張莉婷 喬娜娜

(1.子長(zhǎng)市人民醫(yī)院，陜西 延安 717300；2.延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是中老年較常見(jiàn)、起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，僅次于心腦血管疾病和腫瘤，嚴(yán)重威脅著老年人生命健康[1]。該病臨床上以記憶障礙、失語(yǔ)、視空間技能損害、執(zhí)行功能障礙及人格和行為改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征，病因迄今未明。65歲以前發(fā)病者，稱(chēng)早老性癡呆；65歲以后發(fā)病者稱(chēng)老年性癡呆[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在AD晚期，患者的炎癥反應(yīng)會(huì)加速病變機(jī)制和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，用抗炎藥物能降低AD的病例程度。腦血管轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)在腦組織損傷中起重要作用，其表達(dá)量在AD患者的腦中顯著升高，這是一種多功能蛋白家族，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化并參與組織的重塑和炎癥，具有保護(hù)細(xì)胞和對(duì)抗神經(jīng)元損傷的作用[3-4]。TGF-β能誘導(dǎo)腦血管淀粉樣變性并導(dǎo)致AD中微血管病變，微血管內(nèi)皮細(xì)胞是細(xì)胞因子和趨化因子的來(lái)源，且易受刺激釋放炎性因子，如白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α[5]。本研究擬觀察AD微血管系統(tǒng)中TGF-β的表達(dá)量是否異常及TGF-β的表達(dá)量與IL-1β、TNF-α血管生產(chǎn)的關(guān)系，以期為臨床AD的治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料及微血管分離 選取2018年6月至2020年6月我院康復(fù)中心收治后死亡的78例AD患者為研究對(duì)象(AD組)，另選無(wú)AD神經(jīng)病理特征且年齡與AD組匹配的非AD患者78例為對(duì)照(非AD組)。于AD患者死后4～15 h內(nèi)切取其腦組織并置于-70℃?zhèn)溆?，非AD組操作與AD組一致。所有研究經(jīng)患者及其家屬簽署了知情同意書(shū)，并且經(jīng)我院倫理委員會(huì)通過(guò)。用210 μm篩網(wǎng)過(guò)濾并在53 μm篩網(wǎng)上收集腦組織，在收集的顳葉、頂葉等皮質(zhì)層中分離微血管，期間需經(jīng)數(shù)次篩選和洗滌，直至檢測(cè)不到細(xì)胞或蛋白質(zhì)為止。制備微血管，用顯微鏡監(jiān)測(cè)其純度。將微血管懸浮于含10%胎牛血清和10%二甲基亞砜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨后將其置于液氮中冷凍備用。

1.2條件培養(yǎng)基和裂解液的制備 于液氮中取出微血管并置于37℃水域中快速解凍，用2 000 r/min離心15 min，用4℃的Hanks緩沖液洗滌3次，后重懸于含1%乳清蛋白氫化酶的無(wú)血清DMEM中。將1 mL的微血管溶液(50 μg/樣品)于37℃下在95% CO2/5% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，后2 000 r/min離心15 min。使用裂解液(含0.5 mol/L乙二胺四乙醇和2%十二烷基硫酸鈉SDS)裂解微血管后，用Western blot測(cè)定裂解物種TGF-β的含量；從內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)物中收集微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并置于含0.1%牛血清白蛋白的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中孵育，后添加不同溶度的TGF-β(0.01 μg/mL、0.03 μg/mL和0.06 μg/mL)培養(yǎng)24 h。非AD組細(xì)胞僅在培養(yǎng)基中孵育。用ELISA試劑盒測(cè)定上清中的IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。洗滌內(nèi)皮細(xì)胞并用裂解液裂解樣品，用Western blot測(cè)定IL-1β和TNF-α的含量。

1.3ELISA檢測(cè) 采用購(gòu)自R&Dsystems的ELISA試劑盒檢測(cè)所有樣品的TGF-β表達(dá)水平，用購(gòu)自Boehringer Mannheim公司的ELISA試劑盒檢測(cè)所有樣品的IL-1β和TNF-α表達(dá)水平。TGF-β試劑盒的檢測(cè)范圍為31.2～2 000 pg/mL，IL-1β、TNF-α試劑盒的測(cè)量范圍為5～700 pg/mL。

1.4蛋白印跡法檢測(cè) 將微血管(50 μg/孔)和內(nèi)皮細(xì)胞(20 μg/孔)裂解物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，把凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用洗滌液洗滌兩次后，常溫下加5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉90 min，加入一抗(TGF-β、IL-1β、TNF-α)4℃孵育過(guò)夜，加入二抗后再孵育90 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色，膠片經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

2 結(jié) 果

2.1微血管TGF-β表達(dá)水平 AD組和非AD組的微血管TGF-β表達(dá)水平分別為(28.45±7.26)pg/mL和(20.09±5.53)pg/mL(t=8.09，P<0.05)；相關(guān)的Western blot結(jié)果顯示，AD組的衍生血管中TGF-β表達(dá)，而非AD組中未檢測(cè)到TGF-β表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組患者的腦中微血管培養(yǎng)上清液中TGF-β表達(dá)水平

2.2不同濃度TGF-β處理后內(nèi)皮細(xì)胞釋放的IL-1β、TNF-α表達(dá)水平 非AD中，IL-1β、TNF-α的含量較低，隨著TGF-β濃度的增加，IL-1β、TNF-α表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度TGF-β處理后內(nèi)皮細(xì)胞釋放的IL-1β、TNF-α表達(dá)水平

2.3Western blot分析不同濃度TGF-β處理腦內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平 Western blot分析結(jié)果顯示，非AD組IL-1β、TNF-α的含量較低。腦內(nèi)皮細(xì)胞與不同濃度TGF-β的孵育促使IL-1β、TNF-α的表達(dá)量隨TGF-β濃度的升高而顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 不同濃度TGF-β處理腦內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平

圖2 不同濃度TGF-β下內(nèi)皮細(xì)胞中IL-1β、TNF-α表達(dá)水平(泳道2～4、6～8)

3 討 論

在AD的發(fā)病機(jī)制中，促炎和抗炎細(xì)胞因子是重要組成部分，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TGF-β的增加是誘導(dǎo)AD發(fā)病的重要因素。對(duì)于AD患者，其主要的病理特征有老年斑(SP)，SP的主要成分是β淀粉樣蛋白(Aβ)，它的聚集和沉淀是AD發(fā)表的重要機(jī)理，且Aβ被認(rèn)為是強(qiáng)的活性促炎因子，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)直接參與腦內(nèi)的炎癥過(guò)程[6-7]。而TGF-β能引發(fā)AD患者的腦血管淀粉樣病變和微血管變性結(jié)果也驗(yàn)證了TGF-β在AD病理中的重要作用。TGF-β還可通過(guò)炎性介質(zhì)的相互作用促進(jìn)AD腦中的血管和神經(jīng)元病變，幾乎所有的AD研究中的細(xì)胞因子和趨化因子均升高，證實(shí)炎性因子在AD患者的腦中尤為重要，但尚不清楚其具體機(jī)制[1,8]。

本研究結(jié)果顯示，TGF-β的含量在微血管中顯著升高(P<0.05)，并且刺激了腦內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α，且隨著TGF-β的濃度升高，IL-1β、TNF-α的含量也相應(yīng)的顯著升高(P<0.05)，這揭示TGF-β是控制、誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的關(guān)鍵因素。參與AD患者腦內(nèi)炎性反應(yīng)的細(xì)胞主要是腦內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞均會(huì)產(chǎn)生TGF-β，進(jìn)而釋放炎性蛋白[8]。有研究[7,9]報(bào)道，在小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生過(guò)量的TGF-β，就能在其微血管中觀察到腦血管淀粉樣病變、膜蛋白的積累和退行性改變，且在轉(zhuǎn)基因小鼠中廣泛表達(dá)TGF-β，但在血管組織周?chē)奂疃嘣诶夏贽D(zhuǎn)基因小鼠的腦血管中，星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)促使產(chǎn)生TGF-β并誘導(dǎo)淀粉樣蛋白β的分泌，而TGF-β可能是由腦內(nèi)皮細(xì)胞星形細(xì)胞衍生的蛋白質(zhì)。IL-1β能通過(guò)維持自身的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)而使炎性反應(yīng)聚集于腦部，最終引起神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡。TNF-α作為典型的炎性指標(biāo)，其含量升高能對(duì)機(jī)體早上廣泛性的損傷，同時(shí)能激活患者的核酸內(nèi)切酶，進(jìn)而損傷機(jī)體的內(nèi)皮細(xì)胞，破壞微循環(huán)[10]。

綜上所述，TGF-β在AD微血管中升高并刺激從腦內(nèi)皮細(xì)胞釋放促炎性因子IL-1β、TNF-α，表明血管衍生的TGF-β可以啟動(dòng)或增加破壞炎癥循環(huán)的程度，促成神經(jīng)元細(xì)胞死亡并提示這可能是AD中的治療靶標(biāo)。