和俊豪 付子琳 丁 軍 馬 露,2 卜登攀,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院與世界農(nóng)用林業(yè)中心農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實驗室，北京 100193)

犢牛健康關系到牧場可持續(xù)發(fā)展，由于腹瀉造成的犢牛死亡數(shù)量占斷奶前犢牛死亡數(shù)量的百分比高達50%[1]，造成了極大的經(jīng)濟損失。在犢牛實際生產(chǎn)中，一般使用抗生素以治療犢牛腹瀉，但也產(chǎn)生了機體耐藥性等一系列問題。

微藻是一種在自然界中廣泛存在的單細胞光合自養(yǎng)生物[2]，種類繁多，具有生產(chǎn)成本低、生長周期短、可持續(xù)性強等特點[3]，且具有合成和富集多種生物活性物質的功能。裂殖壺藻是一種海洋微藻，富含二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等長鏈不飽和脂肪酸。DHA是ω-3多不飽和脂肪酸的一種，對大腦及視力發(fā)育具有極其重要的作用，同時具有抗氧化、降血壓以及預防心腦血管疾病的功能[4-5]。阿拉騰珠拉[6]研究表明，飼糧中添加裂殖壺藻可顯著提高犢牛生長性能，顯著降低犢牛糞便評分，并一定程度上緩解犢牛腹瀉。Meale等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂裂殖壺藻對羔羊的生長性能影響不大。但Flaga等[8]研究發(fā)現(xiàn)，使用較低添加劑量的裂殖壺藻可以改善犢牛的糞便評分，降低血液中細胞因子的mRNA表達量，對犢牛的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有益作用。但是野生型的裂殖壺藻DHA產(chǎn)量較低，在一定程度上限制了其應用。近年來，如何進一步提高裂殖壺藻DHA產(chǎn)量受到研究者的重視。相關研究往往通過優(yōu)化裂殖壺藻培養(yǎng)基成分及發(fā)酵工藝提高裂殖壺藻積累DHA能力，從而提高DHA產(chǎn)量[9-10]，但自然界篩選的野生藻種往往無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，因此，獲得一株富含DHA的裂殖壺藻生產(chǎn)藻株具有重大研究和應用意義。

目前，通常采用誘變育種的方式，在降低生產(chǎn)成本的同時提高DHA產(chǎn)量，將裂殖壺藻的生物合成代謝朝著生產(chǎn)更多DHA的方向引導，篩選出高產(chǎn)DHA優(yōu)勢藻株。Lian等[11]通過亞硝基胍(nitroso-guanidin，NTG)和紫外線(ultraviolet，UV)復合誘變得到高產(chǎn)裂殖壺藻藻株，含油量提高了34.84%；呂小義等[12]通過鈷60(60Co)-γ射線輻照誘變裂殖壺藻藻株，經(jīng)過多輪篩選，得到DHA產(chǎn)量為5.65 g/L的高產(chǎn)藻株。然而，傳統(tǒng)紫外及化學誘變存在正向突變率低、誘變效果差等問題。因此，本研究擬采用新型誘變技術——常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma，ARTP)作為誘變方法開展試驗。ARTP是近年來新興的一種誘變技術，它采用常壓輝光放電，產(chǎn)生高能氦氣等多種活性粒子，作用于菌體細胞壁或細胞膜，誘發(fā)其產(chǎn)生基因突變，具有操作簡便、高效安全、正向突變率高等優(yōu)點，已得到了廣泛應用[9]。與此同時，龔定芳等[13]利用丙二酸、碘乙酸等篩選因子篩選誘變藻株，獲得了DHA產(chǎn)量達6.59 g/L的高產(chǎn)DHA藻株，比原始藻株提升了46.12%。袁軍等[14]利用2,2’-聯(lián)吡啶建立高產(chǎn)DHA藻株篩選方法，篩選藻株DHA產(chǎn)量達7.31 g/L，較原始藻株提升了29.8%。因此，建立一種簡便高效的藻株篩選方法可以極大地提高目標藻株的篩選效率，針對DHA等不飽和脂肪酸合成機制[15]及其在藻株逆境脅迫中[16]能發(fā)揮重要作用等原理，設計采用琥珀酸的結構類似物丙二酸，活性氧誘發(fā)劑2,2’-聯(lián)吡啶作為藻株的篩選因子開展試驗，以期獲得富含DHA的高產(chǎn)藻株，為畜牧業(yè)新型飼料添加劑開發(fā)提供一種新的資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

裂殖壺藻原始藻株(ATCC20888)購置于廣東省菌種保藏中心。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，胰蛋白胨1 g/L，酵母粉1 g/L，瓊脂20 g/L，人造海水34.4 g/L。

種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基：參考文獻[17]配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 裂殖壺藻活化與培養(yǎng)

藻種活化：將-80 ℃保存的甘油管藻種，吸取500 μL于種子培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2～3 d，然后取100 μL藻液稀釋至適宜濃度后涂布于固體平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)至藻落長出。挑取長出的單藻落轉接至新的固體平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d，置于4 ℃冰箱備用。

種子培養(yǎng)：將固體平板培養(yǎng)基上的藻種用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵液培養(yǎng)：按5%接種量，將種子液轉接至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)120 h。

1.2.2 裂殖壺藻生物量(DCW)及油脂含量的測定

取30 mL發(fā)酵液于離心管中，8 000 r/min離心15 min，沉淀雙蒸水洗滌離心2次，冷凍干燥后稱量藻體干重(m1)，生物量計算如下：

生物量(g/L)=1 000×m1(g)/
發(fā)酵液體積(mL)。

采用磷酸香草醛法[14]快速測定油脂含量。

1.2.3 裂殖壺藻油脂提取

精確稱取1 g冷凍干燥后的藻體于離心管中，加入10 mL濃鹽酸和5 mL去離子水，75 ℃水浴1 h，期間每隔10 min振蕩1次。冷卻后加4 mL無水乙醇與10 mL正己烷，充分搖勻，3 000 r/min離心2 min，萃取油脂[17]。收集上層正己烷層于已知重量(m2)離心管中，重復2～3次，使用氮吹儀(65 ℃水浴)氮吹至正己烷完全蒸發(fā)，稱離心管總重(m3)。含油量、油脂產(chǎn)量計算公式如下：

含油量(%)=100×(m3-m2)/m1；
油脂產(chǎn)量(g/L)=生物量×含油量。

1.2.4 脂肪酸甲酯化

脂肪酸甲酯化方法參照文獻[18]。氣相色譜儀：安捷倫6890N；氣相色譜柱：Agilent hp-88(100 m×0.25 mm×0.20 μm)。

1.2.5 誘變藻株的制備及ARTP誘變

誘變藻懸液的制備：裂殖壺藻活化種子液，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)30～35 h；吸取一定量的藻液至50 mL離心管中，添加玻璃珠振蕩打散藻體細胞，4 000 r/min離心5 min，用無菌水洗滌藻體2次，最終重懸于一定量的無菌水和甘油中，同時甘油終濃度為5%，使得測定的吸光度(OD)值在0.9左右，制備為藻懸液。

ARTP誘變：吸取10 μL藻懸液至載片上，涂布均勻，按照誘變條件進行誘變。ARTP儀器型號：IIS(無錫天木源清生物科技有限公司)；ARTP誘變條件：功率120 W，氣量10 SLM，處理距離2 mm，冷卻水循環(huán)機設定溫度20 ℃；誘變處理按0、5、10、15、20、25、30、35 s梯度誘變。誘變后的載片放入含1 mL無菌水EP管中；將裝有載片的EP管振蕩1 min，稀釋涂平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)；待藻落長出后，計算致死率，確定最佳誘變時間，繪制致死率曲線，致死率計算公式為：

致死率(%)=100×(A-B)/A。

式中：A為未經(jīng)誘變處理的平板上生長的藻落數(shù)；B為經(jīng)過誘變處理的平板上生長的藻落數(shù)。

1.2.6 裂殖壺藻藻株的篩選

丙二酸篩選方法：將裂殖壺藻藻株涂布在分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 g/L丙二酸的平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。根據(jù)藻株生長情況，計算裂殖壺藻原始藻株致死率，確定丙二酸對藻株的最低抑制濃度。

2,2’-聯(lián)吡啶篩選方法：將裂殖壺藻藻株涂布在分別添加0、20、40、60、80、100、120、150、200 μmol/L的2,2’-聯(lián)吡啶平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。根據(jù)藻株生長情況，計算裂殖壺藻原始藻株致死率，確定2,2’-聯(lián)吡啶對藻株的最低抑制濃度。

丙二酸-2,2’-聯(lián)吡啶復合篩選方法：將裂殖壺藻藻株涂布在丙二酸及2,2’-聯(lián)吡啶2種篩選因子混合的不同濃度的平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。根據(jù)藻株生長情況，計算裂殖壺藻原始藻株致死率，確定復合篩選對藻株的最低抑制濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)使用SAS 9.4中MIXED模型進行方差分析，再采用Tukey氏法進行多重比較分析。試驗數(shù)據(jù)均以最小二乘均值±標準差(Lsmeans±SD)表示，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為存在趨勢。

2 結果與分析

2.1 裂殖壺藻活化、培養(yǎng)及誘變

將裂殖壺藻原始藻株進行藻株活化、稀釋涂布、平板劃線及搖瓶培養(yǎng)，后進行ARTP誘變，試驗流程如圖1所示。

圖1 裂殖壺藻活化、培養(yǎng)及誘變流程

2.2 ARTP誘變時間的確定

ARTP照射藻體的時間不同，使得藻體的基因突變率也不同。對原始藻株采用不同ARTP照射時間的方法進行誘變，并對藻體致死率進行分析，結果如圖2所示，隨著ARTP照射時間的增加，其與藻體致死率之間存在明顯的劑量關系。在0～5 s內(nèi)，隨著照射時間的延長，藻體致死率快速上升。5 s以后，隨著照射時間延長，藻體致死率緩慢上升。當照射時間為25 s時，藻體致死率達到99%以上。據(jù)相關研究報道，藻體致死率在85%～95%之間時，可得到較高的正向突變率[19]。因此，選擇誘變照射時間為15 s，在保證較高藻體致死率(95%左右)的同時，也可得到較高的正向突變率。

2.3 篩選因子最低抑制濃度的確定

2.3.1 丙二酸最低抑制濃度

丙二酸是琥珀酸的結構類似物，會爭奪琥珀酸脫氫酶結合位點，從而抑制藻體三羧酸循環(huán)過程，使藻體檸檬酸堆積。檸檬酸轉移至線粒體外后，被分解成的大量乙酰輔酶A，乙酰輔酶A可以作為脂肪酸合成前體物質產(chǎn)生更多的脂肪酸[13]。根據(jù)裂殖壺藻藻株在丙二酸平板培養(yǎng)基上的生長情況，確定丙二酸對藻株的最低抑制濃度。從表1可以看出，當丙二酸濃度為0.8 g/L時，藻體生長完全被抑制。趙犇[19]研究結果表明，裂殖壺藻致死率在90%以上為較為合適的篩選濃度。因此，選取0.6 g/L作為篩選平板中丙二酸添加濃度。

圖2 裂殖壺藻ARTP誘變致死率曲線

表1 丙二酸最低抑制濃度測定結果

2.3.2 2,2’-聯(lián)吡啶最低抑制濃度

2,2’-聯(lián)吡啶是活性氧(reactive oxygen species，ROS)的誘發(fā)劑之一，可以誘發(fā)機體產(chǎn)生ROS，而DHA等長鏈多不飽和脂肪酸具有抗氧化功能，可緩解由ROS引起的過氧化反應[14]。因此，通過2,2’-聯(lián)吡啶誘發(fā)的氧化脅迫可能提高DHA藻株的篩選效率。根據(jù)裂殖壺藻藻株在2,2’-聯(lián)吡啶平板培養(yǎng)基上的生長情況，確定2,2’-聯(lián)吡啶對藻株的最低抑制濃度。從表2可以看出，當2,2’-聯(lián)吡啶濃度為80 μmol/L時，藻體生長完全被抑制。有研究表明，藻體致死率在90%以上的篩選因子濃度為合適的篩選濃度[19]。因此，選取60 μmol/L作為篩選平板中2,2’-聯(lián)吡啶添加濃度。

表2 2,2’-聯(lián)吡啶最低抑制濃度測定結果

2.3.3 丙二酸-2,2’-聯(lián)吡啶復合篩選

王申強[20]研究發(fā)現(xiàn)，通過將多種篩選因子的濃度進行一定比例的混合，可以提高藻株的篩選效率，起到多重作用。根據(jù)裂殖壺藻藻株在丙二酸-2,2’-聯(lián)吡啶復合平板培養(yǎng)基上的生長情況，確定丙二酸-2,2’-聯(lián)吡啶復合因子對藻株的最低抑制濃度。從表3可以看出，將2種篩選因子進行混合，2,2’-聯(lián)吡啶篩選因子的致死效應更高。趙犇[19]的結果也證實選擇復合篩選裂殖壺藻原始藻株致死率在90%以上的篩選濃度為合適的藻株篩選濃度。因此，本研究選取0.6 g/L丙二酸、20 μmol/L 2,2’-聯(lián)吡啶作為篩選平板中復合因子的添加濃度。

2.4 誘變選育

對裂殖壺藻原始藻株進行誘變，分別利用上述3種篩選平板及無篩選因子平板進行篩選，共得到突變藻株43株，分別根據(jù)其篩選特性對其進行命名，分別為丙二酸篩選藻株I-B-1～I-B-12，2,2’-聯(lián)吡啶篩選藻株I-L-1～I-L-12，復合篩選藻株I-F-1～I-F-11，無篩選因子誘變藻株I-D-1～I-D-8。將所有藻株按培養(yǎng)條件連續(xù)培養(yǎng)5 d，搖瓶發(fā)酵的藻體生物量、油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量的結果如圖3、圖4、圖5和6所示。由圖可以看出，相同篩選組內(nèi)的藻株發(fā)酵特性相對穩(wěn)定，生物量差異較小。

表3 藻落在不同濃度丙二酸-2,2’-聯(lián)吡啶復合篩選平板上的生長情況

圖3 丙二酸篩選裂殖壺藻藻株生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量測定

分別從各組中選取DHA產(chǎn)量較高的3株藻株進行發(fā)酵特性比較，從表4可以看出，丙二酸篩選藻株、2,2’-聯(lián)吡啶篩選藻株、丙二酸-2,2’-聯(lián)吡啶復合篩選藻株和無篩選因子誘變藻株的平均DHA產(chǎn)量與原始藻株相比均有顯著提高(P<0.05)，分別提高了32.20%、25.01%、29.71%和19.25%。同時，丙二酸篩選平板選育的藻株其DHA含量及產(chǎn)量相對穩(wěn)定，且誘變的效果更好，其DHA平均產(chǎn)量提升顯著高于其他篩選平板選育的藻株(P<0.05)。復合篩選組藻株平均DHA產(chǎn)量高于2,2’聯(lián)吡啶組、無篩選因子組(P>0.05)，但略低于丙二酸組(P>0.05)。試驗結果表明，將丙二酸濃度與2,2’-聯(lián)吡啶濃度的簡單結合并不能完全起到篩選的雙重作用效果，但DHA含量及產(chǎn)量最高的菌株I-F-9(DHA含量達54.56%，DHA產(chǎn)量達10.88 g/L)卻是從復合平板上篩出的，其DHA含量較原始菌株顯著增加了74.62%(P<0.05)，DHA產(chǎn)量較原始藻株顯著增加了61.17%(P<0.05)。因此，該結果間接表明丙二酸的篩選作用明顯優(yōu)于2,2’-聯(lián)吡啶，且通過復合添加多種篩選因子可以提高篩選效率，同時，篩選效率的提高可能與菌體致死率有關，但具體原理還需進一步驗證。

圖4 2,2’-聯(lián)吡啶篩選裂殖壺藻藻株生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量測定

圖5 復合篩選裂殖壺藻藻株生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量測定

3 討 論

ARTP誘變具有誘變溫度低、操作簡便、活性粒子濃度高且對環(huán)境無污染等優(yōu)點[19]。ARTP可穿過細胞壁直接作用于裂殖壺藻，在保持較高能量傳輸?shù)耐瑫r也可避免溫度過高而產(chǎn)生熱致死效應，從而產(chǎn)生更強的生物效應[21]。ARTP產(chǎn)生的ROS可以改變細胞膜的結構與通透性，同時能與細胞內(nèi)DNA等大分子相互作用，改變細胞代謝活動與遺傳特征，觸發(fā)細胞的SOS修復機制，從而產(chǎn)生種類豐富的錯配位點，并最終穩(wěn)定遺傳形成突變株[22-23]。因此，本研究采用的ARTP誘變方法能夠作為一種簡便高效的誘變方法應用到裂殖壺藻的育種中，在提升誘變效率的同時提高藻株DHA產(chǎn)量。

圖6 無篩選因子篩選裂殖壺藻藻株生物量、油脂產(chǎn)量、DHA產(chǎn)量測定

表4 不同篩選方法裂殖壺藻DHA含量及產(chǎn)量比較

在裂殖壺藻的脂肪酸生物合成中有2條主要合成途徑，分別為通過脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)延伸和脫飽和合成短鏈飽和脂肪酸及其衍生物，以及通過聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)合成長鏈多不飽和脂肪酸[24]。在這2種合成途徑中，都需要提供乙酰輔酶A作為脂肪酸合成的前體物質[25]。丙二酸通過抑制藻體三羧酸循環(huán)過程以促進細胞內(nèi)檸檬酸堆積，檸檬酸在線粒體中分解為乙酰輔酶A，為藻體的脂肪酸合成提供了充足的前體物質[15]，進而促進藻體DHA等長鏈不飽和脂肪酸的合成與積累。2,2’-聯(lián)吡啶可以作為氧化還原反應中的電子受體，在細胞內(nèi)經(jīng)呼吸鏈傳遞電子產(chǎn)生氧自由基，氧自由基可誘導超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的大量產(chǎn)生，進而對ROS毒性產(chǎn)生抵御作用，但SOD對ROS的清除能力是有限的，ROS超出限度后則會產(chǎn)生氧化脅迫對機體產(chǎn)生傷害[26]。DHA等長鏈不飽和脂肪酸在細胞中可以作為抗氧化劑發(fā)揮作用，與SOD共同抵御由ROS誘導的氧化脅迫[16]。經(jīng)過ARTP誘變的藻體細胞可以通過提高DHA的合成能力，進而提高抗氧化能力，因此，經(jīng)過高濃度2,2’-聯(lián)吡啶篩選的裂殖壺藻藻株，可能具有較高的DHA合成能力。試驗結果表明，將丙二酸與2,2’-聯(lián)吡啶作為篩選因子可以提高DHA高產(chǎn)藻株的篩選能力，丙二酸篩選藻株平均產(chǎn)量優(yōu)于2,2’-聯(lián)吡啶篩選藻株平均產(chǎn)量，可能是由于ARTP誘變使藻體細胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，2,2’-聯(lián)吡啶誘導產(chǎn)生的氧自由基使藻體細胞超出自身的調(diào)節(jié)能力，過量的ROS與藻體細胞內(nèi)生物大分子反應，導致DNA、蛋白質的損傷和膜脂質的過氧化，提高了細胞的致死率，致死率過高往往產(chǎn)生更多的負突變[14]。同時，將2種篩選因子進行濃度的簡單結合并不能顯著提高藻體的篩選效率。未來通過連續(xù)誘變，多輪組合篩選有望進一步優(yōu)化誘變方法，并提升藻體的篩選效率。

目前，針對提高裂殖壺藻DHA產(chǎn)量及含量已有較多的研究。通過誘變與強氧化劑施壓篩選得到的高產(chǎn)DHA藻種，其DHA產(chǎn)量達到7.3 g/L，相比原始藻株提高了29.8%[14]；許永等[27]采用紫外誘變及喹禾靈篩選的方法，篩得的藻株DHA產(chǎn)量為1.2 g/L，DHA含量較原始藻株提高了28.7%。通過本試驗建立的誘變篩選方法，誘變藻株較原始藻株在DHA產(chǎn)量及含量上均得到提升(分別提高了61.17%和74.62%)，且在相同發(fā)酵體系下DHA含量和產(chǎn)量均高于其他的研究結果，相關研究裂殖壺藻DHA含量產(chǎn)量比較如表5所示。研究表明，不同的發(fā)酵體系、發(fā)酵時間對藻株的DHA產(chǎn)量有較大影響，在保持發(fā)酵時間穩(wěn)定的情況下，500 mL和5 L的不同發(fā)酵體系，藻株的DHA產(chǎn)量從1.35 g/L提高到了20.3 g/L[28]；在發(fā)酵體系擴大的同時，將發(fā)酵時間從61 h延長到96 h，DHA產(chǎn)量從6.53 g/L提高到了28.93 g/L[29]。在相同的250 mL搖瓶發(fā)酵體系下，本研究藻株的DHA含量和產(chǎn)量均處于目前同類研究報道的前列，具有極大的開發(fā)潛力，后期經(jīng)過發(fā)酵條件及發(fā)酵規(guī)模的優(yōu)化調(diào)整后，有望進一步提高DHA產(chǎn)量和含量，使其在降低幼齡動物糞便評分、緩解幼齡動物腹瀉、提高幼齡動物免疫力等方面發(fā)揮更大的作用與功能。

表5 相關研究裂殖壺藻DHA含量產(chǎn)量比較

綜上所述，本研究采用ARTP誘變及丙二酸、2,2’-聯(lián)吡啶和丙二酸-2,2’-聯(lián)吡啶復合定向篩選的方式，為高產(chǎn)DHA裂殖壺藻的良種選育提供了一套簡便高效的方法。同時，為選育其他提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的微生物突變體提供了重要參考。

4 結 論

將裂殖壺藻原始藻株采用ARTP誘變的方法，結合丙二酸、2,2’-聯(lián)吡啶及丙二酸-2,2’-聯(lián)吡啶復合篩選，極大地提高了DHA藻株的篩選效率，最終從復合平板上篩選出突變藻株I-F-9，在250 mL發(fā)酵體系下的生物量、油脂產(chǎn)量及DHA產(chǎn)量分別達到38.82、19.94和10.88 g/L，其中DHA產(chǎn)量較原始藻株提高了61.17%，DHA含量提高了74.62%。