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連翹苷體內(nèi)外抗病毒及解熱作用機(jī)制

2022-08-08 07:56郭健敏秦麗莉陳文培代彩玲吳琪琪威1
中國藥理學(xué)通報(bào) 2022年8期
關(guān)鍵詞:連翹流感病毒抗病毒

郭健敏,富 力,秦麗莉,陳文培,代彩玲,梁 純,吳琪琪,楊 威1,

(1.廣東省科學(xué)院動(dòng)物研究所,廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510260;2.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司,廣東省藥物非臨床評(píng)價(jià)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評(píng)價(jià)分中心,廣東 廣州 510990;3.香港科技大學(xué),香港 999077;4. 大連富生天然藥物開發(fā)有限公司,遼寧 大連 116000)

感冒是最常見的急性呼吸道感染性疾病,發(fā)生率較高。目前臨床上主要以非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥、甾體類藥物或復(fù)方中藥制劑,聯(lián)合抗病毒藥物治療感冒[1]。但這些藥物服用后均表現(xiàn)出不同程度的副作用或者僅有解熱、抗病毒某一方面的療效[2-4]。連翹是木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物,根據(jù)中國古代經(jīng)典中醫(yī)典籍如《本草綱目》、《神農(nóng)本草經(jīng)》、《證類本草》等記載,連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)和疏散風(fēng)熱等功效[5]。在中國藥典中,有114種中藥制劑含有連翹的成分。連翹在臨床上對(duì)感冒引起的發(fā)熱、頭痛和咽喉腫痛等有確切的治療作用,其中連翹苷(phillyrin, KD-1)是連翹的主要活性成分之一,也是中國藥典作為控制連翹藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)[6]。目前國內(nèi)外對(duì)KD-1的藥理研究主要有抗炎、降血脂、保肝、抗菌、抗病毒及腦神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)方面的作用[7-9],但其抗病毒和解熱的聯(lián)合作用鮮有報(bào)道。本研究擬采用不同呼吸道病毒株體外抗病毒模型,評(píng)價(jià)其體外抗病毒活性,通過流感病毒致小鼠急性肺炎模型和大鼠發(fā)熱模型評(píng)價(jià)KD-1抗病毒、解熱作用,并對(duì)其初步作用機(jī)制探索,為其在治療流感等感染性疾病臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及病毒株MDCK、A549、Vero和HEp-2細(xì)胞;流感病毒株A/H3N2/Hong Kong/8/68(H3N2),人單純皰疹病毒HSV-1、HSV-2,人腺病毒3型AdV-3,人呼吸道合胞病毒RSV,人腸道病毒71型EV71,以及流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/H1N1/FM/1/47(FM1)均購于美國ATCC,病毒株經(jīng)雞胚傳代后保存于-80 ℃低溫冰箱或液氮中。

1.2 動(dòng)物ICR小鼠,(18~22) g,SD大鼠,(250~300) g,均為SPF級(jí),雌雄各半,來源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,生產(chǎn)使用許可證號(hào)為SCXK(湘)2013-0004,2013-0006,飼養(yǎng)溫度(21~25) ℃,相對(duì)濕度40%~70%,12 h/12 h 明暗交替,級(jí)壓差>10 Pa,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(粵)2015-0146。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。

1.3 藥物及主要試劑連翹苷,由大連富生天然藥物開發(fā)有限公司提供,批號(hào):20160401,含量為90.2%;病毒唑注射液,天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司,批號(hào):1606151;利巴韋林片,天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司,批號(hào):16048402;丙泊酚注射液,廣東嘉博制藥有限公司,規(guī)格20 mL,200 mg,批號(hào):1A160210;干酵母,河北馬利食品有限公司,規(guī)格500 g/袋,批號(hào):2016.02.01;DMEM培養(yǎng)基,批號(hào):431594,Gibco;胎牛血清,批號(hào)SV30087.02,美國HyClone;大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β),大鼠環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP),大鼠前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2),大鼠精氨酸加壓素(arginine vasopressin,AVP),大鼠α黑色素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)ELISA檢測(cè)試劑盒均購自大連泛邦試劑有限公司。

1.4 主要儀器BSC1600-Ⅱ-B2型生物潔凈安全柜,蘇州凈化設(shè)備有限公司;3543型二氧化碳培養(yǎng)箱,美國Thermo;ELx808酶標(biāo)儀,美國BioTek;ST5020型多功能染色機(jī)、病理圖像分析系統(tǒng),德國LEICA。

1.5 KD-1體外抗病毒活性測(cè)定

1.5.1病毒毒力測(cè)定[10]將不同濃度(10-4~102PFU·L-1)的病毒液分別接種到96孔板中(長(zhǎng)成單層細(xì)胞時(shí)接種),流感病毒接種于MDCK細(xì)胞,腺病毒接種于A549細(xì)胞,皰疹病毒接種于Vero細(xì)胞,合胞病毒接種于HEp-2細(xì)胞,每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。于35 ℃,5% CO2培養(yǎng)5 d觀察細(xì)胞情況,根據(jù)Reed-Muench法,計(jì)算各病毒的半數(shù)感染量(TCID50)。

1.5.2KD-1對(duì)細(xì)胞毒性的測(cè)定[11]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分別加入96孔板中,待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,棄培養(yǎng)液,換含有不同濃度的藥液,置37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱,培養(yǎng)5 d,用MTT比色法在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(OD值)。計(jì)算細(xì)胞抑制率,計(jì)算半數(shù)中毒濃度(TC50)和最大無毒濃度(TC0)。

1.5.3KD-1對(duì)病毒致細(xì)胞病變作用測(cè)試[12]分別加入不同濃度的病毒至細(xì)胞中,吸附1 h,用PBS洗去病毒液,加入對(duì)細(xì)胞無毒的KD-1和病毒唑注射液,每一病毒稀釋度各加4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照組,陰性對(duì)照組,陽性藥物對(duì)照組(病毒唑注射液)。并置于35 ℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),連續(xù)5 d,在倒置顯微鏡下觀察病變,做好病變記錄。然后用細(xì)胞MTT比色法,在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(OD值),計(jì)算KD-1的IC50值和選擇指數(shù)(Selection Index,SI),SI=TC50/IC50,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 KD-1對(duì)流感病毒感染FM1小鼠所致肺炎的干預(yù)60只ICR小鼠適應(yīng)性觀察3 d,♀♂各半,按體質(zhì)量和性別隨機(jī)分成6組,10只/組。根據(jù)等效體表面積換算人的等效劑量,設(shè)KD-1劑量設(shè)為3.25、6.5、13 mg·kg-1以及正常對(duì)照組、模型組和陽性對(duì)照組利巴韋林片58.5 mg·kg-1;除正常對(duì)照組外,各組均于感染前1 d開始灌胃給藥,連續(xù)5 d,正常對(duì)照組和模型組給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5% CMC-Na)。各組動(dòng)物用丙泊酚注射液按12 mg·kg-1淺麻醉,除空白組用生理鹽水外,其余各組滴鼻50 μL小鼠流感病毒感染,感染量為15 TCID50,所有動(dòng)物于感染后96 h進(jìn)行解剖,取小鼠的肺進(jìn)行稱質(zhì)量,計(jì)算肺指數(shù)。一部分肺組織勻漿后測(cè)定血凝滴度,一部分用于HE染色法觀察肺組織病理變化。肺指數(shù)計(jì)算公式:肺指數(shù)=肺質(zhì)量/體質(zhì)量(g/g)。

1.7 KD-1對(duì)干酵母誘導(dǎo)SD大鼠發(fā)熱的干預(yù)[13-14]90只SD大鼠,雄性,除正常對(duì)照組外,其余大鼠皮下注射20%干酵母10 mL·kg-1,測(cè)定大鼠造模5 h后體溫,再根據(jù)選擇體溫升高0.8~2.0 ℃的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組,陽性對(duì)照組(對(duì)乙酰氨基酚),KD-1低、中、高劑量組,每組至少9只體溫合格動(dòng)物。分組后給予相應(yīng)的藥物10 mL·kg-1,KD-1劑量設(shè)為13.5、40.5、121.5 mg·kg-1,空白和模型對(duì)照組給予等容積的0.5% CMC-Na。測(cè)定動(dòng)物給藥后1、2 h的體溫,并計(jì)算其與基礎(chǔ)體溫的差值(△T)。待動(dòng)物體溫測(cè)定完畢后,動(dòng)物腹主動(dòng)脈采血安樂死,取血漿和下丘腦的組織勻漿,雙夾心ELISA法測(cè)定IL-1β、cAMP、PGE2、AVP、α-MSH含量。

1.8 KD-1分子對(duì)接驗(yàn)證在PubChem網(wǎng)站通過以“phillyrin”為關(guān)鍵詞,得到KD-1的2D、3D化學(xué)結(jié)構(gòu)式,保存為“SDF”格式,并將其轉(zhuǎn)換為“pdbqt”格式;從PDB數(shù)據(jù)庫和Uniprot數(shù)據(jù)庫中下載IL-1β、cAMP、PGE2、AVP、α-MSH蛋白結(jié)構(gòu)。利用AutoDock Tools軟件處理該蛋白結(jié)構(gòu)之后,設(shè)置對(duì)接盒子大小以及對(duì)接參數(shù),利用AutoDock vina軟件進(jìn)行對(duì)接。最后通過PyMol軟件的繪制得出對(duì)接結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 KD-1體外抗病毒活性KD-1可減輕病毒引起的細(xì)胞病變程度,對(duì)H3N2、HSV-1、HSV-2、AdV-3、RSV和EV71均具有一定的抑制作用,SI值均>2。

2.2 KD-1對(duì)流感病毒感染FM1小鼠所致肺炎的影響如Fig 2,與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組肺指數(shù)明顯增加(P<0.01);與模型對(duì)照組相比,各給藥組的肺指數(shù)、血凝滴度均可顯示出明顯降低的趨勢(shì)(P<0.01或P<0.05)。

2.3 肺組織病理變化結(jié)果如Fig 3所示,模型對(duì)照組支氣管腔內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤,肺間質(zhì)增寬,大量炎細(xì)胞浸潤,成片肺泡腔實(shí)變,肺泡腔內(nèi)浸潤大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞,亦可見大量均只淡然滲出液,呈明顯的滲出性炎癥反應(yīng),提示小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的病毒性肺炎,造模成功。與模型對(duì)照組比較,各給藥組小鼠肺組織病變程度明顯減輕,特別對(duì)間質(zhì)性肺炎改善明顯。

Fig 1 KD-1 showed high anti virus activity in H3N2, HSV-1,HSV-2, AdV-3, RSV and EV71 in vitro cell n=3)

Fig 2 Effects of KD-1 on lung index and blood agglutination titer of FM1 infected n=10)

Fig 3 Effect of KD-1 on lung pathogenesis of FM1 infected mice(HE×100)

Fig 4 Effect of KD-1 on cytokine content in plasma and hypothalamus of dry yeast-induced fever rat

Fig 5 Docking results of KD-1 with 5 related protein molecules

2.4 KD-1對(duì)大鼠發(fā)熱模型解熱及作用機(jī)制解熱作用結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組造模后5 h、給藥后1 h、2 h動(dòng)物體溫升高值均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比,各給藥組明顯降低1 h、2 h的體溫升高值(P<0.05或P<0.01),提示著均有明顯的解熱作用。結(jié)果如Fig 4所示,與正常對(duì)照組相比,模型組血漿AVP含量降低(P<0.05),IL-1β、cAMP 、PGE2、α-MSH含量未見明顯改變。與模型組相比,對(duì)乙酰氨基酚組PGE2含量明顯降低(P<0.05)。KD-1低劑量組AVP、α-MSH含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。KD-1中高劑量組IL-1β、PGE2、AVP含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與正常對(duì)照組相比,模型組下丘腦cAMP含量降低(P<0.05),IL-1β、AVP、PGE2、α-MSH含量未見明顯改變。與模型組相比,對(duì)乙酰氨基酚組PGE2、α-MSH含量明顯降低(P<0.01)。KD-1低、中、高劑量組IL-1β、PGE2含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

2.5 KD-1分子對(duì)接驗(yàn)證在PDB數(shù)據(jù)庫和Uniprot數(shù)據(jù)庫中得到了以下相關(guān)蛋白信息,利用AutoDock Vina分別計(jì)算出各個(gè)相關(guān)蛋白的最低結(jié)合能。從表中可以看出KD-1與蛋白的最低結(jié)合能均<-5 kcal·mol-1,所需能量越低,說明結(jié)合能越好。因此,分子對(duì)接結(jié)果可以驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)的研究。

3 討論

流感發(fā)生的主要原因是由呼吸道病毒感染,從而引發(fā)急性呼吸道感染。越來越多的天然產(chǎn)物以其獨(dú)特的多靶點(diǎn)用于預(yù)防和治療流感,顯示出良好的作用及其較小的毒副作用而引起了研究者的廣泛關(guān)注[15-16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),KD-1在TC0條件下對(duì)H3N2、HSV-1、HSV-2、AdV-3、RSV和EV71均有一定的抑制作用,而且SI>2,結(jié)果提示KD-1是連翹抗呼吸道病毒的有效物質(zhì)。

Tab 1 Effect of KD-1 on temperature rise of dry yeast-induced febrile rat model

Tab 2 Affinity and target information of KD-1 and inflammatory factors

流感病毒感染可導(dǎo)致炎癥、肺損傷,這些組織病理學(xué)方面的改變將增加肺的質(zhì)量[17]。為了評(píng)價(jià)KD-1對(duì)流感病毒導(dǎo)致的肺損傷的保護(hù)作用,本研究選用肺組織的血凝滴度、肺指數(shù)和肺組織病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行KD-1體內(nèi)抗流感病毒活性的研究。Nguyen等[18]研究發(fā)現(xiàn),KD-1到達(dá)體內(nèi)后可明顯的改善流感病毒所致的小鼠肺組織損傷,從而達(dá)到顯著延長(zhǎng)小鼠平均存活時(shí)間的效果。本研究結(jié)果表明:經(jīng)流感病毒感染后的ICR小鼠,在灌胃給予KD-1后,各給藥組的血凝滴度和肺指數(shù)較模型對(duì)照組相比明顯減少,提示KD-1可抵抗流感病毒侵蝕肺部,這與Qu等[17]報(bào)道的KD-1體內(nèi)抗流感病毒的研究結(jié)果相一致。肺病理組織學(xué)顯示KD-1可減輕肺部病變程度,特別是對(duì)病毒感染間質(zhì)性肺炎改善明顯,KD-1對(duì)流感的治療可能是通過抗病毒和抗炎兩者共同起效發(fā)揮作用。

發(fā)熱是病毒感染機(jī)體后的一個(gè)主要癥狀,而細(xì)菌、病毒、炎癥性滲出物等都是常見的外源性致熱源。當(dāng)外源性致熱源進(jìn)入機(jī)體后,刺激機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性致熱源,并作用于體溫調(diào)節(jié)中樞使產(chǎn)熱增加、散熱減少而引起發(fā)熱。本研究選用了干酵母致大鼠發(fā)熱的模型評(píng)價(jià)KD-1的解熱作用,并初步的考察其解熱的作用機(jī)制。KD-1在給藥后1~2 h對(duì)發(fā)熱大鼠模型的體溫均有明顯降低的趨勢(shì),表明了KD-1具有明顯的解熱作用。在解熱機(jī)制的研究中,選用了體溫調(diào)節(jié)正向介質(zhì)IL-1β、cAMP和PGE2,負(fù)向調(diào)節(jié)介質(zhì)AVP、α-MSH進(jìn)行相關(guān)研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明,KD-1對(duì)模型大鼠血漿和下丘腦中cAMP含量均未見明顯影響,表明其解熱作用可能不是通過調(diào)節(jié)cAMP通路發(fā)揮的,而KD-1和對(duì)乙酰氨基酚均可降低血漿和下丘腦中PGE2的含量。KD-1結(jié)構(gòu)中有與非甾體類藥物類似的結(jié)構(gòu),因此從構(gòu)效關(guān)系的角度分析KD-1能夠降低PGE2的作用可能與該結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

綜上,KD-1具有較好的抗呼吸道病毒的作用,可明顯改善肺組織病毒性間質(zhì)性肺炎的病變,同時(shí)對(duì)外源性致熱源誘發(fā)的發(fā)熱具有明顯的解熱作用,作用機(jī)制與降低PGE2和IL-1β等炎性物質(zhì)和炎癥因子相關(guān)。推測(cè)KD-1可通過抗病毒、解熱及抗炎的綜合作用“標(biāo)本兼治”起到抗流感的作用。

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