張童，何弢，劉勇志，李曉菲，賀丹

（成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院 胸心乳腺外科，四川 成都 610041）

近年來(lái)，有學(xué)者在非小細(xì)胞肺癌（non-small lung cancer, NSCLC）細(xì)胞中檢測(cè)到自噬相關(guān)蛋白發(fā)生了改變，自噬可能與肺癌的發(fā)病、進(jìn)展有密切聯(lián)系[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）可對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中幾乎所有蛋白成分起降解作用，破壞阻礙腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用[2]。華蟾素膠囊是一種中藥制劑，在調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)等方面可發(fā)揮一定作用，常用于晚期腫瘤患者的輔助治療[3]。有研究指出，華蟾素膠囊聯(lián)合化療治療可提高中晚期NSCLC 患者療效，改善免疫功能，延長(zhǎng)生存期[4]。本研究擬探討華蟾素膠囊對(duì)中晚期肺癌手術(shù)患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶、自噬相關(guān)蛋白水平的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月—2021年4月就診于成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院的108 例中晚期NSCLC 患者。將患者分為對(duì)照組和研究組，各54 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》[5]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②卡氏功能狀態(tài)評(píng)分（Karnofsky performance status, KPS）≥60 分；③TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期；④預(yù)計(jì)生存時(shí)間＞6 個(gè)月；⑤無(wú)手術(shù)、化療禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝、腎等其他重要器官功能障礙者；②合并血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者；③術(shù)前3 個(gè)月接受其他治療方案者。兩組性別、年齡、KPS 評(píng)分、TNM 分期、肺癌類型比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），均衡性良好，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較 （n=54）

1.2 方法

患者均接受肺癌根治術(shù)，手術(shù)由同一組醫(yī)師完成。對(duì)照組患者術(shù)后4～5 周接受常規(guī)化療，即NP方案和GP 方案，NP 方案：第1、8 天靜脈滴注長(zhǎng)春瑞濱（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20067722）25 mg/（kg·m2），第1～5 天靜脈滴注順鉑（云南植物藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H53021679）20 mg/（kg·m2）。GP 方案：第1、8 天靜脈滴注吉西他濱（山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)恒欣藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20123345）1 000 mg/m2+250 mL 生理鹽水，第1～3 天靜脈滴注順鉑80～100 mg/m2。3 周為1 個(gè)化療周期，所有患者根據(jù)身體狀況接受3～6 個(gè)周期。研究組患者在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用華蟾素膠囊（陜西東泰制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050846），化療第1 天開始口服，與其他藥物服用間隔2 h，2 粒/次，3 次/d，3 周/周期，服用3 個(gè)周期。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1 臨床療效根據(jù)實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]評(píng)估患者臨床療效，分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、疾病穩(wěn) 定（stable disease, SD）、疾 病 進(jìn) 展（progressive disease, PD），比較兩組患者客觀緩解率（objective response rate, ORR），ORR = CR + PR。目標(biāo)病灶消失，且無(wú)新病灶出現(xiàn)，持續(xù)＞4 周計(jì)為CR；目標(biāo)病灶直徑總和減少＞30%，且持續(xù)＞4 周計(jì)為PR；目標(biāo)病灶直徑總和減少≤30%或增加≤20%計(jì)為SD；目標(biāo)病灶直徑總和增加＞20%計(jì)為PD。

1.3.2 免疫功能指標(biāo)于治療前、治療3 個(gè)周期后采集兩組患者晨起空腹血3 mL，離心后待測(cè)，采用BD Influx 流式細(xì)胞分析儀（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）測(cè)定T 淋巴細(xì)胞亞群水平，包括CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.3.3 腫瘤標(biāo)志物血清采集處理同上，采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)糖類抗原125（carbohydrate antigen-125, CA125）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase,NSE）。

1.3.4 MMP 和自噬相關(guān)蛋白血清采集處理同上，采用酶聯(lián)免疫法對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、自噬相關(guān)蛋白1（Beclin1）水平進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上海一研生物科技有限公司，選用美國(guó)賽默飛公司的FC/K3 臺(tái)式酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.3.5 不良反應(yīng)比較兩組患者肝功能損傷、惡心嘔吐、白細(xì)胞減少、血小板減少等不良反應(yīng)發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療后臨床療效比較

兩組患者治療后ORR 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.483，P=0.034），研究組高于對(duì)照組。見表2。

表2 兩組患者治療后臨床療效比較 [n=54，例（%）]

2.2 兩組患者治療前后免疫功能指標(biāo)比較

兩組患者治療前后CD3+、CD4+、CD8+的差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究組CD3+、CD4+下降程度，CD8+升高程度小于對(duì)照組。見表3。

表3 兩組患者治療前后免疫功能指標(biāo)的差值比較（n=54，%，±s）

表3 兩組患者治療前后免疫功能指標(biāo)的差值比較（n=54，%，±s）

組別對(duì)照組研究組t 值P 值CD3+-7.29±1.41-5.22±1.28 7.988 0.000 CD4+-4.74±1.24-2.54±0.58 11.810 0.000 CD8+1.83±0.32 0.59±0.20 20.929 0.000

2.3 兩組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物比較

兩組治療前后CA125、CEA、NSE 的差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究組下降程度大于對(duì)照組低。見表4。

表4 兩組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物的差值比較（n=54，±s）

表4 兩組患者治療前后血清腫瘤標(biāo)志物的差值比較（n=54，±s）

組別對(duì)照組研究組t 值P 值CA125/（u/mL）-12.85±1.28-18.39±2.30 15.466 0.000 CEA/（ng/mL）-7.93±1.64-10.86±2.08 8.129 0.000 NSE/（ng/mL）-6.84±1.52-10.31±1.88 10547 0.000

2.4 兩組患者治療前后MMP-2、MMP-9、Beclin1、LC3-Ⅱ比較

兩組患者治療前后MMP-2、MMP-9、Beclin1、LC3-Ⅱ的差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），研究組MMP-2、MMP-9 下降程度，Beclin1、LC3-Ⅱ升高程度大于對(duì)照組。見表5。

表5 兩組患者治療前后MMP-2、MMP-9、Beclin1、LC3-Ⅱ的差值比較 （n=54，±s）

表5 兩組患者治療前后MMP-2、MMP-9、Beclin1、LC3-Ⅱ的差值比較 （n=54，±s）

組別對(duì)照組研究組t 值P 值MMP-2/（μg/L）-86.09±10.24-126.88±12.89 18.208 0.000 MMP-9/（ng/L）-38.44±6.48-69.66±9.55 19.879 0.000 Beclin1/（ng/mL）1.68±0.34 3.27±0.51 19.062 0.000 LC3-Ⅱ/（ng/mL）10.72±1.23 16.71±2.06 18.346 0.000

2.5 兩組患者不良反應(yīng)比較

兩組患者血小板減少、肝功能損傷、白細(xì)胞減少、惡心嘔吐發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6。

表6 兩組患者不良反應(yīng)比較 [n=54，例（%）]

3 討論

西醫(yī)治療中晚期NSCLC 的宗旨是有效控制病灶部位腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，避免發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，而中醫(yī)治療該類疾病則以扶正培元為主，通過(guò)整體改善患者免疫功能，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞[7-8]。目前，中西醫(yī)結(jié)合治療NSCLC 已成為新趨勢(shì)，有研究證實(shí)，中醫(yī)藥輔助治療NSCLC 可發(fā)揮減毒增效的作用[9]。

肺癌在中醫(yī)上屬“肺積”“胸痛”范疇，與臟腑失調(diào)、外邪侵入等有關(guān)，該病辨證論治應(yīng)以清熱解毒、理氣疏肝為主[10]。華蟾素膠囊是一種由蟾皮加工而成的中藥制劑，蟾蜍入藥最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載，具有解毒消腫、清熱止痛、活血化瘀之功效[11]。本研究結(jié)果提示華蟾素膠囊可有效提高中晚期NSCLC 手術(shù)患者輔助治療的療效，改善免疫功能，降低血清腫瘤標(biāo)志物水平。究其原因在于：①華蟾素膠囊主要成分中含有大量蟾素內(nèi)脂素，具有散結(jié)破瘀、清熱解毒之功效；②華蟾素中含有多種活性成分，如生物堿、氨基酸等，其中吲哚類生物堿和強(qiáng)心甾體類化合物，如華蟾蜍素、脂蟾蜍配基、蟾酥毒基均具有一定抗腫瘤作用，可對(duì)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)揮毒性作用，作用于腫瘤細(xì)胞周期S 期，有效抑制癌細(xì)胞DNA 和RNA 合成，進(jìn)而癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；③華蟾素可作用于骨髓紅細(xì)胞，促使其聚落，進(jìn)而緩解骨髓抑制，有助于免疫功能的改善[12-13]。

自噬在腫瘤的發(fā)病、進(jìn)展中有重要作用，在腫瘤發(fā)生早期自噬可通過(guò)清除受損細(xì)胞器和致癌蛋白對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)起到抑制作用，但在腫瘤晚期又可通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、蛋白質(zhì)為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供必不可缺的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)生長(zhǎng)[14]。LC3 是一種標(biāo)記蛋白，主要定位于自噬體膜上，在合成后經(jīng)切割形成LC3-Ⅰ，與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ，參與自噬體形成過(guò)程，是臨床評(píng)估自噬活動(dòng)的金標(biāo)準(zhǔn)[15]。Beclin1是參與自噬活動(dòng)的特異性基因，參與自噬泡形成過(guò)程。Beclin1 水平下降提示細(xì)胞自噬活動(dòng)受到抑制，增加細(xì)胞應(yīng)激，基因組穩(wěn)定性下降，促進(jìn)腫瘤形成[16]。TANG 等[17]研究表明，Curcumin 可誘導(dǎo)線粒體膜破裂和線粒體嵴減少，提高Beclin1 和LC3 的水平，激活肺癌細(xì)胞的自噬活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)療效。趙景霞[18]的研究中也指出，Beclin1 和LC3 陰性表達(dá)提示肺癌術(shù)后接受化療的患者預(yù)后不良。這些研究均提示Beclin1 和LC3表達(dá)上調(diào)可使自噬活性提高，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。本研究結(jié)果從側(cè)面反映華蟾素膠囊用于中晚期NSCLC 手術(shù)患者輔助治療的臨床療效，通過(guò)增強(qiáng)自噬活性進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

NSCLC 發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提條件是穿過(guò)由血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)組成的組織學(xué)屏障，MMP-2、MMP-9 均是MMP 家族中的一員，其中MMP-9 可由腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，主要用于降解細(xì)胞外基質(zhì)促使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并可對(duì)堿性成纖維生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮因子起到誘導(dǎo)作用，加速腫瘤生長(zhǎng)[19]。MMP-2 是一種蛋白水解酶，可水解細(xì)胞間質(zhì)中的膠原蛋白和黏蛋白，促使細(xì)胞間的黏合力下降，有助于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，當(dāng)MMP-2 水平升高時(shí)則提示腫瘤細(xì)胞處于活動(dòng)狀態(tài)[20-21]。

綜上所述，華蟾素膠囊可有效提高中晚期肺癌手術(shù)患者輔助治療的療效，改善免疫功能，降低血清腫瘤標(biāo)志物水平，抑制MMP 水平，提高細(xì)胞自噬活性，且未增加不良反應(yīng)。