陳 銳, 陳智坤,瞿 佳, 門 欣,孫曉宇 ,鄧 媛,趙玲俠,沈衛(wèi)榮

(1.陜西省微生物研究所微生物資源研究中心, 陜西 西安 710043; 2.陜西省科學(xué)院秦嶺天然產(chǎn)物工程中心, 陜西 西安 710043; 3. 陜西省科學(xué)院土壤資源與生物技術(shù)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省西安植物園(陜西省植物研究所),陜西 西安 710061 )

氯氰菊酯是目前最為廣泛使用的菊酯類殺蟲劑之一。使用后，殘留農(nóng)藥大部分進(jìn)入土壤或水體。殘留于土壤中的氯氰菊酯不僅會(huì)改變土壤酶活[1]，影響土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)[2～3]，影響作物生長(zhǎng)[4]，改變土壤中無脊椎物的數(shù)量[5]，對(duì)脊柱動(dòng)物具有發(fā)育毒性[6～7]，可促進(jìn)脂肪積累并導(dǎo)致小鼠肥胖[8]。人類長(zhǎng)期接觸可能引起皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡[9]、帕金森癥[10]、卵巢功能障礙[11]。針對(duì)可能存在的潛在危害，研究學(xué)者提出利用微生物的生命代謝活動(dòng)，在污染地區(qū)使用微生物菌劑，使其在土壤中降解特定的污染物[12～13]，可在短時(shí)間內(nèi)加速土壤中污染物的降解，恢復(fù)土壤健康，降低農(nóng)產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)[14]。目前已報(bào)道的氯氰菊酯降解微生物多集中于細(xì)菌類微生物上[15～22]，不產(chǎn)生芽孢及可能屬于條件致病性微生物限制了這類降解細(xì)菌的應(yīng)用開發(fā)。降解微生物在土壤中能否定殖也決定了該類微生物在土壤環(huán)境中發(fā)揮其降解能力的關(guān)鍵。在前期自70余份土壤樣本中分離獲得可高效降解氯氰菊酯菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)SSCL-3 及草酸青霉(penicillium oxalicum)SSCL-5，經(jīng)紫外分光光度法及HPLC驗(yàn)證其在無機(jī)鹽培養(yǎng)基(含氯氰菊酯400mg/L)中，對(duì)氯氰菊酯的降解率達(dá)85%以上[23～24]。這兩株降解微生物屬于真菌微生物，不具致病性，可產(chǎn)生大量孢子適于應(yīng)用開發(fā)。這兩株菌對(duì)其他菊酯家族成員也有一定的降解效果并且其降解類型不完全重疊，為驗(yàn)證其在土壤中降解氯氰菊酯的實(shí)際效果，將該兩株菌制備成復(fù)合菌劑S35，通過40 d棚室土壤田間試驗(yàn)，監(jiān)測(cè)土壤中氯氰菊酯殘留，菌劑S35中效能微生物SSCL-3及SSCL-5在土壤中的定殖，土壤真菌多樣性，土壤理化指標(biāo)及觀測(cè)作物生長(zhǎng)的變化，對(duì)菌劑S35的應(yīng)用開發(fā)做全面的評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 菌劑制備

分別將SSCL-3及SSCL-5斜面孢子接種于均勻接種于麩皮稻殼固體培養(yǎng)基。

SSCL-3固體培養(yǎng)基:麩皮60%，稻殼5%，水30%，豆粕 0.112%，葡萄糖0.5%，大米粉0.2%，植物油0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%。培養(yǎng)：溫度28℃，pH6，發(fā)酵接種量10-4個(gè)孢子/100mL，培養(yǎng)192 h。

SSCL-5固體培養(yǎng)基：麩皮55%，稻殼10%，水30%，豆粕 0.112%，葡萄糖0.5%，大米粉0.2%，植物油0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%。培養(yǎng)：溫度28℃，pH7，發(fā)酵接種量10-4個(gè)孢子/100 mL，培養(yǎng)168 h。

將培養(yǎng)物低溫烘干約72 h(<45℃)。在粉碎機(jī)中以間歇模式進(jìn)行粉碎至約60目大小。以SSCL-3粉碎物:SSCL-5粉碎物:麩皮:高嶺土=1∶1∶10∶8，攪拌混合均勻，獲得固體制粉狀制劑，制劑自封袋分裝，在常溫條件下保存。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)組，每組用地長(zhǎng)5 m，寬4 m。分別為S35對(duì)照組(菌劑對(duì)照組)、S35-SY修復(fù)組(修復(fù)實(shí)驗(yàn)組)、SY對(duì)照組(農(nóng)藥對(duì)照組)及CK對(duì)照組(空白對(duì)照)。菌劑及農(nóng)藥用量如下：

S35組(菌劑S35施用400 g/m2用量)，S35-SY組(菌劑S35施用400 g/m2用量，氯氰菊酯農(nóng)藥大功達(dá)10%乳油 450 mL/m2使終濃度達(dá)到約100 mg/kg)，SY組(氯氰菊酯農(nóng)藥100 mg/kg)。農(nóng)藥及菌劑施用后翻耕深度約25 cm，6 d后栽種番茄(金鵬1號(hào))作為觀測(cè)作物，每7～10 d澆水一次。

1.3 土樣采集

從施工日開始作為0d，每10天取樣一次，至50 d取樣結(jié)束，共計(jì)取樣6次。五點(diǎn)取土法，取土深度5～20 cm，取樣后合并成為1個(gè)樣本，每組取平行3個(gè)，取樣總數(shù)為72個(gè)。

1.4 土壤中氯氰菊酯殘留量的測(cè)定

土壤中氯氰菊酯的提取及測(cè)定 稱取土壤15 g于250 mL三角瓶，加入5 g無水硫酸鈉和50 mL乙酸乙酯，震蕩萃取30 min，萃取3次，合并萃取液。將萃取液過無水硫酸鈉后，35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用15 mL乙腈定容。HPLC HP-1100 C18柱，柱溫35℃ 波長(zhǎng)235 nm，流動(dòng)相：乙腈∶水=80∶20，流速 1 mL/min，上樣量10 uL[25]。

1.5 功能菌株在土壤中的定殖監(jiān)測(cè)

稱取土壤樣本5 g加入45 mL無菌生理鹽水中梯度稀釋，將10-3,10-4,10-5的稀釋液涂布于含氯氰菊酯的PDA平板上，28℃，靜置培養(yǎng) 48 h，觀察平板上菌落的生長(zhǎng)。

1.6 土壤樣本微生物多樣性監(jiān)測(cè)

取土壤樣本每份4 g，置于無菌EP管，干冰寄送至聯(lián)川生物(Omicstudio)進(jìn)行土壤樣本的基因組提取，提取后進(jìn)行高通量 ITS V3-4區(qū)測(cè)序，進(jìn)行土壤真菌多樣性分析。

1.7 土壤樣本理化指標(biāo)監(jiān)測(cè)

取土壤樣本1kg寄送至中科院水土保持研究所進(jìn)行土壤理化指標(biāo)測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)包括土壤土壤含水量(烘干法)、含鹽量(土壤總鹽量測(cè)定法)、pH(玻璃電極法)、NPOC(重鉻酸鉀容量法—外加熱法)、微生物碳(氯仿熏蒸浸提法)、全氮(凱式定氮法)、硝態(tài)氮(流動(dòng)分析法)、銨態(tài)氮(流動(dòng)分析法)、微生物氮(氯仿熏蒸浸提法)、全磷(鉬銻抗比色法)、速效磷(NaHCO3浸提鉬銻抗比色法)、速效鉀(NH4OAc浸提，火焰光度法)的測(cè)定。

1.8 作物指標(biāo)測(cè)定

從番茄種下第2日起進(jìn)行番茄苗株高及葉片大小的測(cè)定。番茄苗隨機(jī)選取5株量其整株的高度。葉片隨機(jī)選中段分支5個(gè)，測(cè)量第1葉片大小。觀測(cè)葉片上是否有異常色斑等病變。每10天測(cè)定一次，測(cè)定至50 d后結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯氰菊酯殘留量監(jiān)測(cè)

土壤樣本經(jīng)乙酸乙酯萃取后，HPLC檢測(cè)其殘留含量。其結(jié)果如下圖所示，初始氯氰菊酯濃度約為85 mg/kg以上，經(jīng)過40 d修復(fù)期后，S35-SY修復(fù)組土壤中殘留的氯氰菊酯濃度降至9.25 mg/kg，下降了約89%，SY對(duì)照組殘留量為48.34，下降了約47%。與對(duì)照相比具有顯著差異(T-test p=0.04)。

注 *同列差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，**同列差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)，

2.2 菌株SSCL-3及SSCL-5在土壤中的定殖觀察

通過重新從土壤中分離培養(yǎng)可在氯氰菊酯平板上正常生長(zhǎng)的真菌微生物，來觀察菌株SSCL-3及SSCL-5在40 d修復(fù)過程中在土壤中的定殖過程(圖2)。結(jié)果表明0～40 d，加入菌劑的S35對(duì)照組及S35-SY修復(fù)組均可觀察到類似于草酸青霉及米曲霉形態(tài)的真菌菌落生長(zhǎng)，而在沒有菌劑的SY對(duì)照組則未觀察到真菌菌落的生長(zhǎng)。

圖2 菌劑S35在土壤中的定殖

2.3 菌劑微生物的定殖監(jiān)測(cè)

進(jìn)一步通過高通量測(cè)序分析可以更加準(zhǔn)確的了解菌劑S35在土壤中的定殖情況。如圖3所示，S35對(duì)照組及S35_SY修復(fù)組在種水平上持續(xù)檢出黃曲霉(Aspergillus flavus)，而SY對(duì)照組及CK對(duì)照組黃曲霉水平則非常低。黃曲霉與米曲霉在基因測(cè)序中幾乎無法區(qū)分，這應(yīng)當(dāng)是外源添加米曲霉后定殖的結(jié)果。在S35對(duì)照組中， 0 d及10 d可以監(jiān)測(cè)到草酸青霉(Penicillium oxalicum)，在S35_SY修復(fù)組中0 d至40 d均可以檢出一定比例的草酸青霉(Penicillium oxalicum)，當(dāng)土壤中含有一定濃度的氯氰菊酯殘留時(shí)有利于草酸青霉的定殖。

圖3 種水平的土壤樣本中目標(biāo)菌株的檢出

在種水平上比較不同天數(shù)相對(duì)含量有差異的微生物(如圖4所示)，米曲霉及草酸青霉在S35對(duì)照組，S35-CY修復(fù)組與SY對(duì)照組，CK對(duì)照組具有顯著差異。通過高通量測(cè)序結(jié)果可以認(rèn)為外源引入的米曲霉(Aspergillus oryzae)SSCL-3在土壤中的定殖與土壤殘留氯氰菊酯無相關(guān)性，但草酸青霉SSCL-5可能具有一定的相關(guān)性。

圖4 種水平上不同天數(shù)測(cè)序相對(duì)量差異顯著微生物

2.4 土壤真菌微生物多樣性監(jiān)測(cè)

土壤真菌的α多樣性主要通過Chao1,Shannon,Simpson等指數(shù)變化來反應(yīng)，測(cè)序結(jié)果如圖5所示，S35對(duì)照組、S35-SY修復(fù)組及SY對(duì)照組土壤的Chao1, Otu, Shannon, Simpson指數(shù)均比對(duì)照低，隨著天數(shù)的增加S35對(duì)照組，S35-SY修復(fù)組微生物多樣性指數(shù)均有所恢復(fù)，SY對(duì)照組恢復(fù)則的較慢。通過多樣性測(cè)序結(jié)果可以認(rèn)為菌劑的加入有助于土壤微生物菌群的恢復(fù)。

圖5 土壤修復(fù)過程中真菌α多樣性變化監(jiān)測(cè)

真菌群落屬水平上的聚類分析結(jié)果如圖6所示，基本聚為兩簇，A組中為S35-SY 0D , S35-SY 10D, S35-SY 20D,S35 0D, S35 10D, S35 20D, S35 30D屬于添加了修復(fù)菌劑的S35早中期樣本，B組中為CK 組 SY組以及S35-SY 30D , S35-SY 40D，屬于加入菌劑后期樣本與對(duì)照，聚類顯示在修復(fù)初期由于菌劑的加入確實(shí)對(duì)土壤微生物菌群多樣性產(chǎn)生了影響，但到修復(fù)后期逐步恢復(fù)與對(duì)照接近。菌劑對(duì)土壤真菌多樣性的影響是暫時(shí)性的。

圖6 修復(fù)土壤真菌群落聚類圖

2.5 土壤理化指標(biāo)監(jiān)測(cè)

對(duì)5 -20 cm 土壤樣本進(jìn)行含水量、pH、土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)、有機(jī)碳(SOC)、全氮(Total-N)、銨態(tài)氮(NH4-N)、硝態(tài)氮(NOx-N)、微生物氮(TNb)、全磷(Total-P)、速效磷(Olsen-P)、速效鉀(Olsen-K)及土壤團(tuán)聚體(GMD)指標(biāo)的監(jiān)測(cè)。土壤理化結(jié)果顯示(表1)，除有機(jī)碳，全氮，全磷，速磷及速鉀以外其他土壤樣本的理化指標(biāo)無差異。分析認(rèn)為這些差異與菌劑輔料及農(nóng)藥有關(guān)，而與微生物本身無相關(guān)性。菌劑輔料中的麩皮、高嶺土等成分以及摻入土壤的氯氰菊酯增加了土壤有機(jī)碳，氮，磷，鉀的水平。

2.6 作物生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)

經(jīng)過50 d對(duì)觀測(cè)作物番茄的監(jiān)測(cè)，其植株及葉片的生長(zhǎng)未受到氯氰菊酯菌劑S35的影響(圖7)，在植株及葉片上未觀察到有病變，在后期其掛果及產(chǎn)果過程中也未觀察到與對(duì)照組有差異，S35菌劑對(duì)觀測(cè)作物番茄生產(chǎn)無不良影響。

圖7 菌劑對(duì)作物生長(zhǎng)的影響

3 討論

擬除蟲菊酯是具有低哺乳動(dòng)物毒性的合成有機(jī)殺蟲劑，已在全世界的農(nóng)村和城市地區(qū)廣泛使用，擬除蟲菊酯已在多種環(huán)境包括土壤，水，沉積物和生物中被廣泛檢測(cè)到。在長(zhǎng)江三角洲的農(nóng)業(yè)土壤中調(diào)查四種常見擬除蟲菊酯的污染水平，241個(gè)土壤樣品中檢出了擬除蟲菊酯(檢出率88.8%)。四種擬除蟲菊酯的平均濃度：聯(lián)苯丙菊酯(4.92 ng / g)、氯氰菊酯(1.10 ng /g)、溴氰菊酯(0.89 ng/g)、氯氟氰菊酯(0.20 ng/g)[26]。廣州地區(qū)的調(diào)查顯示在水和沉積物中都觀察到八種擬除蟲菊酯濃度的顯著增加[27]。對(duì)中國(guó)堅(jiān)果種植土壤中的29種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了調(diào)查。在65.8%的土壤中檢出的六種擬除蟲菊酯(聯(lián)苯菊酯，聯(lián)苯丙菊酯，氯氟氰菊酯，氯氰菊酯，氰戊菊酯和溴氰菊酯)的殘留量為1.5μg/ kg至884.3μg/ kg[28]。在中國(guó)20個(gè)省份的溫室和露天土壤中擬除蟲菊酯的水平和分布調(diào)查中，擬除蟲菊酯(PYs)的總濃度在1.30到113 ng / g之間，溫室中發(fā)現(xiàn)的污染要比在露天田地高。80%的溫室中總擬除蟲菊酯的含量顯著高于附近的田間土壤(p<0.05)。在中國(guó)北方省份PYs的污染普遍更為嚴(yán)重[29]。

殘留擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對(duì)環(huán)境生物產(chǎn)生威脅，對(duì)人類具有發(fā)育毒性、生殖毒性，神經(jīng)毒性等問題，快速降殘留擬除蟲菊酯水平有利于生態(tài)及人類健康發(fā)展。去除環(huán)境中殘留的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留可采用物理、化學(xué)及生物學(xué)的方法，例如：冷等離子體[30]，光解[31]，海藻[32]、植物[33]、微生物吸收及降解[34]等手段。目前研究報(bào)道顯示微生物降解手段安全有效并且廉價(jià)，最具有應(yīng)用潛能?？稍谝后w介質(zhì)中有效降解擬除蟲菊酯的微生物有：芽孢桿菌屬[35]，短桿菌屬[15]，假單胞菌屬[16]，沙門氏菌屬[17]、克雷伯氏菌[18]和鞘氨醇菌屬[19]等細(xì)菌以及黑曲霉[20]、白腐真菌[21]、曲霉[22]等真菌。

土壤中可有效去除擬除蟲菊酯的微生物研究主要集中在細(xì)菌上，最高可將200 mg/kg的氯氰菊酯在42 d降解90%[15]。在本研究的前期初篩中也分離出可降解氯氰菊酯的假單胞屬、鞘氨醇菌屬及沙雷氏屬等細(xì)菌。但考慮到部分細(xì)菌菌株屬于條件致病菌，一方面可能造成健康風(fēng)險(xiǎn)，另一方面可能會(huì)導(dǎo)致土壤微生物耐藥性加重。另一些篩選出的細(xì)菌菌株不產(chǎn)生芽孢，在環(huán)境中抗逆性較差，因此從實(shí)際應(yīng)用及生物安全角度考慮，最終采用米曲霉及草酸青霉菌株作為菌劑出發(fā)菌株。在已報(bào)道的真菌降解土壤擬除蟲菊酯農(nóng)藥的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真菌具有比細(xì)菌更好的農(nóng)藥降解潛力，其代謝和生態(tài)潛力更適合生物修復(fù)和廢物處理[36～37]。在一項(xiàng)在土壤中進(jìn)行的生物強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)中，真菌曲霉可顯著降低100 mg/kg氯氰菊酯殘留量及其半衰期[16]。本研究基本達(dá)到類似水平。在前期的土壤盒及盆栽實(shí)驗(yàn)過程中同時(shí)證實(shí)[23～24]，土壤中氯氰菊酯的降解效率與土壤活菌量，土壤溫度高度相關(guān)。滅菌的土壤其農(nóng)藥降解速度顯著低于不經(jīng)滅菌的土壤。土壤修復(fù)過程中溫度過低也會(huì)影響其代謝速率。前期實(shí)驗(yàn)中證實(shí)在其他類型的菊酯類農(nóng)藥中本菌劑的兩個(gè)微生物菌株具有不同的耐受特性，是否可降解其他擬除蟲菊酯類農(nóng)藥有待下一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過在土壤中添加氯氰菊酯并施用菌劑S35，定期監(jiān)測(cè)土壤中殘留氯氰菊酯，功能菌株定殖，土壤真菌微生物多樣性，土壤理化指標(biāo)及種植作物生長(zhǎng)，從而評(píng)估菌劑施用效果及其使用安全性。初始土壤中氯氰菊酯濃度約為85 mg/kg以上，經(jīng)過40 d修復(fù)期后，施用菌劑S35的土壤中氯氰菊酯濃度降至9.25 mg/kg，下降了約89%。對(duì)照組殘留量為48.34 mg/kg，下降了約47%。與對(duì)照相比具有顯著差異(T-test p=0.04)。復(fù)合菌劑S35中的效能微生物SSCL-3,SSCL-5可在土壤中穩(wěn)定的定殖并發(fā)揮降解氯氰菊酯的作用。土壤真菌菌群由于S35菌劑的加入與對(duì)照相比有顯著的下降，S35菌劑的施用可逐步改善污染土壤真菌微生物多樣性。土壤理化指標(biāo)未受到菌劑S35的負(fù)面影響。觀測(cè)作物番茄作物在株高，葉片大小均無差異。通過田間土壤實(shí)驗(yàn)證實(shí)氯氰菊酯降解菌劑S35在土壤中具有較好的降解氯氰菊酯效果，并改善污染土壤真菌微生物多樣性，對(duì)土壤及觀測(cè)作物無負(fù)面影響。