孫光強(qiáng)，薛玉葉，陸云陽，杜洋，王媛媛，方菲，紀(jì)玉強(qiáng)，程光，湯海峰，*，邱鵬程*

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心藥劑科，北京 100142；3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室，西安 710032；4. 西安市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西安 710002；5. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，西安 710032）

膠質(zhì)瘤是中樞性惡性腫瘤的一種，目前臨床上主要采用手術(shù)聯(lián)合放化療治療，但患者對其一線化療藥物替莫唑胺的耐藥問題不容忽視[1]。同時(shí)，膠質(zhì)瘤具有四高一低的發(fā)病特點(diǎn)，即高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率、高致殘率和低治愈率[2]。因此，尋找一種新型的膠質(zhì)瘤的化療藥物具有十分重要的意義。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）是一種細(xì)胞炎性程序性死亡方式，主要通過炎癥小體介導(dǎo)包含caspase-1 在內(nèi)的多種caspase 蛋白的激活，造成包括GSDMD 在內(nèi)的多種Gasdermin 家族成員發(fā)生剪切和多聚化，造成細(xì)胞穿孔，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡[3-4]。相比于凋亡（apoptosis），焦亡發(fā)生更快，并伴隨著大量促炎癥因子的釋放[5]。大量的證據(jù)表明細(xì)胞焦亡能夠影響腫瘤的發(fā)展，可作為潛在的腫瘤治療策略，為患者開發(fā)基于焦亡的新藥提供思路[6]。

重樓皂苷H（結(jié)構(gòu)式見圖1，paris saponin H，PSH）屬于偏諾皂苷元型甾體皂苷，在百合科重樓屬多種植物中大量存在，本課題組先后從川產(chǎn)南重樓和陜產(chǎn)具柄重樓、狹葉重樓、云南重樓中分離鑒定了該化合物。據(jù)報(bào)道，PSH 具有抗腫瘤、抗炎、抗凝等作用[7-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PSH 通過A1 和A3 腺苷受體途徑，抑制膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖[9]，但其對耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制研究尚無報(bào)道，尤其未見其誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的報(bào)道。故本研究基于細(xì)胞凋亡和焦亡對PSH 抗耐藥膠質(zhì)瘤機(jī)制進(jìn)行初步探討。

圖1 重樓皂苷H 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of paris saponin H

1 材料

1.1 細(xì)胞來源

耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞株由本課題組前期研究建立成功[10]。

1.2 儀器

超凈工作臺（Thermo Fisher），CO2恒溫培養(yǎng)箱（ESCO 公司），倒置顯微鏡（Olympus），血球計(jì)數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司），Multiskan FC 酶標(biāo)儀（賽默飛公司），流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur），透射電子顯微鏡（JEOL，JEM-1400），電泳系統(tǒng)（Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）， 熒光定量PCR 儀（BIONEER，Exicycler 96）， 紫外分光光度計(jì)（Thermo，NANO 2000），真空干燥箱（SYSBERY 公司），微量移液器（BIOHIT 公司，Proline），超純水系統(tǒng)（Heal 公司，NW10LVF），超速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀公司）。

1.3 試藥

重樓皂苷H（寶雞翊瑞生物科技有限公司，純度：99.45%，批號：JOT-11279），CCK-8 試劑盒（Elabscience，批號：E-CK-A362），Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BD，批號：556547），DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，批號：11965092），胎牛血清（Biological Industries，批號：04-121-1A），胰蛋白酶（Solarbio，批號：T1300），青鏈霉素混合液（Solarbio，批號：P1400），Cleaved-caspase-1 抗體（Cell Signaling Technology，批號：4199T）、N-GSDMD 抗體（abcam，批號：ab215203）、Cleavedcaspase-3 抗體（批號：19677-1-AP）、Bax 抗體（批號：50599-2-AP）、Bcl-2 抗體（批號：12789-1-AP）、IL-1β抗體（批號：16806-1-AP）、IL-18 抗體（批號：10663-1-AP）、NLRP3 抗體（批號：19771-1-AP）、β-actin 抗體（批號：20536-1-AP）（Proteintech），TRIpure（BioTeke，批號：RP1001），BeyoRT II M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（碧云天，批號：D7160L），RNase inhibitor（BioTeke，批號：RP5602），2×Taq PCR MasterMix（Solarbio，批號：PC1150），SYBR Green（Solarbio，批號：SY1020），其他試劑均為國產(chǎn)分析純，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將SHG44R 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期的SHG44R 細(xì)胞接種于96 孔板中。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度用DMSO 配制的PSH，培養(yǎng)不同時(shí)間后，棄上清液，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測量各孔的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

取對數(shù)生長期的SHG44R 細(xì)胞，PBS 洗滌，加入6 μg·mL-1的PSH，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，用2%戊二醛溶液固定2 h，隨后PBS 洗滌2 次，每次10 min。然后在1% 四氧化鋨溶液中固定2 h。用乙醇梯度脫水后，將細(xì)胞包埋在環(huán)氧樹脂中并切成 50 ～60 nm 的切片。切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。透射電子顯微鏡分析切割樣品。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的SHG44R 細(xì)胞，接種于6 孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度的PSH（6、12 μg·mL-1）處理24 h。收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI 雙染色細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡雙染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.5 Western blot 法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

將細(xì)胞消化后接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度的PSH（6、12 μg·mL-1）處理細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞制備蛋白樣品，10%聚丙烯胺-SDS 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST 洗3 次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST 洗3 次。加入ECL 化學(xué)發(fā)光液后放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光。

2.6 RT-qPCR 檢測焦亡相關(guān)mRNA 表達(dá)

取對數(shù)生長期的SHG44R 細(xì)胞，接種于6 孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，加入3 μg·mL-1的PSH 處理24 h。收集細(xì)胞，加入Trizol 試劑提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，除去培養(yǎng)基，PBS 洗1次，除去PBS，每組加入1 mL Trizol 后放置于冰面，輕搖使Trizol 試劑充分接觸5 min。RT-qPCR檢測PSH 給藥組（3 μg·mL-1）與對照組SHG44R細(xì)胞caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3的mRNA 的表達(dá)，采用2-△△CT法計(jì)算mRNA 相對表達(dá)量。

caspase-1：Forward，ATTACAGACAAGGGTGCT；Reverse，CTTTCGGAATAACGGAGT；

caspase-11：Forward，GCACAATGGGCTCTATCT；Reverse，CAGTCGTTCTATGGTGGG；

GSDMD：Forward，GGTTAGGAAGCCCTCAAGC；Reverse，CATGGCATCGTAGAAGTGG；

IL-1β：Forward，TATTACAGTGGCAATGAGG；Reverse，ATGAAGGGAAAGAAGGTG；

IL-18：Forward，ATAGCCAGCCTAGAGGTA；Reverse，ATCAGGAGGATTCATTTC；

NLRP3：Forward，CCCCGTGAGTCCCATTA；Reverse，GACGCCCAGTCCAACAT；

β-actin：Forward，GGCACCCAGCACAATGAA；Reverse，TAGAAGCATTTGCGGTGG。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用Graphpad prism 8 軟件完成，數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異通過單因素方差分析檢驗(yàn)（One-way ANOVA），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PSH 對耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞活力的影響

采用CCK-8 法檢測不同劑量PSH 處理24、48、72 h 對細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果表明PSH抑制SHG44R 細(xì)胞增殖具有時(shí)間和劑量依賴性。PSH 在24 h 對SHG44R 的IC50＝6.986 μg·mL-1，見圖2。

圖2 PSH 對SHG44R 細(xì)胞活力的影響Fig 2 Effect of PSH on the cell viability of SHG44R cells

3.2 PSH 對耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

如圖3所示，與正常組相比，PSH 組出現(xiàn)核染色質(zhì)固縮、核膜皺褶，細(xì)胞器集中，出現(xiàn)凋亡小體，表明PSH 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，細(xì)胞膜有輕微損傷，提示PSH 可能誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡。

圖3 PSH 對SHG44R 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響Fig 3 Effect of PSH on the cell morphology of SHG44R cells

3.3 PSH 誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步證實(shí)PSH 介導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測給予PSH 后細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果表明PSH 呈劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（見圖4）。

圖4 PSH 對SHG44R 細(xì)胞凋亡的影響（n ＝3）Fig 4 Effect of PSH on the cell apoptosis of SHG44R cells（n ＝3）

3.4 PSH 對耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞凋亡的蛋白的影響

采用Western blot 法檢測不同劑量PSH 處理后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，給予PSH 可使Bax、Cleaved-caspase-3 蛋白上調(diào)，Bcl-2 蛋白下調(diào)（見圖5）。

圖5 PSH 對SHG44R 細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白的影響Fig 5 Effect of PSH on the key proteins of cell apoptosis in SHG44R cells

3.5 PSH 誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞焦亡

如圖6所示， 與正常組相比，PSH 組caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18和NLRP3 的mRNA 表達(dá)量顯著增加。進(jìn)一步采用Western blot 法檢測不同劑量PSH 處理后細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，給予PSH 使Cleaved-caspase-1、Cleaved-N-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3 蛋白上調(diào)（見圖7）。蛋白表達(dá)和基因水平結(jié)果一致，說明PSH 可誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞焦亡。

圖6 PSH 對SHG44R 細(xì)胞焦亡GSDMD 通路相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響（n ＝3）Fig 6 Effect of PSH on the expression of mRNA related to the GSDMD pathway of pyroptosis of SHG44R cells（n ＝3）

圖7 PSH 對SHG44R 細(xì)胞焦亡GSDMD 通路相關(guān)蛋白的影響Fig 7 Effect of PSH on GSDMD pathway pyroptosis-related proteins in SHG44R cells

4 討論

耐藥是膠質(zhì)瘤臨床治療面臨的重要問題。天然產(chǎn)物是抗腫瘤先導(dǎo)化合物的重要來源[11]，從中藥中尋找具有抗耐藥膠質(zhì)瘤作用的活性成分具有重要意義。既往研究已報(bào)道重樓皂苷抗腫瘤的多種作用機(jī)制，主要包括抑制增殖、凋亡、影響遷移與侵襲、阻滯細(xì)胞周期、聯(lián)合一線化療藥物輔助治療、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、氧化應(yīng)激、改變腫瘤細(xì)胞膜通透性、抑制胞內(nèi)藥物外流，抑制血管增生、誘導(dǎo)自噬等[7-8，12]。但關(guān)于重樓皂苷對細(xì)胞焦亡等新型細(xì)胞死亡方式的影響的報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，PSH 可抑制耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)SHG44R 細(xì)胞凋亡和焦亡。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，是多數(shù)重樓皂苷引起腫瘤細(xì)胞死亡的常見機(jī)制[13-14]。其中內(nèi)源性通路是由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白調(diào)節(jié)，如Bcl-2 蛋白家族蛋白[15-16]，當(dāng) Bax/Bcl-2 比值發(fā)生變化，線粒體通透性增加，線粒體破裂，促凋亡蛋白細(xì)胞色素C 將從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活下游caspase 家族[17-18]。caspase-8 和caspase-9 作為caspase 的啟動(dòng)子，最終激活下游凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，通過裂解細(xì)胞底物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，重樓皂苷H 可顯著上調(diào)SHG44R 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleavedcaspase-3、Bax 表達(dá)水平，顯著降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平，表明重樓皂苷H 可誘導(dǎo)SHG44R 細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞焦亡在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長中起著關(guān)鍵作用[19]。與其他細(xì)胞死亡方式相比，具有獨(dú)特的形態(tài)和機(jī)制[20-21]。Gasdermin 家族蛋白是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，其誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的機(jī)制比較明確，同時(shí)也是其經(jīng)典途徑[22]。一方面，在外界的刺激下，細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體（NLR）作為感受器，識別信號，通過接頭蛋白ASC 與Pro-caspase-1 結(jié)合，形成多蛋白復(fù)合物，激活caspase-1，活化的caspase-1 一方面切割GSDMD，形成含有GSDM-NT 活性域的肽段，誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞破裂，釋放內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)；另一方面，活化的caspase-1 對IL-1β和IL-18 前體進(jìn)行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細(xì)胞聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)其是由炎性小體組裝介導(dǎo)的，伴隨著GSDMD裂解及IL-1β和IL-18 的釋放[23]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，PSH 可顯著上調(diào)SHG44R 細(xì)胞中caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3 的mRNA 表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)Cleavedcaspase-1、Cleaved-N-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18 和NLRP3，表明重樓皂苷H 可誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞焦亡。

綜上所述，PSH 能夠抑制耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡與焦亡。