黃建華，黃光輝，黃 河

（廣東省清遠市中醫(yī)院心血管內科，廣東 清遠 511500）

膿毒癥并發(fā)癥多，病死率可達30%～70%，臨床救治困難[1]。腸道被認為是膿毒癥誘發(fā)多器官功能障礙的啟動器官，其中保護腸道屏障功能是膿毒癥治療的重要途徑[2]。本課題組臨床觀察發(fā)現溫脾湯對膿毒癥，尤其是腸道功能障礙有較好的治療作用，但具體機制尚未闡明。本課題組探究溫脾湯對膿毒癥大鼠的腸道屏障功能的保護作用及其機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

選擇S P F級雄性S D大鼠5 0只，質量（200g±20）g，由廣東省動物實驗中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～26℃，相對濕度 40%～70%RH。

1.1.2 實驗藥物

溫脾湯（大黃12g，茯苓15g，人參10g，當歸10g，制附子10g，白術10g，枳殼10g，干姜9g，芒硝3g，炙甘草6g，每劑煎至100mL，1.03g/mL），由清遠市中醫(yī)院制劑室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備

膿毒癥動物模型建立采用國際公認的鼠類盲腸結扎穿孔（CLP）膿毒癥模型。 假手術組：剖腹后只在盲腸根部穿入絲線，不行結扎和穿孔。

1.2.2 分組與給藥

將大鼠稱重后按阿拉伯數字編號，按隨機原則平均分為5組：模型組（n=10，1號-10號）、假手術組（n=10，11號-20號）、中藥高劑量組（n=10，21號-30號）、中藥中劑量組（n=10，31號-40號）、中藥低劑量組（n=10，41號-50號）。藥物劑量以成人用藥劑量按實驗動物體型系數換算法計算，參照陳奇主編的《中藥藥理實驗方法學》，得溫脾湯5.3g/（kg·d），設為低劑量組，而中劑量和高劑量分別為低劑量的2倍和4倍，即10.6g/（kg·d）和21.2g/（kg·d）。中藥治療組造模后每劑藥按相應劑量中藥均加生理鹽水稀釋至9mL，分3等份，分別于術后 3h、11h、19h、27h、35h、43h（q8h）灌胃，其余均同時以等量生理鹽水干預，在制模后 24h 處死各組編號前5只大鼠、制模48h處死各組剩余大鼠，處死后立即取相應血液及組織標本。

1.3 觀察指標

利用采血針連接真空采血管從大鼠腹主動脈取血3～4mL，室內常溫下放置1h后，在4℃條件下離心處理（3000r/min），將血清放置在冰箱（-20℃）中待用。采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）分析法測定血清D-乳酸、IL-17水平。

取完血后處死大鼠并在無菌條件下迅速開胸收集實驗所需各組織。在距回盲瓣2～3cm處截取約5cm的小腸組織，用生理鹽水充分沖洗，確保腸內黏液及糞便沖洗干凈后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗液再次洗滌，并剔除位于腸壁的淋巴結，沖洗洗滌3次后，沖洗干凈后，觀察腸管外觀及漿膜形態(tài)，用手術剪將回腸組織剪分為3份，分別用于光鏡下觀察回腸組織形態(tài)學變化，以及ELISA分析法檢測腸道上皮細胞sIgA蛋白表達。

切開幼鼠腹腔，取結腸內容物立存于80℃冰箱保存?zhèn)溆靡詸z測幼鼠腸道菌群的變化。采集并準確稱量肝、腸系膜淋巴結各1g，檢測大鼠腸道細菌移位率。

即刻分離出脾組織，取綠豆大小脾臟放入PBS中，以備流式細胞實驗檢測Treg、Th17細胞；整個過程嚴格遵守無菌操作原則。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0版統(tǒng)計軟件包處理數據。計量資料以（±s）表示；兩組數據間比較用t檢驗，多組數據間用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組血清D-乳酸、IL-17水平比較

相較于假手術組，模型組血清D-乳酸、IL-17水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示試驗造模成功。相較于模型組，中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組血清D-乳酸、IL-17水平均更低，且隨著劑量的增加，水平越低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明溫脾湯對大鼠血清D-乳酸、IL-17水平有一定的影響。見表1。

表1 3組血清D-乳酸、IL-17水平比較 （±s）

表1 3組血清D-乳酸、IL-17水平比較 （±s）

組別 鼠數 D-乳酸（mmol/L） IL-17（ng/L）假手術組 10 3.12±0.71 691.23±45.81模型組 10 2.80±0.62 612.75±41.06中藥低劑量組 10 2.03±0.54 452.38±37.94中藥中劑量組 10 1.76±0.48 425.68±35.42中藥高劑量組 10 1.51±0.40 410.85±32.04 F 112.680 62.304 P 0.000 0.000

2.2 各組s Ig A蛋白表達比較

相較于模型組，各組s Ig A蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但各用藥組均有所降低，提示溫脾湯能在一定程度上調節(jié)大鼠的免疫球蛋白水平，減輕機體免疫反應。見表2。

表2 3組ZO-1蛋白和s Ig A蛋白表達的比較 （ug/mL，±s）

表2 3組ZO-1蛋白和s Ig A蛋白表達的比較 （ug/mL，±s）

組別 鼠數 IgA IgM IgG假手術組 10 11.21±2.36 7.52±1.36 8.52±1.69模型組 10 11.57±2.38 6.97±1.32 7.42±1.38中藥低劑量組 10 11.34±2.37 7.04±1.33 7.23±1.35中藥中劑量組 10 11.06±2.32 6.89±1.31 7.10±1.34中藥高劑量組 10 10.98±2.30 6.74±1.30 7.02±1.33 F 0.645 0.720 0.583 P 0.142 0.285 0.347

2.3 各組Treg和Th17細胞含量比較

相較于模型組，中藥低、中、高劑量組Treg和Th17細胞含量均更高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且中藥低、中、高劑量組之間呈明顯上升趨勢。見表3。

表3 3組Treg和Th17細胞含量的比較 （%，±s）

表3 3組Treg和Th17細胞含量的比較 （%，±s）

組別 鼠數 Treg（%） Th17（%）假手術組 10 4.02±0.32 1.76±0.34模型組 10 4.87±0.39 2.03±0.40中藥低劑量組 10 5.24±0.47 2.85±0.49中藥中劑量組 10 5.86±0.53 3.76±0.53中藥高劑量組 10 5.97±0.56 4.41±0.60 F 42.517 63.290 P 0.000 0.000

3 討 論

膿毒癥Sepsis是指宿主對感染產生的失控反應并出現危及生命器官功能障礙的臨床綜合征，并發(fā)癥多，病死率高達30%～70%，ICU住院時間長，花費高[3]。膿毒癥發(fā)生時，炎性反應致炎癥因子增加，腸道內環(huán)境平衡紊亂，腸上皮細胞凋亡增多，腸道黏膜屏障受到破壞，腸黏膜通透性發(fā)生改變，致使腸道菌群失調，內毒素入血，免疫系統(tǒng)失調，進而引發(fā)全身炎癥反應，危及患者生命[4]。腸道被認為是誘發(fā)多器官功能障礙的啟動器官，其中腸道屏障，包括機械屏障、生物屏障與免疫屏障，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[5]。

溫脾湯出至唐《千金備急方》，主治脾陽不足、陰寒內盛、寒積中阻證，是溫下劑的代表方。全方不僅能溫補脾陽，而且能除瘀血、滌蕩積滯、調理氣機，標本兼顧，攻補兼施，使邪去而正易復，直切膿毒癥胃腸功能障礙病機所在。既往研究證實，溫脾湯對膿毒癥，尤其是腸道功能障礙有較好的治療作用，但具體機制尚未闡明[6-8]。本研究結果顯示，溫脾湯對大鼠腸黏膜屏障功能可起保護作用，其中血清炎癥因子的水平經干預后明顯下降，提示溫脾湯對大鼠血清D-乳酸、IL-17的表達可起到抑制作用；對免疫系統(tǒng)相關指標分析發(fā)現，經溫脾湯干預后，Treg和Th17細胞含量明顯上升，而各免疫球蛋白盡管無明顯變化，但各用藥組均有所降低，提示溫脾湯能在一定程度上調節(jié)大鼠的免疫球蛋白水平，減輕機體免疫反應。

綜上所述，溫脾湯對膿毒癥大鼠腸黏膜屏障可起到保護作用，其機制可能與抑制炎癥因子表達、調節(jié)免疫系統(tǒng)有關。