欒兆進(jìn)，趙勇超，宋慧子，張家新

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018； 2 包頭醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

附睪對(duì)精子的成熟和儲(chǔ)存具有重要作用[1]，在附睪液中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)蛋白質(zhì)都是附睪上皮細(xì)胞的分泌產(chǎn)物[2]。谷胱甘肽過氧化物酶5(glutathione peroxidase 5，GPX5)是谷胱甘肽過氧化物酶家族中的重要成員，其活性部位不含硒代半胱氨酸，而是含有半胱氨酸殘基[3]。研究表明，GPX5主要表達(dá)于附睪頭部區(qū)域，可以調(diào)節(jié)附睪微環(huán)境[4-6]。如果附睪中高表達(dá)的GPX5與雄性動(dòng)物生育能力的關(guān)系被完全證明，將有助于解釋附睪的功能。

線粒體呼吸是細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的主要來源[7]，細(xì)胞中的氧化劑和抗氧化劑之間失衡時(shí)，過量的ROS會(huì)通過多種機(jī)制損傷組織，如DNA損傷、脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化和羰基化、細(xì)胞巰基耗竭和促炎性細(xì)胞因子釋放的激活等[8-9]。因此，研究細(xì)胞內(nèi)存在的抗氧化機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究表明，與GPX5基因敲除的1歲雄性小鼠交配的野生型雌性小鼠發(fā)生自然流產(chǎn)和胎兒發(fā)育缺陷的概率增大[10]，這是由于在GPX5蛋白缺乏的情況下，精子的DNA受到一定程度的氧化損傷增加所致。Chabory等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在GPX5基因敲除的小鼠附睪尾部，GPX1、GPX3、GPX4和過氧化氫酶的水平升高，表明附睪發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)過量的ROS，這可能是GPX5缺乏而導(dǎo)致的一種補(bǔ)償反應(yīng)，這種補(bǔ)償性的表型變化是GPX5基因敲除的次要結(jié)果而非主要結(jié)果。因此，用一種更直接的方法驗(yàn)證GPX5的抗氧化作用是很有必要的。本試驗(yàn)以體外連續(xù)穩(wěn)定傳代的附睪上皮細(xì)胞(epididymal epithelial cells，EECs)為材料，利用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾其GPX5的表達(dá)，檢測(cè)干擾后EECs的增殖能力及ROS、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和核酸氧化損傷標(biāo)記8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)水平的變化，旨在探究GPX5在附睪抗氧化損傷保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

從屠宰場(chǎng)采集12月齡健康綿羊的睪丸，置于含有雙抗(200 IU/mL青霉素和200 μg/mL鏈霉素)的磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)中冷藏保存，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，并于超凈臺(tái)中取出附睪頭部組織，用于細(xì)胞體外培養(yǎng)。

主要試劑和試劑盒有LipofectamineTM3000 Reagent(Introvergen)、核糖核酸酶(Sigma)、ROS和MDA檢測(cè)試劑盒(碧云天)、CCK-8試劑盒(全式金)、蛋白酶K(Tiangen)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(博士德)、綿羊源GPX5 ELISA試劑盒(上海寶曼)、OHdG抗體(E-8)sc-393871(Santa Cruz)。主要儀器有NANODROP 2000紫外分光光度儀(Thermo)、酶標(biāo)儀(Bio-Tek)、Imager A2 顯微鏡(蔡司)、LightCycler480高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Roche)和激光共聚焦顯微鏡(Olympus)。

1.2 綿羊EECs的體外分離培養(yǎng)與鑒定

將附睪頭部組織剪成小塊(直徑1～3 mm)，于2.5 mg/mL胰酶(含0.91 mmol/L EDTA)中37 ℃水浴振蕩消化30 min后用血清終止消化，置于膠原酶Ⅳ中振蕩消化40 min，用孔徑0.15 mm不銹鋼濾網(wǎng)過濾消化液，獲得細(xì)管狀組織。使用PBS清洗細(xì)管狀組織，1 000 r/min離心5 min，重復(fù)3次，棄上清，沉淀加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、5 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、100 nmol/L雄激素、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素、50 ng/mL EGF和100 mmol/L海藻糖)，接種于直徑60 mm培養(yǎng)皿中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)用2.5 mg/mL胰酶(含0.91 mmol/L EDTA)消化1 min，棄去上清液(此時(shí)上清液主要為成纖維細(xì)胞)，繼續(xù)用胰酶消化2～3 min。用移液槍輕輕吹打皿底，使未懸浮的貼壁細(xì)胞懸浮，將上清液以1∶2的體積比接種至新的直徑60 mm培養(yǎng)皿中，即得P1代 EECs。

制備P1代EECs爬片，用預(yù)冷甲醇溶液固定5 min，體積分?jǐn)?shù)0.2% Triton X-100通透15 min，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫(H2O2)去除內(nèi)源性過氧化物酶，用質(zhì)量濃度50 mg/mL BSA封閉，加鼠源抗角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)抗體(1∶100倍稀釋)，4 ℃孵育過夜，加FITC標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(1∶100倍稀釋)，37 ℃孵育1 h，滴加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡拍照記錄。本試驗(yàn)以從附睪分離出的成纖維細(xì)胞為對(duì)照組，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 siRNA的篩選

從GenBank中下載GPX5基因mRNA CDS序列，利用Invitrogen在線設(shè)計(jì)工具(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/design.do)查找GPX5特異性siRNA序列，結(jié)果得到siRNA-N.1、siRNA-N.2和siRNA-N.3共3條序列；同時(shí)，隨機(jī)設(shè)計(jì)一段不與GPX5重合的擾碼(scramble)序列(siRNA-NC)作為陰性對(duì)照。4條序列(表1)交由漢恒生物公司合成后，與pHB-U6-MCS-CMV-ZsGreen連接構(gòu)建干擾載體。

表1 GPX5基因的siRNA序列

1.4 siRNA對(duì) EECs的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

siRNA對(duì)EECs的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照LipofectamineTM3000試劑說明書進(jìn)行操作。試驗(yàn)分為siRNA-N.1、siRNA-N.2和siRNA-N.3轉(zhuǎn)染組及siRNA-NC轉(zhuǎn)染對(duì)照組和正常EECs對(duì)照組(CK)。轉(zhuǎn)染前取生長旺盛期的EECs均勻接種于6孔板，采用無雙抗的完全培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～90%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。將干擾載體用Opti-MEM稀釋，加入P3000TMReagent混勻。取LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑，用 Opti-MEM稀釋。將干擾載體稀釋液和LipofectamineTM3000稀釋液按照體積比1∶1混合，靜置約15 min，即得瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑。將上述配好的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑加入六孔板內(nèi)輕輕混勻，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)34 h后，取樣用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 GPX5表達(dá)水平的檢測(cè)

1.5.1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 以β-actin為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)GPX5基因mRNA的表達(dá)水平。從GenBank核酸庫中檢索綿羊GPX5和β-actin基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為NM_001267883和NM_001009784.1)，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，由上海生工技術(shù)有限公司合成，引物序列見表2。

表2 試驗(yàn)所用的引物序列

使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞的RNA，用PrimeScriptTMRT Master Mix合成cDNA,進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL)為： SYBR Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 6.6 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)待測(cè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用 2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。以CK為基準(zhǔn)(其表達(dá)水平定為1)確定其他4個(gè)處理組的表達(dá)水平。

1.5.2 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 采用綿羊源GPX5 ELISA試劑盒檢測(cè)GPX5蛋白的表達(dá)水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。每組樣本重復(fù)3次。

1.6 GPX5干擾對(duì)EECs增殖及其ROS、MDA和8-OHdG含量的影響

1.6.1 EECs增殖活力檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)EECs的增殖活力。將siRNA-N.3(又稱siRNA-GPX5，下同)、siRNA-NC轉(zhuǎn)染對(duì)照組和CK組EECs分別用0，0.5，0.8，1.0和1.5 mmol/L H2O2處理2 h，加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測(cè)吸光度(A450)。每組樣本重復(fù)10次。

1.6.2 ROS水平檢測(cè) 將siRNA-GPX5、siRNA-NC轉(zhuǎn)染對(duì)照組和CK組的EECs用1 mmol/L H2O2處理2 h，向6孔板中加入足量的10 μmol/L DCFH-DA熒光探針孵育30 min，然后通過流式細(xì)胞儀分析DCF熒光強(qiáng)度，DCF值越大ROS水平越高。以CK的ROS水平為基準(zhǔn)(其含量定為1)，確定其他2組的ROS水平。每組樣本重復(fù)3次。

1.6.3 MDA水平檢測(cè) 將siRNA-GPX5、siRNA-NC轉(zhuǎn)染組和CK組的EECs用1 mmol/L H2O2處理2 h，加0.1 mL裂解液冰浴裂解15 min，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液即為待測(cè)蛋白液，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。用MDA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MDA水平，以CK的MDA水平為基準(zhǔn)(其含量定為1)，確定其他2組的MDA水平。每組樣本重復(fù)3次。

1.6.4 8-OHdG水平檢測(cè) 將siRNA-GPX5、siRNA-NC轉(zhuǎn)染組和CK組EECs用1 mmol/L H2O2處理2 h，使用100%甲醇室溫固定細(xì)胞5 min，體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100通透15 min，PBS清洗2次，然后用核糖核酸酶于37 ℃培養(yǎng)箱處理60 min，再用20 mg/mL蛋白酶K室溫處理15 min，2 mol/L HCl室溫變性5 min，2 mol/L Tris堿中和7 min，用10 mg/mL BSA室溫封閉1 h，用稀釋的8-OHdG鼠源一抗(1∶100倍稀釋)4 ℃孵育細(xì)胞過夜，再用山羊抗鼠二抗(1∶300倍稀釋)孵育30 min，最后用1 μg/mL DAPI染色15 min。將染色后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片中，用抗熒光淬滅劑封片后在Olympus FluoView FV10i共聚焦激光掃描顯微鏡系統(tǒng)(Olympus)下觀察8-OHdG的染色情況。每組樣本重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SPSS19.0軟件中的ANOVA對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，比較不同試驗(yàn)組細(xì)胞的GPX5 mRNA和蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖活力及ROS和MDA水平的差異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊EECs鑒定

采用免疫熒光鑒定P1代EECs，結(jié)果表明分離的目標(biāo)細(xì)胞可與CK18特異性抗體反應(yīng)，而對(duì)照組附睪中的成纖維細(xì)胞不表達(dá)CK18(圖1)。表明試驗(yàn)分離的細(xì)胞為EECs，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 綿羊EECs的鑒定(20×)

2.2 siRNA對(duì)EECs GPX5 mRNA表達(dá)水平的影響

RT-qPCR結(jié)果(圖2)顯示，與CK組相比，siRNA-N.1和siRNA-N.2組GPX5 mRNA 的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，siRNA-N.3組極顯著降低(P<0.01)；而siRNA-NC組GPX5 mRNA 的表達(dá)水平與CK組差異不顯著(P>0.05)。上述結(jié)果表明，siRNA-N.3組的干擾效果最佳。

與CK組相比，標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同

2.3 siRNA對(duì)EECs GPX5蛋白表達(dá)量的影響

GPX5蛋白表達(dá)量結(jié)果(圖3)顯示，與CK組相比，siRNA-N.1、siRNA-N.2和siRNA-N.3組GPX5蛋白的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，其中siRNA-N.3組的下調(diào)幅度最大，這與mRNA檢測(cè)結(jié)果一致;siRNA-NC組GPX5蛋白的表達(dá)量與CK組差異不顯著(P>0.05)。GPX5 mRNA和蛋白檢測(cè)結(jié)果均表明，siRNA-N.3可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 siRNA干擾后EECs GPX5蛋白的表達(dá)量

2.4 GPX5干擾對(duì)EECs增殖活力的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖4)顯示，隨著H2O2處理濃度的增加，與CK組相比，siRNA-GPX5組EECs的增殖活力逐漸下降，其中0.5 mmol/L H2O2使siRNA-GPX5組EECs的增殖活力顯著低于CK組(P<0.05)，0.8～1.5 mmol/L H2O2使siRNA-GPX5組EECs的增殖活力極顯著低于CK組(P<0.01)；0.5～1.5 mmol/L H2O2處理的siRNA-NC組EECs的增殖活力與CK組差異不顯著(P>0.05)。

2.5 GPX5干擾對(duì)EECs中ROS水平的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，與CK組相比，siRNA-GPX5組EECs中的ROS水平極顯著升高(P<0.01)，而siRNA-NC組的ROS水平無明顯變化(P>0.05)。

圖5 siRNA-GPX5干擾后EECs 中的ROS水平

2.6 GPX5干擾對(duì)EECs脂質(zhì)過氧化的影響

結(jié)果(圖6)顯示，siRNA-GPX5組EECs的MDA水平顯著高于CK組(P<0.05)，而siRNA-NC組EECs的MDA水平與CK組差異不顯著(P>0.05)。

2.7 GPX5干擾對(duì)EECs中8-OHdG水平的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖7)顯示，與CK組相比，siRNA-GPX5組EECs中的8-OHdG水平顯著升高(圖中紅色為8-OHdG特異性染色)，而siRNA-NC組EECs內(nèi)的8-OHdG水平變化不明顯。

圖7 siRNA-GPX5干擾后EECs中的8-OHdG水平檢測(cè)(20×)

3 討 論

本試驗(yàn)首先采用siRNA干擾技術(shù)建立了GPX5基因干擾模型，通過RT-qPCR和ELISA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對(duì)siRNA-N.1、siRNA-N.2和siRNA-N.3的干擾效果進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)siRNA-N.3的干擾效果最佳，可用于進(jìn)一步研究GPX5的抗氧化作用。

精子在附睪中運(yùn)輸時(shí)，其膜的磷脂構(gòu)成和膽固醇/磷脂比發(fā)生改變，其表面會(huì)增加一些重要修飾蛋白[11]，如去整合素和金屬蛋白酶7(ADAM7)[12]、GPX5[13]、半胱氨酸豐富分泌蛋白1(CRISP1)[14]、精子粘附分子1(SPAM1)[15]、質(zhì)膜Ca2+ATPase 4(PMCA4)[16]和連接粘附分子A(JAM-A)[17]等。附睪細(xì)胞合成并分泌的抗氧化劑可以清除ROS，從而保護(hù)精子免受細(xì)胞內(nèi)外ROS的攻擊[18]。有研究表明，大多數(shù)人的GPX5轉(zhuǎn)錄物是異常拼接的，包含118 bp的移位缺失[19]。有研究報(bào)道，人類精子、附睪液和精漿中的GPX5蛋白水平很低，甚至無法檢測(cè)到[20]，精子的質(zhì)量與其他哺乳動(dòng)物相比較差[21]，而導(dǎo)致精子功能障礙和DNA損傷最常見的原因就是氧化應(yīng)激[22]。本研究結(jié)果顯示，隨著H2O2處理濃度的增加，siRNA-GPX5組EECs的增殖活力在不斷下降，說明GPX5的干擾降低了EECs對(duì)抗氧化應(yīng)激的能力，GPX5一定程度上可以增加EECs對(duì)H2O2氧化刺激的抵抗力。GPX5干擾的EECs中ROS和MDA水平均顯著升高，這也揭示了GPX5在保護(hù)精子細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化損傷中的作用，說明GPX5在綿羊EECs中發(fā)揮磷脂氫過氧化物酶的抗氧化作用。本試驗(yàn)結(jié)果與Noblanc等[23]研究得出的GPX5基因缺失小鼠過氧化氫活性增加的結(jié)果一致。

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的高活性醛是DNA損傷的主要來源[24]，而8-OHdG是最常見的由氧化應(yīng)激引起的核酸損傷的標(biāo)記物。Chabory等[5]研究表明，與野生型小鼠相比，GPX5敲除小鼠附睪尾部的精子中8-OHdG和MDA水平升高，認(rèn)為GPX5的缺失造成了小鼠精子的DNA氧化損傷。本研究結(jié)果表明，與CK組相比，siRNA-GPX5組EECs中的8-OHdG水平顯著升高，說明GPX5可有效避免細(xì)胞DNA的氧化損傷，這與Taylor等[25]研究得出的外源性GPX5可在一定程度上保護(hù)CHO-K1細(xì)胞的DNA免受損傷的結(jié)果趨于一致?？偠灾?，本試驗(yàn)通過檢測(cè)GPX5干擾的EECs中的氧化應(yīng)激指標(biāo)，得到的結(jié)果均表明GPX5是附睪重要的抗氧化劑,并參與維持細(xì)胞和DNA的完整性。