王越業(yè)，賈成艷，許 媛，許和鵬，陳阿圓，魏 偉，常 艷

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽醫(yī)科大學(xué)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎研究中心，安徽 合肥 230032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎為主要特征的自身免疫病[1]。色氨酸(tryptophan，Trp)作為哺乳動物的重要氨基酸，主要通過犬尿氨酸(kynurenine，Kyn)途徑(kynurenine pathway，KP)代謝，在限速酶的作用下生成中間代謝物Kyn[2]。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液Trp水平降低，Kyn水平升高[3-4]，提示RA患者體內(nèi)Trp代謝異常。吲哚胺-2，3-雙加氧酶1(indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1)、吲哚胺-2，3-雙加氧酶2 (indoleamine2，3-dioxygenase 2，IDO2)和色氨酸2，3-雙加酶(tryptophan 2，3 dioxygenase，TDO)是KP通路的重要限速酶[2]。IDO1在機體廣泛表達(dá)，在RA中的作用存在爭議，既有抗炎作用又有促炎作用，IDO1基因敲除加重膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠關(guān)節(jié)炎癥，但減輕K/BxN小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀；IDO2研究較少，尚不明確其生物學(xué)功能，近年來研究發(fā)現(xiàn)在RA中具有促炎作用[5]。TDO在腫瘤中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤異?；罨痆5]，但在RA中的表達(dá)和作用未見文獻(xiàn)報道。

系統(tǒng)Trp水平和肝臟Kyn水平主要由TDO調(diào)控，一般用肝臟Kyn/Trp比值代表其酶活性高低[6]。別嘌醇(allopurinol，ALLO)在臨床上主要用于治療痛風(fēng)[7]。有研究表明ALLO抑制大鼠肝臟TDO的活性[8]，另有報道ALLO還可抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)和CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)[9-10]，但ALLO是否通過調(diào)控TDO介導(dǎo)的KP代謝異常發(fā)揮治療大鼠關(guān)節(jié)炎作用尚不清楚，因此本研究旨在探究ALLO對RA模型大鼠的作用及其潛在部分機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SD ♂大鼠購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，7周，(140～160)g，合格證號：SCXK2016-0006。飼養(yǎng)于清潔級實驗室，恒溫恒濕，不限食物和水，適應(yīng)1周后開展后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑及儀器別嘌醇片(合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號：066379，規(guī)格：0.1 g/片)；甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)片(上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：036181105，規(guī)格：2.5 mg/片)；卡介苗(新華區(qū)群碩實驗用品銷售部，批號202001)；Anti-rat CD4 FITC(批號：B253594) 和Anti-rat Foxp3 PE(批號：B275698)購自Biolegend公司；Anti-rat IL-17A PE(批號：1995433) 和Anti-rat CD25 APC(批號：4300566)購自eBioscience公司；Anti-rat CD68 PE(批號：VXl022011A)購自miltenyi公司；L-Trp (批號：WXBC6361V)和L-Kyn(批號：BCBX8788) 購自SIGMA-ALORICH公司；高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；流式細(xì)胞儀和高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)(美國Beckman Coulter公司)。

1.3 模型制備與評價卡介苗與液體石蠟在研缽中室溫充分研磨約4 h成完全弗氏佐劑，單次皮下注射0.1 mL到大鼠右后足趾，建立AA模型。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》第4版[11]對AA大鼠成模的判定[11]，并對主要指標(biāo)關(guān)節(jié)腫脹數(shù)進(jìn)行評分，每個關(guān)節(jié)計1個踝關(guān)節(jié)和5個指(趾)關(guān)節(jié)，每只動物最多計24個關(guān)節(jié)腫脹數(shù)。

1.4 分組給藥造模當(dāng)天為d 0，造模d 17開始給藥，分為AA模型組、ALLO低、中、高劑量組(10、20、40 mg·kg-1)和陽性對照藥MTX組(0.5 mg·kg-1)，每組8只，ALLO每天給藥，MTX每3 d給藥，灌胃給藥2周。每3 d記錄體質(zhì)量和關(guān)節(jié)腫脹數(shù)。

1.5 脾臟指數(shù)d 33，事先標(biāo)好無菌EP管并記錄質(zhì)量，股動脈取血后處死大鼠，在超凈臺中取出脾臟放入無菌EP管記錄質(zhì)量，根據(jù)當(dāng)天大鼠體質(zhì)量計算脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/大鼠處死當(dāng)天體質(zhì)量。

1.6 HE染色取每組大鼠繼發(fā)側(cè)膝關(guān)節(jié)組織，先加足量4%多聚甲醛覆蓋組織，固定24 h后，換脫鈣液脫鈣，期間頻繁換脫鈣液，直至用細(xì)針能扎動骨頭或者骨頭變軟說明脫鈣成功，然后進(jìn)行石蠟包埋切片，HE染色觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜病理變化。

1.7 膝關(guān)節(jié)滑膜組織分離與培養(yǎng)取大鼠繼發(fā)側(cè)滑膜組織，剪碎成1～3 mm3的小塊，用巴氏吸管將其均勻貼在細(xì)胞瓶底壁，緩緩補充2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，瓶底朝上放入細(xì)胞培養(yǎng)箱6 h后，輕輕放倒細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使培基覆蓋滑膜組織塊，待其組織周圍爬滿細(xì)胞時，將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至新細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，即為成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast like synoviocytes，F(xiàn)LS)，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，用于后續(xù)實驗。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)淋巴細(xì)胞分離液分離脾臟淋巴細(xì)胞，取中間層細(xì)胞。計數(shù)取1×106，100 μL PBS重懸，先孵育表面抗體(CD4和CD25)，然后固定破膜加胞內(nèi)抗體(Foxp3)，抗體均在4 ℃條件下避光孵育30 min。另取每只1×106細(xì)胞鋪24孔板，加入PMA、BFA和離子霉素，培養(yǎng)6 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17比例。

1.9 高內(nèi)涵細(xì)胞成像將培養(yǎng)至第3～8代長滿的FLS用胰酶消化，計數(shù)鋪96孔板，每孔加2×104細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍，加入適量DAPI室溫避光孵育8 min，PBS洗滌3次，加入PBS后上機拍照。

1.10 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)所有色譜程序均在37 ℃，Agilent TC-18色譜柱(250 mm×5 mm，5 μm)下進(jìn)行，進(jìn)樣量10 μL。Trp濃度測定波長為280 nm，Kyn濃度測定波長為360 nm，流動相(1.0 mL·min-1流速)由乙腈和醋酸鈉，按8 ∶92組成[12]。樣品先3 000 r·min-1，離心5 min，取100 μL上清，再加入100 μL高氯酸12 000 r·min-1，離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至EP管，放4 ℃等待上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 ALLO對AA大鼠體質(zhì)量的影響與正常組相比(Fig 1A)，大鼠造模后出現(xiàn)體質(zhì)量減輕(P<0.05)，食欲下降，足爪紅腫，活動受限。ALLO和MTX給藥后，體質(zhì)量逐漸恢復(fù)至正常水平。

2.2 ALLO對AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)的影響與模型組相比(Fig 1B)，給藥d 9開始，ALLO給藥和MTX給藥組關(guān)節(jié)腫脹數(shù)減少(P<0.01)。

2.3 ALLO對AA大鼠膝關(guān)節(jié)病理的影響Fig 2 HE結(jié)果顯示，正常大鼠膝關(guān)節(jié)面圓滑，結(jié)構(gòu)層次清晰完整，滑膜細(xì)胞呈網(wǎng)泡狀分布。與正常組相比，模型組膝關(guān)節(jié)面明顯破壞，關(guān)節(jié)面凹凸不平，缺損嚴(yán)重，滑膜明顯增生，且有大量炎性細(xì)胞浸潤，血管翳形成。不同劑量ALLO (10、20、40 mg·kg-1)給藥后關(guān)節(jié)破壞減輕，滑膜細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤均明顯減少。

2.4 ALLO對AA大鼠脾臟指數(shù)的影響與正常組相比，AA大鼠脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)，ALLO和MTX給藥降低脾臟指數(shù)(P<0.05) (Fig 3)。

2.5 ALLO對AA大鼠脾臟巨噬細(xì)胞數(shù)量以及Th17/Treg的影響流式結(jié)果顯示，與正常組相比，AA大鼠明顯增加脾臟巨噬細(xì)胞數(shù)量(Fig 4A，D)，上升Th17比例(Fig 4B)，降低Treg比例(Fig 4C)，明顯升高Th17/Treg比值(Fig 4E)，ALLO(20、40 mg·kg-1)給藥后巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，Th17比例降低，Treg比例升高，Th17/Treg比值降低。MTX具有與ALLO類似作用。

Fig 1 Effect of ALLO on weight and number of joint swelling of AA rats

Fig 2 Effect of ALLO on knee joint pathology of AA rats (HE×200)

Fig 3 Effect of ALLO on spleen index of AA rats

2.6 ALLO對AA大鼠FLS增殖的影響高內(nèi)涵細(xì)胞成像結(jié)果(Fig 5)顯示，與正常組相比，AA模型組FLS增殖能力增強，ALLO (10、20、40 mg·kg-1)處理和MTX給藥后，對FLS增殖反應(yīng)均有明顯抑制作用(P<0.01)。

2.7 ALLO對AA大鼠肝臟和FLS培養(yǎng)上清Trp和Kyn含量的影響HPLC結(jié)果顯示，與正常組相比，AA大鼠肝臟和FLS培養(yǎng)上清Trp水平降低 (P<0.01)，Kyn水平升高(Fig 6A和6B)，Kyn/Trp比值明顯升高(Fig 6C)；ALLO(40 mg·kg-1)給藥后升高Trp水平，降低Kyn水平，降低Kyn/Trp比值。

Fig 4 Effect of ALLO on number of macrophage and ratio of Th17/Treg in spleen of AA rats

Fig 5 Effect of ALLO on proliferation of

Fig 6 Effect of ALLO on concentration of Trp and Kyn of liver and AA-FLS

3 討論

RA是一種全身炎癥性自身免疫病，可導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)損傷[1]。關(guān)節(jié)滑膜組織為RA的主要受累部位，F(xiàn)LS是滑膜組織的主要細(xì)胞[13]。研究表明，RA-FLS將糖代謝轉(zhuǎn)向厭氧糖酵解，產(chǎn)生大量乳酸，并分泌到細(xì)胞外，酸化組織微環(huán)境，參與調(diào)控周圍細(xì)胞的功能(如促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡)，進(jìn)一步引起滑膜炎癥和軟骨、骨損傷[14]。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)滑液中乳酸、低密度脂蛋白、乙酰甘氨酸等代謝物濃度增加，提示RA患者糖、脂質(zhì)和氨基酸代謝異常[15]。目前，臨床上治療RA的藥物糖皮質(zhì)激素就可抑制糖酵解發(fā)揮抗炎作用，改善病情抗風(fēng)濕藥如MTX，主要靶向嘌呤和嘧啶核苷酸代謝，抑制免疫細(xì)胞和FLS功能活化[5]。因此，靶向免疫代謝可能是RA新的治療策略。

氨基酸對于維持體內(nèi)新陳代謝至關(guān)重要。氨基酸代謝在先天免疫和適應(yīng)性免疫扮演著重要角色，Trp代謝是氨基酸代謝的主要途徑之一[2]。Trp是人體內(nèi)必需氨基酸之一，屬于外源性氨基酸，參與各種生物大分子的合成，其95%通過KP途徑代謝，5%通過5-羥色胺途徑代謝[16]。研究發(fā)現(xiàn)，Trp代謝在RA中發(fā)揮著重要作用，RA患者和RA動物模型血清和尿液中Trp含量降低，Kyn含量升高，提示RA患者體內(nèi)KP代謝異常[3，17-18]。TDO作為KP代謝中重要限速酶之一，由TDO2基因編碼，可催化KP的第一步，氧化L-Trp中吲哚環(huán)的2，3-雙鍵并將其催化為Kyn。多項研究表明，TDO在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異?；罨痆17]。然而TDO在自身免疫病中的作用研究較少。目前臨床上沒有明確的TDO特異性抑制劑，有文獻(xiàn)報道ALLO明顯抑制大鼠肝臟中Kyn/Trp比值，抑制TDO活性，為TDO的抑制劑[8]，ALLO是臨床上治療痛風(fēng)的藥物，在RA上研究較少。Meli等[9]發(fā)現(xiàn),ALLO可以通過抑制自由基的產(chǎn)生緩解AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀。ALLO還可抑制CIA大鼠中PGE2水平發(fā)揮抗炎作用[10]。然而ALLO是否通過調(diào)節(jié)KP代謝異常發(fā)揮治療RA的作用尚不清楚。

本研究構(gòu)建AA大鼠模型，結(jié)果表明，ALLO可改善AA大鼠的整體指標(biāo)，減少關(guān)節(jié)腫脹數(shù)以及改善膝關(guān)節(jié)組織病理損傷，表明ALLO對AA大鼠具有治療作用。進(jìn)一步探究ALLO是否通過調(diào)控KP代謝異常發(fā)揮抗關(guān)節(jié)炎作用。結(jié)果表明，ALLO (40 mg·kg-1)給藥AA大鼠后，可升高肝臟Trp水平，降低Kyn水平，降低Kyn/Trp比值，提示ALLO可能通過抑制TDO酶活性，調(diào)控KP異常代謝，進(jìn)而發(fā)揮治療作用。RA關(guān)節(jié)周圍組織有許多炎性細(xì)胞浸潤，如活化的巨噬細(xì)胞，通過分泌大量促炎細(xì)胞因子招募其他免疫細(xì)胞和促進(jìn)T細(xì)胞分化進(jìn)一步加重炎癥[1]。Th17細(xì)胞在RA中高分泌IL-17，Treg細(xì)胞是自我耐受和防御自身免疫所必需的，Th17和Treg之間的平衡在RA中發(fā)揮重要作用[1]。流式結(jié)果顯示，與AA模型組相比，ALLO(20、40 mg·kg-1)明顯減少脾臟CD68巨噬細(xì)胞數(shù)量以及降低Th17/Treg。以上結(jié)果提示，ALLO可能通過調(diào)控KP代謝紊亂發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而抑制關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)。

FLS是滑膜組織中的主要細(xì)胞，在RA中表現(xiàn)為類腫瘤樣生長、接觸性抑制喪失，F(xiàn)LS細(xì)胞能夠在其他免疫細(xì)胞遷移到滑膜之前侵入并附著在關(guān)節(jié)上，異常增殖，轉(zhuǎn)化為侵襲性表型，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟骨破壞[13]。本研究成功分離滑膜組織和培養(yǎng)，結(jié)果顯示，與正常組相比，AA大鼠FLS異常增殖，ALLO(10、20、40 mg·kg-1)給藥明顯抑制FLS增殖反應(yīng)。進(jìn)一步用HPLC檢測FLS培養(yǎng)上清中Trp和Kyn含量變化，AA大鼠Kyn/Trp比值明顯升高，ALLO(20、40 mg·kg-1)顯著降低Kyn/Trp比值，提示ALLO可能通過抑制FLS的KP代謝，進(jìn)而影響FLS的增殖能力發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，ALLO可明顯抑制AA大鼠體質(zhì)量下降、減少關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、改善關(guān)節(jié)滑膜病理損傷、減少活化巨噬細(xì)胞數(shù)量、調(diào)節(jié)Th17/Treg穩(wěn)態(tài)失衡和抑制FLS異常增殖，其作用機制可能與其抑制TDO酶活性有關(guān)，為研究TDO介導(dǎo)的KP代謝在RA中的作用提供實驗依據(jù)，后續(xù)將針對各個免疫細(xì)胞的TDO進(jìn)行研究，為治療RA尋找新的作用靶點。