鄭 志 ，姜林娟，朱 瑜，樸丙熙, ，權(quán)英珠

（1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2. 韓陵醫(yī)藥研究院有限公司，江蘇 南京211100；3. 萊帕堅（株）公司，韓國 首爾 04393；4. 梨花女子大學(xué) 藥學(xué)院，韓國 首爾 04393）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種急性或慢性腸道炎性疾病，其間潰瘍反復(fù)發(fā)生[1]。局部長期慢性炎癥的結(jié)果是腸纖維化，慢性炎癥的反復(fù)刺激會使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過多沉積，從而導(dǎo)致管腔直徑減小、腸道狹窄甚至?xí)l(fā)生腸梗阻，加重患者癥狀[2]。UC在我國的發(fā)病率迅速升高，尤其慢性UC已成為常見的消化系統(tǒng)疾病[3-4]。慢性UC的病程遷延反復(fù)，需長期用藥和復(fù)查，不僅給患者帶來巨大的身心痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也耗費了大量的醫(yī)療資源。目前慢性UC尚無規(guī)范化治療，發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確。鞣花酸是一種天然酚類，主要分布于堅果、軟果中，具有抗氧化、抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻斷病毒感染、抑制炎癥等生物活性功效[5]。研究報道，含鞣花酸成分的扎沖十三味丸通過多靶點調(diào)控，發(fā)揮抗炎作用，但其組成成分較多，化學(xué)成分復(fù)雜，復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究[6]。本研究采用硫酸葡聚糖鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)UC動物模型，探討鞣花酸對UC的改善效果及對環(huán)氧化酶2（COX2）、蛋白激酶p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、核因子κB抑制蛋白α（IκB-α）、核因子κB（NF-κB）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、3-硝基酪氨酸（3-NT）、細(xì)胞色素P450 2E1（CYP2E1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1（IL-1）及一氧化氮（NO）水平的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Micro17微量離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；SX-300高溫高壓滅菌鍋（日本Tomy公司）；SDS-PAGE電泳儀（美國Bio-Rad公司）；ECL Plus蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)（美國Cytiva公司）；HR-6型手持式組織勻漿機(jī)（上海瀘析公司）；CX21光學(xué)生物顯微鏡（日本Olympus公司）；Pannoramic MIDI數(shù)字切片掃描儀（匈牙利3DHistech公司）。

1.2 材料

鞣花酸（美國Sigma-Aldrich，純度＞99 %）；DSS[美國安培生物醫(yī)療器械貿(mào)易（上海）有限公司]；iNOS，3-NT，CYP2E1，COX2，磷酸化JNK（p-JNK），磷酸化ERK（p-ERK），磷酸化p38（p-p38），磷酸化IκB-α（p-IκB-α），磷酸化NF-κB（p-NF-κB）抗體及其二抗，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，美國圣克魯斯生物技術(shù)公司）。PierceTMBCA蛋白定量檢測試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）；TNF-α，IL-1β，NO酶聯(lián)免疫試劑盒（美國R&D Systems公司）。

1.3 動物

30只雄性8周齡BALB/c小鼠購于北京維通利華實驗動物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22±2 ℃、濕度55 %±8 %，正常飲食，12 h白/暗調(diào)節(jié)（07:00～19:00）環(huán)境。

2 方法

2.1 DSS誘導(dǎo)炎癥小鼠模型及動物分組

DSS劑量參考文獻(xiàn)[5,7]設(shè)置，預(yù)實驗后確定為60 mg/kg。小鼠進(jìn)行一周適應(yīng)性飼養(yǎng)，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為：正常組，自由飲水+經(jīng)口灌胃生理鹽水；模型組，自由飲用5 % DSS溶液+經(jīng)口灌胃生理鹽水溶液；給藥組，自由飲用5 %DSS溶液+經(jīng)口灌胃鞣花酸溶液（7 g/L）。連續(xù)7 d。所有動物實驗均在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會的倫理審查和監(jiān)督下完成。

2.2 生物組織樣本的采集

實驗結(jié)束后，所有動物用CO2處死，心臟采血，12 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，-70 ℃保存。從底部切除腸組織5 cm，肉眼觀察其損傷程度，并稱重。剪出離肛門1 cm的腸組織，用PBS（pH 7.4）緩沖溶液洗3次，稱重。取5 mg組織，添加含0.5 %十六烷基三甲基溴化銨的50 mmol/L PBS（pH 6.0），用手持式組織勻漿機(jī)勻漿3次，每30 s一次；-70 ℃冷凍3 h，37 ℃條件下解凍，其過程反復(fù)3次。組織勻漿液在12 000g條件下離心15 min，取上層液， -70 ℃保存。其他腸組織和肝組織用4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗3遍，放入10 %中性福爾馬林溶液中，用于組織病理學(xué)分析。

2.3 小鼠結(jié)腸和肝組織病理學(xué)分析

采用傳統(tǒng)蘇木素-伊紅染色法（hematoxylineosin staining，HE）進(jìn)行。將固定好的胃和結(jié)腸組織水洗，依次經(jīng)不同濃度乙醇溶液和無水乙醇脫水，用二甲苯和石蠟混合液包埋，切片，厚度為5 μm，烘干，HE染色，封片，用Pannoramic MIDI數(shù)字切片掃描儀對各組織切片進(jìn)行掃描拍照，觀察上皮細(xì)胞的損傷及炎癥浸潤等。

2.4 血液中炎癥因子水平測定

采用酶聯(lián)免疫試劑盒測定小鼠血清中TNF-α、IL-1β和NO水平。

2.5 Western blot檢測

用PierceTMBCA蛋白定量檢測試劑盒檢測各結(jié)腸勻漿液中蛋白質(zhì)濃度。取勻漿液（蛋白質(zhì)含量50 μg）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，于5 %脫脂奶粉中封閉，再分別經(jīng)iNOS、3-NT、CYP2E1、COX2、p-JNK、p-ERK、p-p38、p-IκB-α及p-NF-κB抗體標(biāo)記，室溫下孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（TBST）洗3次，二抗孵育2 h，再用TBST洗3次，最后用高效化學(xué)發(fā)光液（ECL）顯色，利用ECL Plus蛋白質(zhì)印跡檢測系統(tǒng)拍照記錄并分析。以上操作重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，通過SPSS16.0處理分析數(shù)據(jù)，組間樣本比較采用t檢驗，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鞣花酸對UC小鼠結(jié)腸和肝臟的影響

鞣花酸對UC小鼠結(jié)腸和肝臟的影響見圖1。由圖1可見，DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸明顯縮短變窄，均有萎縮、充血、潰瘍和壞死等表現(xiàn)，結(jié)腸的長度為4.2±0.8 cm，結(jié)腸重量為0.4±0.1 g，肝臟重量為0.6±0.2 g，與正常組小鼠（結(jié)腸長度為7.5±1.0 cm，結(jié)腸重量為0.8±0.1g，肝臟重量為1.7±0.3 g）相比，顯著降低（P＜0.05），表明5 %DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型成功建立。給藥組小鼠結(jié)腸表面光澤、完整，未出現(xiàn)萎縮、充血、潰瘍、壞死等，結(jié)腸無明顯縮短、變窄。結(jié)果還顯示，給藥組小鼠與模型組小鼠相比，結(jié)腸的長度（5.9±0.7 cm）、重量（0.6±0.1 g）顯著恢復(fù)（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，給藥組小鼠的肝臟重量為1.2±0.2 g，與模型組小鼠相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明鞣花酸具有改善急性UC的作用。

圖1 鞣花酸對潰瘍結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸和肝臟的影響（n=10）

3.2 小鼠結(jié)腸和肝組織病理學(xué)分析結(jié)果

病理分析結(jié)果見圖2、圖3。由圖2可見，模型組小鼠結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)大量炎細(xì)胞浸潤，隱窩消失、環(huán)狀細(xì)胞減少，黏膜下層出現(xiàn)水腫。給藥組小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞完整，隱窩、環(huán)狀細(xì)胞損傷、水腫程度較輕。由圖3可見，模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)大量細(xì)胞核破壞和損傷（圖3B箭頭所示），但給藥組小鼠肝臟未發(fā)現(xiàn)明顯損傷（圖3C箭頭所示），說明鞣花酸能減輕腸和肝臟組織的炎癥程度和組織學(xué)損傷。

圖2 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)分析結(jié)果（HE染色×200）

圖3 小鼠肝臟組織病理學(xué)分析結(jié)果（HE染色×200）

3.3 血清炎癥因子水平

血清炎癥因子測定結(jié)果見圖4。血清中TNF-α，IL-1β，NO高水平表達(dá)是急性炎癥的典型特征。模型組小鼠血清中TNF-α水平為415±22 ng/L，IL-1β水平為720±30 ng/L，NO水平為 635±20 mol/L，與正常組（TNF-α水平為390±26 ng/L，IL-1β水平為570±50 ng/L，NO水平為550±12 mol/L）相比，均顯著增高（P＜0.05）。給藥組小鼠的TNF-α水平為370±10 ng/L，IL-1β水平為420±30 ng/L，NO水平為530±20 mol/L，與模型組小鼠比較，顯著降低（P＜0.05），說明鞣花酸能抑制血清中炎癥因子的表達(dá)，這與組織病理學(xué)分析結(jié)果一致。

圖4 血液中炎癥因子（TNF-α，IL-1β，NO）表達(dá)水平測定結(jié)果（n=10）

3.4 抗氧化因子Western blot檢測結(jié)果

抗氧因子能通過抑制自由基的產(chǎn)生，清除、熄滅活性氧自由基，從而減少基因或蛋白質(zhì)的氧化損傷。小鼠血清中抗氧化因子（iNOS、3-NT、CYP2E1）的Western blot檢測結(jié)果見圖5。模型組小鼠血清中iNOS（100±4.1）、3-NT（100±6.0）、CYP2E1（10 240±10.0）的表達(dá)水平，與正常組（iNOS為25±5.0、3-NT為40±4.1、CYP2E1為23±3.2）相比明顯增高（P＜0.01）。給藥組小鼠的iNOS（54±4.2）、3-NT（70±4.0）、CYP2E1（53±3.1）的表達(dá)水平，與模型組小鼠相比明顯被抑制（P＜0.05），說明鞣花酸能抑制抗氧化因子，這與血清中炎癥因子分析結(jié)果一致。

圖5 抗氧化因子（iNOS，3-NT，CYP2E1）Western blot檢測結(jié)果（n=10）

3.5 抗炎癥因子Western blot檢測結(jié)果

COX2及MAPK信號通路磷酸化激活后轉(zhuǎn)錄因子（p-ERK，p-p38，p-IκB-α，p-NF-κB）是主要抗炎癥因子，小鼠血清中抗炎癥因子的Western blot檢測結(jié)果見圖6。DSS誘導(dǎo)的小鼠血清中COX2（100±5.0）、p-JNK（100±6.1）、p-ERK（100±8.2）、 p-p38（100±4.0）、p-IκB-α（100±3.9）、p-NF-κB（100±8.2）的表達(dá)水平與正常組（COX2為41±4.1、p-JNK為44±3.9、p-ERK為62±6.0、p-p38為70±8.1、p-IκB-α為56±5.9、p-NF-κB為25±10.0）相比，均顯著增高（P＜0.05）。鞣花酸處理的試驗組小鼠的抗炎癥因子表達(dá)水平（COX2為46±6.0、p-JNK為62±6.0、p-ERK為75±2.1、p-p38為82±5.9、p-IκB-α為63±4.1、p-NF-κB為40±3.0）與模型組小鼠比較，均顯著被抑制（P＜0.05），說明鞣花酸能抑制抗氧化因子，這與血清中炎癥因子和抗氧化因子水平分析的結(jié)果一致。

圖6 抗炎癥因子Western blot檢測結(jié)果（n=10）

4 討論

本研究選取天然酚類──鞣花酸，探討其對5 %DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)鞣花酸對UC小鼠的結(jié)腸和肝臟組織具有改善作用，能緩解炎癥程度和組織學(xué)損傷，其作用與MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎癥信號通路與CYP2E1/iNOS/3-NT氧化應(yīng)激通路有關(guān)。

4.1 鞣花酸抑制MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎癥信號通路

MAPK信號通路的主要樞紐包括p-38、JNK、ERK等，通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵樞紐, 介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡等[7]。其中，磷酸化激活后的JNK（p-JNK）是各種應(yīng)激原作用中信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵因子；磷酸化激活后的ERK（p-ERK）是多種炎癥反應(yīng)中的必須因子；磷酸化激活后的p-38（p-p-38）參與細(xì)胞炎癥和凋亡。故轉(zhuǎn)錄因子p-JNK、p-ERK、p-p-38是治療UC的重要的藥物靶點[8]。有研究報道，MAPK下游的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)控多種促炎因子的表達(dá)，并參于炎癥性腸病[8]，而NF-κB的抑制蛋白IκB是此通路的中間環(huán)節(jié)。NF-κB和IκB參與急性/慢性炎癥、組織纖維化、細(xì)胞凋亡等病理生理過程，還能調(diào)控促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等的轉(zhuǎn)錄水平[9]。其中，TNF-α是炎癥反應(yīng)相關(guān)重要啟動細(xì)胞因子，在UC發(fā)生時其高表達(dá)可加重炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)病理性損傷的增大。IL-1β是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌，介導(dǎo)機(jī)體炎癥調(diào)控與免疫應(yīng)答，其高表達(dá)與UC炎癥的發(fā)生也有密切關(guān)系[10]。Yu等[11]報道有效抑制NF-kB和MAPK信號通路，便會減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。本研究的結(jié)果顯示鞣花酸顯著降低模型小鼠血清TNF-α、IL-1β釋放（P＜0.05），認(rèn)為這可能與MAPK/IκB-α/NF-κB通路的抑制有關(guān)。

此外，NF-κB能下游調(diào)控COX2的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致COX2表達(dá)增多，從而促進(jìn)多種炎性遞質(zhì)產(chǎn)生，擴(kuò)大和持續(xù)炎癥發(fā)生[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組動物結(jié)腸組織中COX2、IκB-α、NF-κB、p-JNK、p-ERK、p-p38蛋白表達(dá)顯著高于正常組（P＜ 0.05），說明該炎癥細(xì)胞因子群的高表達(dá)與DSS誘導(dǎo)的UC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。上述細(xì)胞因子屬于炎癥信號通路的關(guān)鍵因子，因此，鞣花酸可能是基于MAPK/IκB-α/NF-κB/COX2炎癥通道發(fā)揮抗炎作用，從而顯著減少促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的釋放。

4.2 鞣花酸抑制CYP2E1/iNOS/NO/3-NT氧化通路

疾病條件下，氧化應(yīng)激的增加可增加炎性細(xì)胞因子釋放，而炎性細(xì)胞因子的增加可刺激自由基的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。有研究表明，CYP2E1在脂肪酸氧化過程中產(chǎn)生過量的ROS[13], 誘導(dǎo)iNOS的生成，進(jìn)而調(diào)節(jié)血紅素氧合酶1（HO-1）表達(dá)[14]。而超氧化物存在下形成的NO高表達(dá)，通過與蛋白質(zhì)上的酪氨酸殘基反應(yīng)形成3-NT，導(dǎo)致包括非酒精性脂肪性肝病或阻塞性肺病等高氧性組織損傷。UC患者發(fā)炎黏膜中的管腔隱窩細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的 3-NT 表達(dá)也增加[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組動物血液和結(jié)腸組織中CYP2E1、iNOS、NO、3-NT的表達(dá)顯著均高于正常組（P＜0.05），說明CYP2E1/iNOS/NO/3-NT通路與DSS誘導(dǎo)的UC發(fā)生密切相關(guān)。鞣花酸對UC小鼠模型結(jié)腸組織中過量表達(dá)的CYP2E1、iNOS、NO、3-NT均有下調(diào)作用（P＜0.05）, 表明鞣花酸改善UC可能是基于對CYP2E1/iNOS/3-NT抗氧化應(yīng)激通路的抑制。本研究的病理組織形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，鞣花酸顯著改善了DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的腸和肝臟組織的炎癥程度和組織學(xué)損傷。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸抑制MAPK/IκB-α/NF-κB/COX及CYP2E1/iNOS/3-NT通路，從而顯著減少TNF-α、IL-1β、NO釋放，進(jìn)而產(chǎn)生改善UC的作用。但抗氧抗炎涉及信號通路較多，本研究還有待于更深入探索。