張?zhí)鞚?，?靜，張 偉，趙 彧，孫付軍，郭紅梅，邵 露，張樂林，林慧彬，李克明#

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029； 2.青島市中醫(yī)醫(yī)院(青島市海慈醫(yī)院)藥劑科，山東 青島 266033； 3.青島市中醫(yī)醫(yī)院(青島市海慈醫(yī)院)肛腸科，山東 青島 266033； 4.山東省中醫(yī)藥研究院中藥藥理研究所，濟(jì)南 250014； 5.山東省中醫(yī)藥研究院中藥炮制研究所，濟(jì)南 250014； 6.山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究所，濟(jì)南 250014)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是人類消化道中常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球惡性腫瘤中居第2位[1]。在我國，每年新增CRC患者數(shù)為37.6萬例，死亡19.1萬例，且呈逐年升高趨勢。多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)為晚期患者，5年存活率僅為13.1%，轉(zhuǎn)移是晚期CRC患者常見的死亡原因之一。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，增殖阻斷1蛋白(BOP1)調(diào)節(jié)多種類型腫瘤的發(fā)生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、轉(zhuǎn)移和耐藥性[2-3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BOP1可通過調(diào)節(jié)c-Jun 氨基端蛋白激酶(JNK)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞遷移和侵襲，而敲低后可抑制JNK信號(hào)通路介導(dǎo)的遷移和侵襲過程[4]。因此，BOP1是CRC細(xì)胞侵襲和遷移的重要調(diào)節(jié)因子，研究控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新分子可能為CRC的治療提供有效的方法。CRC的發(fā)生發(fā)展由多個(gè)階段組成，西藥長期治療容易產(chǎn)生多藥耐藥性，化療手段會(huì)極大程度地影響患者自身免疫系統(tǒng)，而使用中藥天然藥物輔助治療不良反應(yīng)少，可在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥[5]。黃連解毒湯為中醫(yī)名方，源自《外臺(tái)秘要》引崔氏方，在臨床被用于瀉火解毒；現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯中黃芩苷、京尼平苷為其干預(yù)與逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的有效成分。研究結(jié)果顯示，黃芩苷和京尼平苷組合是黃連解毒湯抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，且黃芩苷10 μg/mL、京尼平苷20 μg/mL對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用明顯[6-8]。本研究通過分子對接技術(shù)，探究黃芩苷聯(lián)合京尼平苷對CRC關(guān)鍵靶點(diǎn)BOP1的抑制作用，為黃芩苷聯(lián)合京尼平苷的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 供受體的獲取及分子模擬過程

AlphaFold數(shù)據(jù)庫(https://alphafold.ebi.ac.uk/)使用機(jī)器學(xué)習(xí)方法將來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的現(xiàn)有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識(shí)和序列比對以及物理和幾何約束的信息匯總在一起，以提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測原子模型[9-10]。其人源BOP1蛋白(UniProt ID：Q14137)原始序列文件經(jīng)Maestro 11.9軟件處理還原為3D模型，通過“Protein Preparation Wizard”套件自動(dòng)分配鍵序、添加氫、與金屬形成零級(jí)鍵、將硒代甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸、添加缺失的側(cè)鏈、創(chuàng)建可能的二硫鍵、刪除與配位點(diǎn)距離超過50 nm的雜基團(tuán)，并在pH為7.0時(shí)產(chǎn)生雜質(zhì)子化狀態(tài)，最后使用OPLS3e力場進(jìn)行限制最小化，直到重原子的均方根誤差(RMSD)收斂達(dá)到3 nm。

配體小分子黃芩苷和京尼平苷分別以“baicalin”和“geniposide”在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索，以獲取其“*.sdf”結(jié)構(gòu)文件。并導(dǎo)入Maestro 11.9軟件中，使用“LigPrep”套件，添加金屬結(jié)合態(tài)，并產(chǎn)生互變異構(gòu)體；保留了特定的手性，每個(gè)結(jié)構(gòu)最多產(chǎn)生4個(gè)立體異構(gòu)體。生成在pH為5.0～9.0下的最低能量分子狀態(tài)。

1.2 活性位點(diǎn)模擬及對接

通過SiteMap算法在域-域界面識(shí)別表觀遺傳蛋白的小分子結(jié)合位點(diǎn)，將活性部位等效為白色格點(diǎn)，并確定排序靠前的潛在受體結(jié)合位點(diǎn)作為該蛋白的最終活性位點(diǎn)[11]。通過“Receptor Grid Generation”套件確定對接盒子區(qū)域大小以及中心位置，以供配體小分子對接。

1.3 結(jié)合模式分析

蛋白質(zhì)-配體相互作用譜分析(protein-ligand interaction profiler，PLIP)是由德國德累斯頓工業(yè)大學(xué)開發(fā)的一款基于Python 3的開源工具(https://github.com/pharmai/plip)，可用于識(shí)別蛋白質(zhì)受體與其配體之間的非共價(jià)相互作用[12]。將“配體-受體”對接態(tài)分子導(dǎo)入PLIP平臺(tái)，通過結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備、功能表征和基于規(guī)則的匹配的相互作用過濾將結(jié)構(gòu)氫化，并提取配體與其結(jié)合位點(diǎn)輸出特征數(shù)據(jù)，最后進(jìn)行相互作用檢測和可視化。

2 結(jié)果

2.1 蛋白3D模型還原與檢驗(yàn)

下載BOP1原始序列，整理為“MAGSAGAGATAAPSVAPG LAASGPGLGPGPGPGPPLLCTSPLSHSTGSASGVSASGGSVPSGL GASGSASSGAAAGGAGGGGAGALAAGGHSGILLTTGGGVGAST PCPATGMASAAIGAGTAGASSAGGAIAATVGAVPLGTTAAPPH VGTALAGAAITLPLATAAGLAGPLALMAAPATTATVGAPMTGA ALALTAGGVALVAALGSGGPGAVGPAPTGPAVAPPSGAVMIHP VTAAPAALASPIPSLVGLGLVSAMVHAILMGTIGPAAPAAPTPSP TALTAGGAPAAVLGAHLMHVPAPLLALPGHAGSTAPPPGTLLS GGGALATGGGGPGGALLSPLPALPPSLAAVPATGAPIGGAPGA CLALTLCPAGALMAVAVAPGALIPLLPAPAALGPPPTCGALVT AGHSALVACLSVSPGGGTLVSGSAAGSLALTGVATAACVATVP VGGVVLSVATAPSPAVCLVAAAVGASVLLLAPALGAALVAGST AGLLSAPVPPGGPPLGPAATLGASGGGAGVGLALAICHGLPVT GVTTHGAGATLAVVLATGGHTGVLIHGLSAAASGSPPAASHGG VGAVAPHPAAPPLLVASGASVALTHLLAGGLTLLLMPACLTVSS LAVHPAGAAVICGSTASLLVTPALALSTLPTAMLAHHLLALAAV APHPATPLPASGSAAGSVIVCHGMVTAALLGAPLLVPVLVLLG HVLTAALGVLAVIPHPTGPTVPSSGAAGTVALPT”，導(dǎo)入Maestro 11.9軟件進(jìn)行處理，結(jié)構(gòu)還原后的預(yù)測對齊誤差見圖1。圖1表示，當(dāng)預(yù)測結(jié)構(gòu)和真實(shí)結(jié)構(gòu)在殘基y上對齊時(shí)，位置(x，y)處的顏色表示AlphaFold 在殘基x處的預(yù)期位置誤差。依據(jù)軟件算法對還原的結(jié)構(gòu)打分，產(chǎn)生每個(gè)殘基的置信度分?jǐn)?shù)(pLDDT)并分為4級(jí)：非常高(pLDDT≥90)，確信(pLDDT為70～<90)，低(pLDDT為50～<70)，非常低(pLDDT<50。處理后的BOP1大部分殘基pLDDT均>90，代表模型置信程度非常高，可以用于對接研究，處理后的條帶模型和表面模型結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1 構(gòu)建蛋白預(yù)測對齊誤差Fig 1 Constructed protein prediction alignment error

圖2 還原BOP1蛋白的條帶模型和表面模型示意圖Fig 2 Schematic diagram of the band model and surface model of the reduced BOP1 protein

2.2 高精對接盒子設(shè)置

使用SiteMap算法檢查涉及識(shí)別和修改蛋白標(biāo)記的多個(gè)域的結(jié)構(gòu)，確定了域-域接口處的5處潛在結(jié)合位點(diǎn)，并按置信度命名為site1—site5。選用site1處位點(diǎn)計(jì)算生成對接盒子，進(jìn)行下一步的對接，見圖3。

圖3 計(jì)算site1結(jié)合位點(diǎn)域與對接盒子示意圖Fig 3 Schematic diagram of calculating site1 binding site domain and docking box

2.3 對接結(jié)果及結(jié)合模式

通過Glide算法計(jì)算黃芩苷與BOP1靶點(diǎn)對接結(jié)合分?jǐn)?shù)為-6.401，京尼平苷與BOP1靶點(diǎn)對接結(jié)合分?jǐn)?shù)為-6.241。通過PLIP分析，黃芩苷與BOP1生成了10個(gè)氫鍵相互作用、1個(gè)疏水作用和1個(gè)鹽橋(見表1)，其3D結(jié)合模式圖見圖4(A)，對接細(xì)節(jié)見圖4(B)；京尼平苷與BOP1生成了6個(gè)氫鍵相互作用(見表2)，其3D結(jié)合模式圖見圖4(C)，對接細(xì)節(jié)見圖4(D)。

表1 黃芩苷與BOP1對接的相互作用力Tab 1 Interaction force between baicalin and BOP1 docking

A.黃芩苷與BOP1的3D結(jié)合模式圖；B.黃芩苷與BOP1的對接細(xì)節(jié)圖；C.京尼平苷與BOP1的3D結(jié)合模式圖；D.京尼平苷與BOP1的對接細(xì)節(jié)圖A.3D binding pattern of baicalin and BOP1；B.details of the docking of baicalin and BOP1；C.3D binding pattern of geniposide and BOP1；D.details of the docking of geniposide and BOP1圖4 黃芩苷和京尼平苷與BOP1的分子對接模式圖Fig 4 Molecular docking pattern of baicalin and geniposide with BOP1

表2 京尼平苷與BOP1對接的相互作用力Tab 2 Interaction force between geniposide and BOP1 docking

3 討論

CRC為常見的消化道惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其在世界范圍內(nèi)的患病率為5%，我國的CRC患者數(shù)在全球CRC患者中占比高達(dá)31%，且<50歲人群的CRC發(fā)病率以每年2%的速度增長，肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移是致死的重要原因[13-15]。前期課題組的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，黃連解毒湯的抗腫瘤作用與其含有的黃芩苷、京尼平苷有關(guān)[7-8]。因此，對黃芩苷聯(lián)合京尼平苷的抗CRC作用機(jī)制進(jìn)行分析，對于降低患者風(fēng)險(xiǎn)、抑制腫瘤擴(kuò)散有著重要意義。BOP1為WD40蛋白家族的成員，具有4個(gè)WD重復(fù)基序，包括732個(gè)氨基酸，在真核生物中高度保守，已被確定為60S核糖體生物發(fā)生和核糖體RNA加工的重要調(diào)節(jié)因子[16]。據(jù)報(bào)道，BOP1是在幾種惡性腫瘤中表達(dá)紊亂，并參與促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17-18]。課題組前期研究結(jié)果表明，BOP1通過JNK通路促進(jìn)人CRC細(xì)胞遷移和侵襲，因此，BOP1可以用作各種腫瘤的有前途的分子預(yù)后生物標(biāo)志物，在各種惡性腫瘤中的表達(dá)將導(dǎo)致不同的臨床結(jié)果[4]。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，BOP1暫無已發(fā)表的可用的3D結(jié)構(gòu)，因此，本研究基于人源BOP1蛋白(UniProt ID：Q14137)的原始序列文件建模其蛋白結(jié)構(gòu)用于對接，經(jīng)檢驗(yàn)構(gòu)建的模型置信程度非常高，可以用于后續(xù)的精細(xì)對接研究。

本研究基于分子對接技術(shù)，探索黃芩苷聯(lián)合京尼平苷的抗CRC作用靶點(diǎn)BOP1的調(diào)節(jié)作用。在Glide對接算法中，受體-配體親和力越強(qiáng)，構(gòu)象越穩(wěn)定，其靶點(diǎn)對接結(jié)合分?jǐn)?shù)的絕對值越大；絕對值>4.25代表有結(jié)合活性，>5.0代表有較強(qiáng)的結(jié)合活性[19-20]。從結(jié)果來看，黃芩苷、京尼平苷與BOP1靶點(diǎn)對接結(jié)合分?jǐn)?shù)分別為-6.401、-6.241，均具有較好的結(jié)合活性，在一定程度上說明了二者能夠通過結(jié)合BOP1，從而實(shí)現(xiàn)一定的生理功能。

SiteMap是一種新技術(shù)，用于識(shí)別潛在的結(jié)合位點(diǎn)并預(yù)測其在先導(dǎo)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中的成藥性，以及在先導(dǎo)優(yōu)化應(yīng)用中表征結(jié)合位點(diǎn)和批判性評(píng)估預(yù)期配體[21]。在大規(guī)模驗(yàn)證測試中，SiteMap的結(jié)果中有>98%的部分來自與配體緊密結(jié)合的位點(diǎn)，還可以準(zhǔn)確地區(qū)分結(jié)合配體的位點(diǎn)和不結(jié)合的位點(diǎn)。本研究使用SiteMap分析計(jì)算了BOP1的5個(gè)可能活性位點(diǎn)，其中site1的置信度最高，因此，選用site1處位點(diǎn)作為BOP1的活性位點(diǎn)與配體對接。

隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的增長，配體與其目標(biāo)分子之間的分子相互作用的分析變得越來越重要，并對藥物發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生重大影響。PLIP可提供高質(zhì)量圖像、PyMOL會(huì)話文件(*.pse)來生成自定義圖像和可解析的結(jié)果文件，促進(jìn)了后續(xù)數(shù)據(jù)處理的效率。在動(dòng)力學(xué)方面，黃芩苷和京尼平苷均能完美對接到BOP1的計(jì)算活性位點(diǎn)site1處，且能通過生成大量氫鍵穩(wěn)固對接關(guān)系。氫鍵是有機(jī)體內(nèi)最常見的一種作用力，在生物結(jié)構(gòu)、功能和構(gòu)象動(dòng)力學(xué)中起著不可或缺的作用，是地球上生命進(jìn)化的基礎(chǔ)。有研究結(jié)果表明，親水或帶電蛋白質(zhì)表面存在水分子時(shí)，氫鍵斷裂的自由能高達(dá)1.67 kJ/mol。因此，筆者認(rèn)為黃芩苷、京尼平苷與BOP1對接主要依靠生成的氫鍵相互作用。

綜上所述，有了豐富的對接數(shù)據(jù)，可以深入了解黃芩苷、京尼平苷如何與靶標(biāo)BOP1相互作用。這些相互作用模式的詳細(xì)表征對于了解藥物分子識(shí)別、蛋白質(zhì)功能或開發(fā)和優(yōu)化先導(dǎo)化合物至關(guān)重要，因此被廣泛應(yīng)用于對接后處理、抑制劑設(shè)計(jì)以及藥物定位等[22-23]。基于此，本研究探索了黃芩苷聯(lián)合京尼平苷通過影響B(tài)OP1治療CRC的可能，對臨床用藥有一定的參考意義。計(jì)算機(jī)理論研究結(jié)果并不能完全還原真實(shí)情況，因此，課題組會(huì)進(jìn)一步采用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該結(jié)果。