cm處(即消融區(qū))注射200 μl PBS、200 μl 空白NP(2 mg/ml)及200 μl AS1411/PFH-NP(2 mg/ml)后行HIFU輻照，消融點間距>3 cm；采用機載超聲診斷儀監(jiān)測消融區(qū)HIFU輻照前、后圖像平均灰度值變化。之后沿平行于聲束方向切開牛肝組織，以ImageJ軟件計算3塊牛肝組織的消融體積和超聲能效因子(energy efficiency factor, EEF)[5]：消融體積=π/6×消融后凝固性壞死區(qū)長度×凝固性壞死區(qū)寬度×凝固性壞死區(qū)厚度；EEF=ηPt/V，其中η=0.7，為換能器聚焦系數(shù)，P為總輻照聲功率(W)，t為總輻照時間(s)，V為凝固性壞死體積(mm3)。

1.8 HIFU聯(lián)合AS1411/PFH-NP殺傷體外MB-231 TNBC細胞 將處于對數(shù)生長期的MB-231細胞以1×106/孔接種于6孔板中并孵育24 h并分為HIFU組、AS1411/PFH-NP組、HIFU+AS1411/PFH-NP組及未干預組；清除培養(yǎng)基后，對HIFU組和未干預組均加入不含AS1411/PFH-NP的無血清培養(yǎng)基，對AS1411/PFH-NP組和HIFU+AS1411/PFH-NP組均加入含AS1411/PFH-NP(2 mg/ml)的無血清培養(yǎng)基，共同孵育4 h后以PBS清洗并以0.25%胰酶(不含EDTA)消化3 min，加入PBS制成細胞懸液并轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中；對HIFU組和HIFU+AS1411/PFH-NP組以HIFU輻照(100 MHz，120 W/cm2，5 s)離心管中心處，對AS1411/PFH-NP組和未干預組不作輻照處理；對各組以1 000 rpm離心5 min、洗滌2次，最終分別將1×106個細胞重懸于PBS(pH為7.2)500 μl中備用。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用 GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計分析軟件。以±s表示符合正態(tài)分布的計量資料，采用單因素方差分析進行多組間比較，以Dunnett法進行2組間比較，針對差異有統(tǒng)計學意義的數(shù)據(jù)行t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AS1411/PFH-NP物理特性 透射電鏡下AS1411/PFH-NP呈球形，形態(tài)良好、大小均一，分散性較佳(圖1A)，粒徑為(249.70±4.72)nm，Zeta電位為(-3.46±0.77)mV(圖1B、1C)。光鏡下觀察，37℃條件下AS1411/PFH-NP未見明顯相變，58℃及80℃條件下均可見顯著相變，且程度隨溫度升高而增加(圖1D～1F)，表明PFH成功包載。

CLSM下，F(xiàn)AM修飾的核酸適配體AS1411呈綠色熒光(圖2A)，DiI標記的AS1411/PFH-NP呈紅色熒光(圖2B)，并見顯著熒光重疊(圖2C)；流式細胞儀檢測顯示二者連接良好，連接率58.11%(圖2D)。

2.2 AS1411/PFH-NP細胞毒性 共孵育的AS1411/PFH-NP濃度為0.25～2.00 mg/ml時，不同濃度下LO-2人正常肝臟細胞活性無明顯差異；濃度升至4.00 mg/ml時， LO-2細胞活性降低(t=2.335，P<0.05，圖3A)；與濃度0.25 mg/ml相比，AS1411/PFH-NP濃度為2.00 mg/ml時，TNBC MB-231細胞活性降低(t=2.952，P<0.05，圖3B)，故本研究以2.00 mg/ml為AS1411/PFH-NP最適濃度進行后續(xù)實驗。

2.3 以AS1411/PFH-NP檢測MB-231細胞靶向能力CLSM示MB-231細胞核呈藍色熒光，所制DiI熒光標記PFH-NP和DiI熒光標記AS1411/PFH-NP均呈紅色熒光；靶向組見AS1411/PFH-NP顯著聚集于細胞核及細胞周圍，非靶向組未見明顯紅色熒光聚集，表明AS1411/PFH-NP對MB-231乳腺癌細胞具有良好靶向能力。見圖4。

2.4 體外超聲成像 AS1411/PFH-NP組CEUS圖像灰度值大于PBS組及NP組(t=17.24、5.60，P均<0.05)。見圖5。

2.5 HIFU聯(lián)合AS1411/PFH-NP消融離體牛肝組織 經(jīng)HIFU+AS1411/PFH-NP消融后，牛肝組織凝固性壞死區(qū)體積大于HIFU+PBS(t=7.99，P<0.01)及HIFU+NP消融(t=4.33，P<0.05)；經(jīng)HIFU+AS1411/PFH-NP后，消融區(qū)EEF顯著小于HIFU+PBS(t=5.41，P<0.01)及HIFU+NP消融區(qū)(t=4.82，P<0.01)。見表1及圖6。

表1 HIFU聯(lián)合不同方法體外消融離體牛肝組織效果比較(n=3)

2.6 HIFU聯(lián)合AS1411/PFH-NP殺傷MB-231乳腺癌細胞 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，HIFU+AS1411/PFH-NP組MB-231細胞凋亡率高于其他組(P均<0.05)。見圖7及表2。

3 討論

應用HIFU協(xié)同增效劑可提高HIFU消融效率及安全性。傳統(tǒng)微泡造影劑成像效果雖佳，但無法透過血管內(nèi)皮細胞間隙，故不能用于細胞水平成像及治療，且其熱、化學穩(wěn)定性差，難以實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。液態(tài)氟碳具有化學和生物學惰性等特殊理化性質(zhì)，且能降低空化效應閾值，加強HIFU對靶區(qū)組織的殺傷效果[6]。PLGA生物安全性良好，已用于臨床[7]。本研究制備的載PLGA的AS1411/PFH-NP可于HIFU輻照下發(fā)生液氣相變，增加空化核，提高HIFU消融效率及殺傷腫瘤細胞效果。

使NP具有主動靶向性有助于HIFU增效劑盡可能聚集于乳腺癌靶區(qū)、延長NP在腫瘤組織中的滯留時間。本研究以核酸適配體AS1411修飾載PFH的NP，使其可借助AS1411與MB-231細胞連接并被攝取入胞，MB-231細胞活力在與AS1411/PFH-NP結(jié)合24 h后下降，考慮主要原因在于TNBC細胞表面過表達核仁素，可特異性識別適配體AS1411，后者對不同腫瘤細胞均有抑制生長作用[8]。

超聲觀察顯示，AS1411/PFH-NP組均可見細小點狀中等回聲信號，PBS組及NP組均見弱回聲，且AS1411/PFH-NP組CEUS圖像灰度值顯著大于PBS組及NP組，表明AS1411/PFH-NP具有良好超聲顯影能力，有助于監(jiān)控HIFU消融；這是由于AS1411/PFH-NP直徑較大，具有液態(tài)氟碳內(nèi)核的空腔結(jié)構，可于超聲作用下產(chǎn)生背向反射[9]。

本研究以離體牛肝組織作為實驗對象檢測AS1411/PFH-NP聯(lián)合HIFU消融效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HIFU+AS1411/PFH-NP消融后，牛肝組織凝固性壞死體積顯著大于HIFU+PBS及HIFU+NP消融后，而HIFU+AS1411/PFH-NP消融區(qū)EEF顯著低于HIFU+PBS及HIFU+NP消融區(qū)，表明AS1411/PFH-NP聯(lián)合HIFU可提高消融能力；分析原因，主要在于HIFU輻照使PFH發(fā)生液氣相變，改變了局部聲學環(huán)境，導致能量沉積增加[10]，且外來空化核亦可增強HIFU生物學效應。HIFU聯(lián)合AS1411/PFH-NP亦能協(xié)同殺傷體外MB-231細胞、促進腫瘤細胞凋亡，可能由于AS1411/PFH-NP增強HIFU空化效應、熱效應及機械效應，且伴隨空化效應產(chǎn)生的高速微射流及剪切力亦對殺滅腫瘤細胞具有一定作用[11]。

綜上所述，本研究制備的特異性靶向TNBC AS1411/PFH-NP可提高體外HIFU消融效率。