賀婷婷，王旭哲，宋 磊，馬春暉

(石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】油莎豆(Cyperusesculentus)是莎草科莎草屬的一種多年生草本植物。原產(chǎn)于非洲沙漠干旱地區(qū)，具喜陽(yáng)光、耐高溫、抗旱、耐澇等特性，其塊莖富含豐富的蛋白質(zhì)和油脂[1-2]。油莎豆果實(shí)是營(yíng)養(yǎng)豐富的食品原料，油莎豆莖葉是優(yōu)質(zhì)牧草，是一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、綜合利用價(jià)值很高的油、糧、飼多用新型作物。【前人研究進(jìn)展】油莎豆在新疆干旱氣候區(qū)內(nèi)的生產(chǎn)潛力較大，比較適合大規(guī)模推廣種植[3]。目前在新疆南疆沙區(qū)種植油莎豆成功，對(duì)油莎豆莖葉的主要利用方式為直接飼喂牲畜或制作干草，干草容易造成牧草營(yíng)養(yǎng)成分的損耗，且調(diào)制干草田間損失也較大，而青貯能在最大程度保留牧草營(yíng)養(yǎng)成分且彌補(bǔ)冬季飼草的不足。添加乳酸菌能有效地促進(jìn)不同禾本科和豆科植物發(fā)酵，并能長(zhǎng)時(shí)間保存[4-6]。王媛等[7]發(fā)現(xiàn)在苜蓿青貯中添加植物乳桿菌可提高乳酸含量并降低干物質(zhì)損失率。張適[8]在全株玉米青貯中添加乳酸菌發(fā)現(xiàn)可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)含量有所提高，氨態(tài)氮含量下降，纖維素酶能有效降低玉米中的粗纖維含量。李苗苗等[9]在油莎草中添加了3種乳酸菌，油莎草青貯各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍，乳酸菌的添加使青貯的酸香味濃厚，未發(fā)生霉變氧化現(xiàn)象，青貯效果均相對(duì)較好；且在低溫條件下添加植物乳桿菌的油莎草青貯發(fā)酵效果最好。【本研究切入點(diǎn)】油莎豆飼草與常規(guī)苜蓿，及全株玉米青貯比較發(fā)現(xiàn)其中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量較高，油莎豆隨收獲期延長(zhǎng)，其纖維含量逐步增加，影響家畜適口性、采食量和消化率，有效降低其纖維含量成為提高其品質(zhì)的關(guān)鍵因素。【擬解決的關(guān)鍵問題】選擇新疆通過對(duì)南疆沙區(qū)栽培的油莎豆青貯，分別添加植物乳桿菌、纖維素酶及二者混合添加，研究不同添加劑對(duì)油莎豆發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的效果，及其在改善油莎豆青貯品質(zhì)方面的積極作用，分析最適添加劑，為油莎豆在南疆沙區(qū)的青貯利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用中油莎1號(hào)油莎豆草地上莖葉作為青貯材料，選定在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師54團(tuán)開展，其生長(zhǎng)期為5月3日～9月15日，9月15日(豆子成熟期)將油莎草距離地面2～3 cm刈割，切短至2～3 cm，待貯。植物乳桿菌(3×109cfu/g)購(gòu)自新疆天康飼料科技有限公司。纖維素酶(活性為20 000 U/g)購(gòu)自廣西南寧龐博生物工程有限公司。表1

表1 油莎豆草青貯原料營(yíng)養(yǎng)成分

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置3個(gè)微生物添加劑處理，分別是W1(0.2%植物乳桿菌Lactobacillusplantarumas)；W2(0.5%纖維素酶)；W3(0.2%植物乳桿菌+0.5%纖維素酶)，CK(無添加，噴灑等量的無菌去離子水)為對(duì)照組。按相應(yīng)比例配置菌液和酶制劑。用滅菌噴壺將不同添加劑均勻噴灑在粉碎的油莎豆草上，混勻后裝入30 cm×40 cm×0.24 mm透明聚乙烯袋(每袋500 g)，每個(gè)處理組和對(duì)照組30個(gè)重復(fù)。將真空密封好的青貯袋放置在室溫環(huán)境(20±3)℃中發(fā)酵，分別在青貯的第0、7、15、30、45、60 d取樣，測(cè)定青貯pH值、干物質(zhì)(DM)、粗蛋白(CP)、NDF、ADF、WSC、氨態(tài)氮(NH3-N)和相對(duì)飼用價(jià)值(RFV)，各時(shí)間點(diǎn)開袋每個(gè)處理隨機(jī)取3袋，即3次重復(fù)；并于青貯第60 d時(shí)開袋暴露于空氣中，測(cè)定青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

1.2.2 樣品采集

開袋后，取青貯袋核心發(fā)酵部位樣品10 g，放入三角瓶中加90 mL超純水，混勻后置于4℃冰箱24 h。用2層紗布過濾，取得濾液，用于對(duì)青貯pH值和NH3-N含量的測(cè)定。剩余樣品經(jīng)105℃烘干后計(jì)算青貯DM含量，烘干樣品粉碎過篩(0.425 mm篩)后密封備用，用于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分及WSC測(cè)定。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)

1.2.3.1 青貯品質(zhì)

CP測(cè)定采用凱氏定氮法[10]；NDF和ADF的測(cè)定采用范氏(Van Soest)洗滌纖維法[10]；WSC采用蒽酮比色法測(cè)定[11]。pH值用酸度計(jì)(PHS-3C，上海雷磁)測(cè)定；NH3-N采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定[12]，計(jì)算RFV[13]。

RFV=DMI×DDM/1.29.

(1)

DMI=120/NDF.

(2)

DDM=88.9-0.779×ADF.

(3)

式中：DMI為干物質(zhì)隨意采食量(%BW)，DDM為可消化干物質(zhì)含量(%DM)，1.29是飼草DMI×DDM的參數(shù)值。

1.2.3.2 有氧穩(wěn)定性

在發(fā)酵60 d 時(shí)開袋，袋口要使用干凈的紗布裹住，減少微生物與雜質(zhì)污染和青貯水分快速流失。采用多點(diǎn)式溫度記錄儀(i500-E3TW，玉環(huán)智拓儀器科技有限公司)記錄樣品溫度的變化，將多個(gè)探頭分別放在發(fā)酵袋的樣品中心，需在環(huán)境中放置3個(gè)檢測(cè)探頭，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)環(huán)境中溫度變化，溫度記錄儀測(cè)量時(shí)間間隔設(shè)置為10 min，每個(gè)處理放置3個(gè)溫度探頭[14]。當(dāng)樣品溫度高于環(huán)境溫度2℃時(shí)，青貯開始腐敗變質(zhì)，此時(shí)記錄時(shí)間即為有氧穩(wěn)定時(shí)間[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在Excel表中分析處理數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，選用Duncan法處理間的差異比較。運(yùn)用Origin 19.0進(jìn)行繪圖。利用Fzuuy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法對(duì)供試對(duì)象的青貯品質(zhì)及其有氧穩(wěn)定進(jìn)行綜合價(jià)值評(píng)判，其中，與青貯品質(zhì)呈正相關(guān)的指標(biāo)(DM、CP 、WSC、RFV和有氧穩(wěn)定性)采用公式(1)計(jì)算，其余指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)按照公式(2)計(jì)算。

Fij+=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin).

(1)

Fij-=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin).

(2)

式中，F(xiàn)ij為第i個(gè)處理第j個(gè)指標(biāo)的隸屬度；Xij為第i個(gè)處理第j個(gè)指標(biāo)測(cè)定值；Xmax、Xmin為所有研究處理中第j項(xiàng)指標(biāo)的最大值、最小值[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑對(duì)油莎豆青貯品質(zhì)的變化

研究表明，各處理pH值在青貯過程中逐漸下降，添加劑處理組的pH值從青貯開始到青貯結(jié)束始終低于對(duì)照組。且各處理pH值差異顯著(P<0.05)，青貯60 d時(shí)，W3處理的pH值降至最低，為5.97，W1處理次之，為6.07。圖1

圖1 不同添加劑對(duì)油莎豆青貯pH值的動(dòng)態(tài)變化

NH3-N含量在青貯過程中因蛋白質(zhì)的降解會(huì)逐漸增加，在青貯過程中，CK和W2處理的NH3-N含量始終顯著高于其余兩個(gè)處理(P<0.05)；青貯60 d時(shí)CK的NH3-N含量最高(0.22%)，處理組W3最低，為0.16%。圖2

圖2 不同添加劑對(duì)油莎豆青貯NH3-N的動(dòng)態(tài)變化

在青貯0 d時(shí)，CK的DM含量顯著高于W2(P<0.05)的，與其余處理之間無顯著差異(P>0.05)；青貯7～30 d處理W1的DM含量始終顯著高于其他處理(P<0.05)；青貯60 d時(shí)W1和W3處理的DM含量均顯著高于其余兩個(gè)處理(P<0.05)，W2和CK的DM含量差異顯著(P<0.05)，CK的DM含量最低，為28.70%。

CP在青貯過程中緩慢下降，青貯15 d以內(nèi)，CK的CP含量始終顯著低于其余3個(gè)處理(P<0.05)；到青貯30 d時(shí)，CP含量下降速度開始放緩，W1處理在青貯45 d時(shí)顯著高于其余處理(P<0.05)；青貯60 d時(shí)W1和W3處理的CP含量顯著高于其余兩個(gè)處理(P<0.05)W2和CK的CP含量差異顯著(P<0.05)，CK的CP含量最低，為7.13%。

NDF和ADF含量全程變化一致，呈下降趨勢(shì)，青貯0 d各處理NDF和ADF含量差異并不顯著(P>0.05)，除青貯15 d時(shí)CK和W1處理NDF和ADF含量無顯著差異外，CK的NDF和ADF含量始終顯著高于其余處理(P<0.05)，且W3處理的NDF和ADF含量最低，分別為46.23%，27.11%。

青貯過程中WSC含量逐漸降低，青貯前30 d各處理下降幅度均較大，青貯30 d后下降速度有所減緩。青貯前15 d各處理WSC含量迅速下降，在青貯30～45 d時(shí)，處理W1和W3的WSC含量無顯著差異但顯著高于其余處理(P<0.05)；直至青貯60 d時(shí)，W3處理WSC含量最高(5.37%)，且與其他處理出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，W1次之，為4.94%，CK處理WSC含量最低，為4.07%。表2

2.2 添加劑、青貯時(shí)間及其互作對(duì)油莎豆青貯品質(zhì)的影響

研究表明，青貯時(shí)間對(duì)于油莎豆青貯DM、NDF、ADF、CP、WSC、NH3-N和pH值的變化均表現(xiàn)出極顯著影響(P<0.01)，且不同添加劑對(duì)于以上各項(xiàng)指標(biāo)也表現(xiàn)出極顯著影響(P<0.01)。并且青貯時(shí)間與各處理的交互作用對(duì)DM、CP、WSC、NH3-N和pH值的影響極顯著(P<0.01)，而對(duì)NDF和ADF含量產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。表3

表3 不同青貯時(shí)間和添加劑下油莎豆青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)變化

2.3 油莎豆青貯前后營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)對(duì)比

研究表明，在青貯完成后(60 d)各處理與青貯0 d時(shí)的pH值、DM、NDF、ADF、CP、WSC、NH3-N含量均有顯著差異(P<0.05)，且各處理DM、NDF、ADF、CP、WSC含量和pH值均降低，RFV有不同程度的上升。

各處理的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)均與青貯原料的存在顯著差異(P<0.05)，且隨著青貯時(shí)間的推移，各處理的pH值、DM、NDF、ADF、CP、WSC均有不同程度的下降，但RFV值較青貯原料有所升高。青貯完成時(shí)對(duì)照CK的RFV值最低，與其他處理差異顯著(P<0.05)，W3的RFV值最大，而處理W1、W2之間無顯著差異(P>0.05)。表4

表4 青貯前后油莎豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)對(duì)比

2.4 添加劑對(duì)油莎豆青貯有氧穩(wěn)定性的影響

研究表明，CK與W1-W3處理有氧暴露后穩(wěn)定的時(shí)間分別為75、102、88、115 h。各處理的有氧穩(wěn)定時(shí)間均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，其中W3處理有氧穩(wěn)定時(shí)間最長(zhǎng)，顯著高于其余處理(P<0.05)。圖3

圖3 不同添加劑油莎豆青貯暴露于空氣下有氧穩(wěn)定性變化

2.5 不同添加劑處理油莎豆青貯發(fā)酵品質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)

研究表明，綜合評(píng)價(jià)分值越高則青貯品質(zhì)越好，反之越差。發(fā)酵60 d后，不同添加劑處理油莎豆青貯品質(zhì)的綜合排序?yàn)閃3處理>W1處理>W2處理>CK處理。表5

表5 不同添加劑對(duì)油莎豆青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性隸屬函數(shù)

3 討 論

3.1 不同添加劑對(duì)油莎豆青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

乳酸菌能在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)防止青貯飼料質(zhì)量的快速下降[15-16]。乳酸菌的加入，使處理的WSC含量被大量消耗，纖維素酶與植物乳桿菌同時(shí)發(fā)酵和酶解時(shí)，酶解纖維素產(chǎn)生的還原糖被植物乳桿菌發(fā)酵利用[17-18]，促進(jìn)了發(fā)酵進(jìn)程，導(dǎo)致還原糖含量降低，在發(fā)酵前期(0～15 d)W1和W3處理的WSC含量下降速度較快，青貯30 d以后，WSC下降速度放緩，可能是因?yàn)槿樗峋鲩L(zhǎng)到一定程度抑制了有害細(xì)菌的活動(dòng)，減少了WSC損失。CK在發(fā)酵60 d時(shí)的WSC含量較少，其原因是油莎豆自身的乳酸菌數(shù)量較少，發(fā)酵進(jìn)程緩慢，不足以抑制有害微生物的活動(dòng)，導(dǎo)致WSC含量損失較大。

研究發(fā)現(xiàn)添加劑處理組的pH值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；其中，W3處理組的pH值最低，W1次之；油莎豆青貯pH僅降到了5.97，與李苗苗等[9]研究結(jié)果相似，可能與油莎豆莖葉細(xì)長(zhǎng)而強(qiáng)韌，發(fā)酵過程較緩慢有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。無論是單獨(dú)添加植物乳桿菌還是聯(lián)合纖維素酶均能有效降低pH值，而單獨(dú)添加纖維素酶組pH值較高，說明纖維素酶在抑制有害微生物活動(dòng)上效率較低，可將纖維素酶和乳酸菌添加劑同時(shí)使用，在補(bǔ)充青貯飼料有益乳酸菌數(shù)量的同時(shí)，提高其發(fā)酵底物的數(shù)量，可獲得較單一添加更理想的效果。

唐振華等[19]研究發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌能顯著提高青貯DM含量。與試驗(yàn)研究結(jié)果一致，DM會(huì)因發(fā)酵過程糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)等的分解而降低，而植物乳桿菌與纖維素酶的添加能夠有效降低發(fā)酵損失，這與黃媛等[20]研究結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，3種添加劑處理的CP含量顯著高于無添加劑的對(duì)照組，在青貯過程中添加劑的加入可降低飼料的氮素?fù)p失量，CP是評(píng)價(jià)粗飼料品質(zhì)的重要指標(biāo)，青貯飼料中NH3-N含量主要由于微生物對(duì)粗飼料中蛋白質(zhì)和氨基酸進(jìn)行分解和再利用而產(chǎn)生，氨態(tài)氮的含量直接反映著青貯飼料中蛋白質(zhì)水平的降解程度，其比率越大，被充分分解的氨基酸和蛋白質(zhì)數(shù)量就越多，青貯效果也就越差[9]。植物蛋白酶和其他微生物活性在蛋白水解中起重要作用[21-22]，青貯發(fā)酵過程中植物蛋白酶與微生物分解利用粗蛋白，產(chǎn)生多肽、游離氨基酸、氨等物質(zhì)，造成粗蛋白含量的下降，試驗(yàn)的添加劑處理有較低的酸度環(huán)境，抑制了腐敗菌、梭菌等降解，CP的損失較小。研究中，添加劑在一定程度上減少了油莎草青貯粗蛋白含量的損失，氨態(tài)氮的比例較低。與Tao等[23]在紫花苜蓿青貯中使用檸檬酸渣和乳酸菌的研究結(jié)果相吻合。與未添加纖維素酶的CK相比，添加纖維素酶降低了氨態(tài)氮含量，這可能與纖維素酶的抑菌作用有關(guān)。

飼料中NDF和ADF含量的高低與家畜采食量和消化率息息相關(guān)，其含量越低，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)越好[24]。研究中，植物乳桿菌和纖維素酶的添加顯著降低了油莎豆青貯的NDF和ADF含量，這與王亞芳等[25]的研究結(jié)果一致，纖維素酶對(duì)植物細(xì)胞壁的水解作用可以降低纖維含量。而單獨(dú)添加植物乳桿菌和纖維素酶油莎豆青貯NDF和ADF含量無顯著差異，但混合添加植物乳桿菌和纖維素酶油莎豆青貯NDF和ADF含量最低，對(duì)纖維素降解效果較好，與劉夢(mèng)潔[26]研究結(jié)果一致，而江春[27]研究表明，植物乳桿菌發(fā)酵主要消耗含糖類物質(zhì)，對(duì)木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響。這可能與發(fā)酵環(huán)境，發(fā)酵原料有關(guān)。因NDF和ADF含量的降低，RFV值自然升高。研究發(fā)現(xiàn)W3的pH值、NH3-N、NDF和ADF含量最低，DM、CP、WSC、RFV含量最高，原因是植物乳桿菌能夠有效聯(lián)合纖維素酶在發(fā)酵初期增加可利用底物數(shù)量和種類，提高利用WSC效率的同時(shí)抑制有害菌的活動(dòng)，促進(jìn)了青貯的有益發(fā)酵。

3.2 不同添加劑對(duì)油莎豆青貯有氧穩(wěn)定性影響

青貯接觸空氣后呼吸作用增加，好氧腐敗菌開始大量擴(kuò)散和增殖，青貯飼料溫度隨之升高，同時(shí)分解乳酸，使pH值升高，有害菌(如酵母菌、霉菌)活動(dòng)頻繁，從而造成腐敗。有氧穩(wěn)定時(shí)間越短有氧穩(wěn)定性越差，越容易發(fā)生有氧腐敗，試驗(yàn)中添加劑處理的有氧穩(wěn)定性均較對(duì)照組好，W3處理>W1處理>W2處理>CK處理。因?yàn)樘砑又参锶闂U菌和纖維素酶后發(fā)酵底物充足，造成較低pH環(huán)境，抑制了腐敗菌的增殖。同型發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)生的環(huán)二肽、苯乳酸和羥基脂肪酸對(duì)酵母菌和霉菌有明顯的抑制作用[28-29]，有助于有氧穩(wěn)定性的提高；W2組有氧穩(wěn)定時(shí)間延長(zhǎng)主要是由于添加的纖維素酶抑制了腐敗菌的增殖[30]。W3組有氧穩(wěn)定性最高，達(dá)115 h，可能是由于植物乳桿菌和纖維素酶的協(xié)同作用使青貯發(fā)酵效果最佳，較低的pH環(huán)境下，好氧腐敗菌數(shù)量較少不易生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了有氧穩(wěn)定性的時(shí)間。

4 結(jié) 論

不同添加劑對(duì)油莎豆青貯中飼料青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性有顯著影響。添加植物乳桿菌(0.2%)+纖維素酶(0.5%)的處理綜合價(jià)值評(píng)分最高(0.93)。混合添加植物乳桿菌和纖維素酶的油莎豆青貯，開袋后在發(fā)酵品質(zhì)，提高有氧穩(wěn)定性方面均優(yōu)于單一添加植物乳桿菌(0.2%)或單一添加纖維素酶(0.5%)的油莎豆青貯。