袁美玲，張?jiān)疲跗G，汪寧*（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2.安徽省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)科學(xué)院中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)研究所，合肥 230012）

腦卒中又稱(chēng)中風(fēng)，是一種急性腦血管疾病，主要包括缺血性卒中和出血性卒中，其中缺血性卒中約占所有卒中發(fā)病率的80%以上。缺血性卒中是指腦部血管阻塞或破裂，腦組織血流量減少，致使神經(jīng)功能受損，引起腦部病變，常見(jiàn)于中老年人群中，具有高致殘、高復(fù)發(fā)、高致死的特點(diǎn)，且近年來(lái)發(fā)病率逐年提升[1]。目前，組織型纖溶酶原激活劑（tPA）進(jìn)行溶栓治療效果顯著，但由于治療時(shí)間窗的存在，使得及時(shí)進(jìn)行溶栓治療受到限制[2]。在現(xiàn)代研究中，缺血性腦損傷涉及的病理機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種生物活性分子及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如大量神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡、腦組織能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，活性氧大爆發(fā)、氧化應(yīng)激等[3]。因此，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激對(duì)于防治缺血性卒中具有重要意義。

缺血性卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，“腦脈”阻塞，血凝脈內(nèi)之瘀血是缺血性中風(fēng)的主要病機(jī)之一，故究其本質(zhì)仍屬血瘀證?；钛鍪茄鲎C的特有治法。運(yùn)用活血化瘀藥?kù)畛鲅⑹柰ㄑ}、暢通血流，可改善血液循環(huán)、止血和促進(jìn)血液吸收及改善神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等作用；促進(jìn)血腫吸收和側(cè)支循環(huán)建立，減輕及恢復(fù)損傷的神經(jīng)功能，對(duì)缺血性中風(fēng)的治療有極其重要的意義。中藥紅花被用于治療心腦血管疾病100 多年，并且正式列入《中國(guó)藥典》。羥基紅花黃色素A（HSYA）既是中藥紅花藥理功效的最有效水溶性部位，也是紅花活血化瘀的有效成分，具有活血化瘀，改善血液循環(huán)的功效。已有研究表明，HSYA 的神經(jīng)保護(hù)作用與減輕氧化應(yīng)激有關(guān)[4]。課題組前期研究表明，HSYA 能夠透過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦脊液中，并且對(duì)氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧（OGD/R）損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[5]。目前公認(rèn)的模擬體內(nèi)缺血缺氧模型為對(duì)細(xì)胞進(jìn)行OGD/R 處理[6]，因此在缺血性卒中發(fā)病機(jī)制的研究中多采用HT22 細(xì)胞的體外OGD/R 模型，從而為缺血性卒中的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

小鼠海馬神經(jīng)元HT22 細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞生物所），HSYA（成都德斯特，純度≥98%，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）；LDH 毒性檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、總谷胱甘肽（GSH）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（Beyotime）；增強(qiáng)型細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)（CCK-8）試劑盒、一氧化氮（NO）試劑盒、活性氧（ROS）（碧云天）；小鼠細(xì)胞色素C（CytC）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（江萊生物，JL13261），Hoechst 33258 染色試劑（美國(guó)Sigma 公司，B2833）；FITC Annexin V 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó) BD Biosciences 公司，7312712）；cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2（ZENBIO）；HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（Spark-Jade）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，8121278）；胎牛血清（FBS，BI，04-001-1ACS）；青霉素和鏈霉素（Beyotime，C0222）；TRIZOL 試劑（Thermo Fisher，15596026）；ReverTra Ace Q-PCRT Master Mix、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO）。

圖1 HSYA 分子結(jié)構(gòu)式Fig 1 Molecular formula of HSYA

1.2 儀器

371 型CO2培養(yǎng)箱、Heracell VIOS160i 型CO2培養(yǎng)箱、1500 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Scientific 公司）；TDL-5 型飛鴿臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Countstar 型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（艾利特國(guó)際有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)General Electric 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）。

2 方法

2.1 HT22 細(xì)胞的培養(yǎng)

采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法復(fù)蘇HT22 細(xì)胞，后用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至一定密度后置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約2 ～3 d 傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 OGD/R 損傷HT22 模型的建立[7]

胰酶消化正常狀態(tài)的HT22 細(xì)胞種板，細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，用PBS 輕輕搖晃潤(rùn)洗細(xì)胞3 次，加入無(wú)糖培養(yǎng)液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到缺氧小室（95%N2和5%CO2）中氧糖剝奪6 h，棄去無(wú)糖培養(yǎng)液，用PBS 洗3 次后加入完全培養(yǎng)液，于常規(guī)培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)12 h。

2.3 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 的濃度篩選

取正常狀態(tài)的HT22 細(xì)胞接種于96 孔板中，密度為1×105個(gè)·mL－1，細(xì)胞貼壁后，吸出培養(yǎng)液，PBS 潤(rùn)洗3 次，隨機(jī)分組，正常組加入新的完全培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)；OGD/R 組和給藥組加入無(wú)糖培養(yǎng)液，氧糖剝奪6 h，吸出無(wú)糖培養(yǎng)液，OGD/R 組加入完全培養(yǎng)液，給藥組分別加入不同濃度的HSYA（5、10、20、40、60、80、100、120、140 μmol·L－1），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，避光下，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖活力。

2.4 分組及給藥

將細(xì)胞隨機(jī)分為5 組：正常組，模型組（OGD/R），HSYA 低、中、高劑量（40、60、80 μmol·L－1）組，模型組造模6 h 后加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，給藥組造模6 h 后分別加入不同濃度的HSYA（40、60、80 μmol·L－1）培養(yǎng)12 h，正常組在常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)相同時(shí)間后加入相應(yīng)培養(yǎng)液。

2.5 倒置顯微鏡觀察HT22 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

將細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中，根據(jù)分組分別造模和給藥后，用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)。

2.6 HT22 細(xì)胞上清液中LDH、NO 含量的檢測(cè)

將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種到96 孔板中，根據(jù)分組分別造模和給藥后，收集細(xì)胞上清液，根據(jù)LDH、NO 試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH、NO 的含量。

2.7 SOD 活性、GSH 活性、MDA 水平

將細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種到96 孔板中，根據(jù)分組分別造模和給藥后，吸棄各孔細(xì)胞上清液。根據(jù)各試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)SOD 活性、GSH活性、MDA 水平。

2.8 熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ROS 熒光強(qiáng)度

將細(xì)胞以每孔3×105個(gè)接種到6 孔板中，根據(jù)分組分別造模和給藥后，吸棄各孔細(xì)胞上清液。加入適量DCFH-DA 10 μmol·L－1覆蓋各孔細(xì)胞的體積，常規(guī)孵育20 min 后PBS 漂洗細(xì)胞2次，充分洗凈未與細(xì)胞結(jié)合的DCFH-DA 后，采用熒光倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞熒光強(qiáng)弱。

2.9 Hoechst33258 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞以每孔3×105個(gè)接種到6 孔板中，根據(jù)分組分別造模和給藥后，室溫下加入多聚甲醛固定20 min，移去多聚甲醛后PBS 潤(rùn)洗3 次后加入Hoechst 33258 染液孵育15 min，最后用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞。

2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

將細(xì)胞以每孔1×106個(gè)接種到6 孔板中，根據(jù)分組分別造模和給藥后，根據(jù)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀上機(jī)測(cè)定，并通過(guò)Flow Jo7.6 計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

2.11 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞胞漿中CytC 的釋放

細(xì)胞前處理同“2.7”項(xiàng)下。依據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒，450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)各孔吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CytC 的含量。

2.12 Western blot 檢測(cè)Bax、Bcl-2 和cleavedcaspase-3 的蛋白表達(dá)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別處理細(xì)胞后，采用 BCA 法定量并調(diào)整各組細(xì)胞蛋白濃度。隨后通過(guò) SDSPAGE 電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h 后，分別與對(duì)應(yīng)的一抗孵育過(guò)夜，次日將膜漂洗并與 HRP 標(biāo)記的二抗（1∶10 000）在室溫下孵育2 h。最后TBST 漂洗3次，使用凝膠成像系統(tǒng)，用顯影液進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，并通過(guò)AlphaVIEW SA 軟件分析蛋白質(zhì)條帶。

2.13 qRT-PCR 檢測(cè)Bax 和Bcl-2 的mRNA 含量

用Trizol 試劑處理HT22 細(xì)胞，提取總RNA。使用ReverTra Ace Q-PCRT Master Mix 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再根據(jù)SYBR Green Realtime PCR Master Mix 使用PCR 儀器（Stratagene，San Diego，CA，USA，MX3000P）定量mRNA含量。用2－ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平。

Bax：Forward，GTCGCCCTTTTCTACTTCGC；Reverse，ATGGTGAGTGAGACGGTGAG；

Bcl-2：Forward，TCGCAGAGATGTCCAGTCAG；Reverse，ATCTCCCTGTTGACGCTCTC；

β-actin：Forward，AACAGTCCGCCTAGACC；Reverse，CGTTGACATCCGTAAAGACC.

2.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間均數(shù)比較，所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 處理，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 OGD/R 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HT22 細(xì)胞增殖活力的影響

為觀察OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞模型的具體效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)選取OGD 處理6 h 復(fù)糖復(fù)氧3、6、12、24、48 h 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果如圖2 所示，OGD 處理6 h 后，細(xì)胞存活率下降。復(fù)糖復(fù)氧0 ～48 h，OGD/R 組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01），在0 ～12 h 呈下降趨勢(shì)，并于12 h 達(dá)到最低。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇復(fù)糖復(fù)氧12 h。

圖2 OGD/R 最佳造模時(shí)間篩選（x ±s，n ＝6）Fig 2 Optimal molding time of OGD/R（x ±s，n ＝6）

3.2 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞的有效濃度篩選

結(jié)果如圖3 所示，與正常組相比，OGD/R 組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與OGD/R 組相比，HSYA 各濃度組（20、40、60、80、100 μmol·L－1）可提升細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01）。綜合結(jié)果，選擇40、60、80 μmol·L－1分別作為HSYA的低、中、高劑量組。

圖3 HSYA 有效濃度篩選（x±s，n ＝6）Fig 3 Effective concentration screening of HSYA（ x ±s，n ＝6）

3.3 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞LDH 釋放的影響

結(jié)果如圖4 所示，與正常組相比，OGD/R 組LDH 的釋放量顯著增加（P＜0.01）；HSYA 各劑量組細(xì)胞上清液中的LDH 釋放量均低于OGD/R 組（P＜0.01）。

圖4 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22中LDH 釋放的影響（x± s，n＝6）Fig 4 Effect of HSYA on LDH release in HT22 cells after OGD/R injury（x ±s，n ＝6）

3.4 HSYA 對(duì)OGD/R 誘導(dǎo)的 HT22 細(xì)胞形態(tài)的影響

正常組HT22 細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，較為飽滿(mǎn)，貼壁狀態(tài)較好；OGD/R 組細(xì)胞變圓、皺縮，稀疏脫落；HSYA 作用后HT22 細(xì)胞貼壁數(shù)目增多，折光性增強(qiáng)，見(jiàn)圖5。

3.5 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞NO、MDA、SOD、GSH 含量的影響

與正常組相比，OGD/R 組HT22 細(xì)胞NO、MDA含量顯著增多，GSH、SOD 活性降低（P＜0.01）；而與OGD/R 組相比，HSYA 各劑量組中NO、MDA的含量顯著降低，GSH、SOD 活性升高（P＜0.05，P＜0.01），提示HSYA 可有效改善細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，如圖6 所示。

圖6 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞中NO、MDA、SOD 及GSH 含量的影響（x ±s，n ＝6）Fig 6 Effect of HSYA on the content of NO，MDA，SOD and GSH in HT22 cells damaged by OGD/R（x ±s，n ＝6）

3.6 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞ROS 熒光強(qiáng)度的影響

如圖7 所示，與正常組相比，OGD/R 組細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的綠色熒光，說(shuō)明造模后HT22 細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平升高；與OGD/R 組相比，HSYA 各劑量組細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸減弱，由此可知HSYA可有效的降低細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平。

圖7 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞ROS 熒光強(qiáng)度的影響（×400）Fig 7 Effect of HSYA on ROS fluorescence intensity of OGD/R damaged HT22 cells（×400）

3.7 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞胞漿CytC釋放的影響

如圖8 所示，與正常組相比，OGD/R 組細(xì)胞胞漿CytC 含量顯著性升高（P＜0.01）；與OGD/R 組相比，HSYA 各劑量組細(xì)胞胞漿CytC顯著性降低（P＜0.01），表明HSYA 抑制了CytC 從線粒體到胞漿中的釋放。

圖8 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞胞漿CytC 釋放的影響（x ±s，n ＝6）Fig 8 Effect of HSYA on the cytoplasmic CytC release of OGD/R damaged HT22 cells（x ±s，n ＝6）

3.8 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞凋亡的影響

如圖9 所示，正常組細(xì)胞形態(tài)較為飽滿(mǎn)，可見(jiàn)微弱藍(lán)色熒光，OGD/R 組細(xì)胞核固縮，呈亮藍(lán)色熒光。HSYA 各劑量組與OGD/R 組相比，核變圓變大，細(xì)胞核藍(lán)色熒光強(qiáng)度明顯減弱。隨后定量檢測(cè)HSYA 給藥組對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞凋亡影響，結(jié)果顯示，與正常組相比，OGD/R 組細(xì)胞的凋亡率為44.81%；HSYA 低、中、高給藥組可顯著降低細(xì)胞凋亡率至26.23%、17.78%、8.67%（P＜0.01）。

圖9 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞凋亡的影響（x ±s，n ＝3）Fig 9 Effect of HSYA on the apoptosis of OGD/R damaged HT22 cells（x ±s，n ＝3）

3.9 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞中Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

如圖10 所示，與正常組相比，OGD/R 組Bax/Bcl-2 和cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。而相對(duì)于OGD/R 組，經(jīng)HSYA處理后，Bax/Bcl-2 和cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖10 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞中Bax、Bcl-2 和cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)的影響（x ±s，n ＝3）Fig 10 Effect of HSYA on the expression of Bax，Bcl-2 and cleaved-caspase3 in OGD/R damaged HT22 cells（x ±s，n ＝3）

3.10 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 mRNA 含量的影響

如圖11 所示，與正常組相比，OGD/R 組Bax 的mRNA 表達(dá)量顯著增加，Bcl-2 mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。而相對(duì)于OGD/R 組，經(jīng)HSYA 處理后，Bax 的mRNA 表達(dá)量顯著降低，Bcl-2 mRNA 表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。

圖11 HSYA 對(duì)OGD/R 損傷HT22 細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 mRNA 含量的影響（x ±s，n ＝3）Fig 11 Effect of HSYA on the mRNA content of Bax and Bcl-2 in OGD/ R-damaged HT22 cells（x ±s，n ＝3）

4 討論

缺血性卒中致死率很高。目前，主要治療藥物是治療靶點(diǎn)單一的神經(jīng)保護(hù)性藥物，中藥以其多途徑、多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)在缺血性卒中的康復(fù)治療中展現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。因此，探討中藥治療缺血性卒中的潛在機(jī)制，對(duì)其康復(fù)治療具有重大意義。HT22 細(xì)胞體外腦缺血模型（氧糖剝奪，OGD）與在體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途呦嗨频纳韺W(xué)特性，且相比于在體實(shí)驗(yàn)，體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋玫啬M和確定在體腦缺血的治療靶點(diǎn)和策略[8]。

細(xì)胞凋亡是缺血性卒中發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元損傷的一種形式。缺血缺氧后，腦梗死病灶中同時(shí)存在細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡，缺血中心區(qū)域以細(xì)胞壞死為主，而梗死灶周?chē)毖氚祹е屑?xì)胞死亡的一種主要形式則為細(xì)胞凋亡[9]。腦缺血時(shí)有多種caspase 表達(dá)，caspase3 在缺血性神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用[10]。研究顯示，缺血時(shí)能量代謝出現(xiàn)障礙，線粒體跨膜電位消失，其通透性轉(zhuǎn)變孔（mPTP）開(kāi)放，CytC 可與凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）形成凋亡體，激活下游的caspase 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。另一方面，Bax和Bcl-2 是線粒體內(nèi)源性途徑凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，Bax 和Bcl-2 的比值升高可以進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示缺血性卒中發(fā)生過(guò)程中Bax/Bcl-2、cleaved-caspase3 的蛋白表達(dá)和mRNA 含量都增強(qiáng)，而HSYA 治療可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。CytC 釋放至胞漿是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵步驟[13]，ELISA 結(jié)果顯示HSYA 抑制了CytC 從線粒體到胞漿中的釋放。Hoechst 染色和AV-PI 流式細(xì)胞術(shù)染色是檢測(cè)細(xì)胞凋亡的金指標(biāo)，本研究結(jié)果表明，HSYA 各給藥組細(xì)胞凋亡率降低，表明HSYA 抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡減輕OGD/R 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞損傷。

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞或機(jī)體收到刺激后自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御嚴(yán)重失衡，從而引起的一系列細(xì)胞毒性反應(yīng)。缺血性卒中的主要發(fā)病機(jī)制包括氧化應(yīng)激在內(nèi)的缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，一般情況下，SOD 和GSH 等都具有清除自由基的作用。除此之外，ROS 是氧化應(yīng)激中至關(guān)重要的調(diào)節(jié)因子，在氧化應(yīng)激和細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起著舉足輕重的作用[14]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)缺血性卒中發(fā)生時(shí)細(xì)胞內(nèi)NO、LDH、MDA 及ROS 水平顯著升高，SOD 和GSH 水平顯著降低，而給予HSYA 治療后，可以顯著改善這一現(xiàn)象，提示HSYA 可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕OGD/R 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞損傷。

綜上所述，HSYA 對(duì)OGD/R 誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。