鄭 晉，王亞迪，周潤龍，李雪玲，呂軍鴻，胡 鈞

(1.中國科學院上海應用物理研究所，上海 201800；2.中國科學院大學，北京 100049;3.濱州醫(yī)學院藥學院 山東煙臺 264003；4.納米技術及應用國家工程研究中心，上海 201318；5.中國科學院上海高等研究院，上海 201203)

近年來微納米氣泡被應用在水體消毒、有機污染物降解和固體表面凈化等多個領域[1-2]。微納米氣泡處理水體后具有副產(chǎn)物更少、安全性更高等特性，因此，在污水處理方面具有獨特的優(yōu)勢[3]。微納米氣泡的水體凈化能力通常是因為自身崩潰產(chǎn)生自由基或者是增加氣體傳輸[3-5]，但其作用機制尚未完全清楚。

微生物在水生生態(tài)系統(tǒng)的化學循環(huán)中起著重要的作用，它可以分解并轉(zhuǎn)化水體中的有機物或無機物[6]。此外，隨著水質(zhì)的變動和環(huán)境的影響，微生物群落的結(jié)構(gòu)也會發(fā)生顯著變化[7]。因此，微生物可以用來監(jiān)測和評價水體污染[8]。最近，有許多研究發(fā)現(xiàn)了微納米氣泡對水系統(tǒng)中微生物群落的調(diào)節(jié)能力。例如，Nghia等[9]發(fā)現(xiàn)微納米氣泡處理可以通過控制副溶血性弧菌的水平來改善水質(zhì)；Zhang等[10]以枯草芽孢桿菌為模型微生物研究了臭氧微米氣泡技術的消毒性能；Wu等[11]研究表明微納米氣泡可以影響污染水中的微生物群落，從而進一步調(diào)節(jié)水的理化特性并持續(xù)減輕水污染。盡管人們認識到微納米氣泡能夠影響微生物的活性，但是對微納米氣泡處理對水體微生態(tài)(微生物群體的結(jié)構(gòu)、功能及其相互作用關系)的調(diào)節(jié)作用的了解仍然有限。而近年來宏基因組學的發(fā)展，使得其成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的重要工具。

宏基因組學是指利用基因組學策略研究特定環(huán)境樣品中所含所有微生物的遺傳組成和群落功能的方法[12]。這種方法可以避免微生物的分離和培養(yǎng)、進行微生物組成和微生物種群的相互作用研究，并在分子水平上研究其代謝途徑和基因功能[13]。因此，為了進一步探究微納米氣泡凈化水體的作用機制，本研究采用宏基因組學方法研究了微納米氣泡處理前后對池塘水體中微生物群落的組成和功能基因表達的影響。

1 試驗材料和方法

1.1 水域的微納米氣泡處理及水體樣品采集

試驗于2018年秋季(8月28日—9月6日)在中國上海應用物理所內(nèi)池塘進行，水溫測量為29.8～30.5 ℃，同期平均氣溫為28.0～34.0 ℃。利用微納米氣泡曝氣系統(tǒng)(圖1)向池塘水體中通入微納米氣泡，微納米氣泡曝氣系統(tǒng)由水箱、離心泵、控制閥、壓力計、空氣流量計和連接管道組成。在連續(xù)通過微納米氣泡18 d后(水質(zhì)檢測結(jié)果顯示有明顯改善)，分別在曝氣點附近的3個位置取樣，共取9個水體樣本，以遠離曝氣點的池塘邊緣樣品做對照。采樣瓶浸入水面下20～50 cm，每次取水樣1 L，及時使用水體抽濾機抽濾，回收濾膜上的覆蓋物抽提其總DNA，并對其進行質(zhì)量檢測評估。DNA樣本檢測合格后，將其隨機片段化并篩選合適大小的插入片段進行文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫質(zhì)檢合格并精確定量后，上機進行Illumina HiSeq宏基因組測序。

圖1 微納米氣泡調(diào)節(jié)池塘水體中微生物群落示意圖Fig.1 Scheme of Micro-Nano Bubbles for Effecting the Microbiome in Pond Water

1.2 數(shù)據(jù)分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)進行過濾處理，去除污染及低質(zhì)量數(shù)據(jù)、清除污染序列等，得到有效數(shù)據(jù)(clean data)，以保證后續(xù)信息分析結(jié)果的準確可靠。從各樣本質(zhì)控后的有效數(shù)據(jù)出發(fā)，進行數(shù)據(jù)拼接組裝，并統(tǒng)計組裝結(jié)果。對重疊群(contigs)進行基因預測并去冗余，構(gòu)建基因目錄(gene catalogue)，然后獲得各基因在各樣本中的豐度信息。隨后和MicroNR庫進行比對，獲得物種注釋信息，并結(jié)合基因豐度表，獲得不同分類層級的物種豐度表。最后進行代謝通路(KEGG)和同源基因簇(eggNOG)的功能注釋和豐度分析，獲得不同層級的功能豐度表。

2 結(jié)果和討論

2.1 測序結(jié)果和處理

樣品測序后的原始數(shù)據(jù)中重復序列比例、GC含量(DNA雙鏈中GC堿基對所占的數(shù)量百分比)、讀長(reads)平均長度以及讀長數(shù)統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。為確保所有樣品的測序質(zhì)量，本研究去除了模糊堿基(N)數(shù)超過閾值的讀長。由于樣本來源于自然界水體，不需要去除宿主序列。測序采用的是雙端測序，每個樣品得到2組讀長數(shù)據(jù)，經(jīng)篩選后第1 d采集的水體樣品(D1)的2個方向均保留了32 013 061個高質(zhì)量的讀長，平均長度分別為147 bp和138 bp；第18 d采集的水體樣品(D18)的2個方向均保留了35 873 340個高質(zhì)量的讀長，平均長度均為146 bp(表2)。通過過濾后的序列質(zhì)量分布圖可以看出，絕大多數(shù)的序列堿基質(zhì)量都屬于高質(zhì)量部分。將通過質(zhì)控的序列數(shù)據(jù)進行宏基因組組裝以及開放閱讀框架(ORF)預測操作，樣品D1、D18分別共得到716 311、386 383個基因數(shù)目。將所有樣品中預測出來的基因進行聚類(95%一致性、90%覆蓋度)，每個類取最長的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集，所有的樣品共得到962 170個非冗余基因。使用各樣本有效數(shù)據(jù)比對到微生物參照標記基因(reference marker gene)數(shù)據(jù)庫并利用mataphlan2獲得各個樣本在不同分類水平物種豐度信息。由于遠離曝氣點的對照點處理前后沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化，下文只報告曝氣點附近的樣品在處理后微生態(tài)的變化情況。

表1 不同樣品中測序結(jié)果Tab.1 Sequencing Results in Different Samples

表2 質(zhì)檢后宏基因組組裝以及開放閱讀框架預測結(jié)果Tab.2 Metagenomic Assembly and ORFs Prediction after Sequencing Data Filtering

2.2 水體中微生物群落的組成與多樣性

為了剖析樣品中微生物群落的組成的變化，繪制了Venn圖[圖2(a)]，結(jié)果顯示在種水平上由第1 d的46種減少到第18 d的30種，其中22種沒有發(fā)生改變。此外，對門水平上相對豐度變化分析發(fā)現(xiàn)，2個樣品的前3個優(yōu)勢菌門均是藍藻門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)[圖2(b)]。然而，第一優(yōu)勢門在第1 d為藍藻門(其豐度為72.8%)，在第18 d則變?yōu)榉啪€菌門。經(jīng)過微納米氣泡處理后，藍藻門和變形菌門豐度均有顯著下降，其降低率在50%左右；而放線菌門豐度(phylum abundance)則顯著提高，由14.84%(第1 d)提高到57.61%(第18 d)[圖2(b)～圖2(c)]。

為了反映各樣本物種多樣性差異，計算了各樣本中基于物種的香農(nóng)(Shannon)指數(shù)。結(jié)果表明，經(jīng)過微納米氣泡處理后，水體中的香農(nóng)指數(shù)由第1 d的3.24下降到第18 d的3.07，而對照點樣品沒有變化。這也表明經(jīng)過微納米氣泡處理會在一定程度上降低水體中微生物群落的物種多樣性。

研究發(fā)現(xiàn)微納米氣泡的氣穴現(xiàn)象能夠使得大腸桿菌增殖效率在3 min內(nèi)降低75%[14]。此外，也有幾項研究報道了類似的微納米氣泡技術產(chǎn)生的水動力空化效應對水消毒的有效性[14-15]，其中破潰的微納米氣泡引起的沖擊波被認為是大腸桿菌失活的主要原因。藍藻和變形菌均是革蘭氏染色陰性菌，細胞壁較為脆弱；而放線菌是革蘭氏陽性菌，細胞壁較為堅韌。因此，推測微納米氣泡破裂產(chǎn)生的氣穴效應使得藍藻和變形菌相較于放線菌更容易失活消亡，從而造成微納米氣泡處理前后水中菌落的組成差異，造成水體中菌體群落多樣性的降低。

藍藻群落的多樣性和豐度會對淡水水質(zhì)的變化做出反應，并可在環(huán)境研究中用于河流系統(tǒng)的水體質(zhì)量評估[16]。此外，由于藍藻會產(chǎn)生有腥臭味的“水華”(又稱“藻華”)現(xiàn)象，還會分泌毒素令飲用水源的安全性受到威脅，也會蓋住水池令魚類缺氧死亡，進一步造成水體污染[17-19]。在本研究中，藍藻豐度的降低也證明了微納米氣泡有助于水質(zhì)的恢復[圖2(b)～圖2(c)]。據(jù)報道，變形菌具有巨大的代謝多樣性和硫氧化、硝酸鹽還原和反硝化的能力，因此，在水生生態(tài)系統(tǒng)中的氮、硫代謝中起著重要作用[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，微納米氣泡處理后變形菌的豐度顯著降低，可能意味著池塘水體系統(tǒng)的氮硫循環(huán)水平降低?？傊⒓{米氣泡通過影響池塘水中微生物群落的組成和多樣性來調(diào)節(jié)水體生態(tài)系統(tǒng)。

注：X軸代表門水平的相對豐度變化，右側(cè)顯示增加的微生物，左側(cè)顯示減少的微生物；門豐度變化率=[(A18-A1)/A1]×100%，“A1”指第1 d微生物的門豐度，“A18”指第18 d微生物的門豐度圖2 微納米氣泡處理后池塘水體微生物群落的組成演變Fig.2 Composition Evolution of Microbial Communities in Pond Water Body after Micro-Nano Bubble Treatment

2.3 功能基因及代謝通路豐度差異

使用BlastX軟件，將拼接得到的所有核苷酸序列分別與String、Swissprot和KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得相應的注釋信息。GO二級注釋結(jié)果(圖3)結(jié)果表明，經(jīng)過微納米氣泡處理后微生物群落中運貨受體活性(cargo receptor activity)基因占比明顯降低，營養(yǎng)庫活性(nutrient reservoir activity)基因活性幾乎消失，而其他的功能基因占比沒有明顯差異。此外，還選取了KEGG注釋中包含基因或轉(zhuǎn)錄本數(shù)目最多的前20個通路進行分析(圖4)，可以看出ABC轉(zhuǎn)運器(ABC transporters)通路和雙組分系統(tǒng)(two-component system)通路在D18樣品中相較于D1樣品中活躍度明顯降低，而嘌呤代謝(Purine metabolism)通路在D18樣品中更為活躍。

注：橫坐標表示GO的二級分類術語，左邊縱坐標表示包含在該二級分類中的基因占總數(shù)的百分比，依據(jù)不同功能將基因分為3組：生物學過程、細胞組成及分子功能圖3 微納米氣泡處理前后池塘水體中微生物基因功能的GO注釋結(jié)果統(tǒng)計Fig.3 Gene Abundance of Microbial Communities in Pond Water before and after Micro-Nano Bubble Treatment Based on GO Annotation

注：其中包含基因數(shù)目最多的前20個通路；從左至右按照所包含的基因數(shù)目從高到低依次排列，柱子越高表明該生物學通路在樣本中越活躍圖4 微納米氣泡處理前后池塘水體中微生物基因功能的KEGG注釋結(jié)果Fig.4 Gene Abundance of Microbial Communities in Pond Water before and after Micro-Nano Bubble Treatment Based on KEGG Annotation

運貨受體活性基因具有與貨物(cargo)特異性結(jié)合以將其遞送至運輸囊泡的功能。營養(yǎng)庫活性基因水平下降意味著儲存營養(yǎng)基質(zhì)功能降低，反映了水體中有機成分的減少。ABC轉(zhuǎn)運器是一類在原核及真核生物中都廣泛分布的膜蛋白超家族，其利用ATP水解產(chǎn)生的能量將底物進行跨膜運輸，從而參與營養(yǎng)攝入、細胞解毒、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、信號轉(zhuǎn)導等多種重要的生理過程。雙組分系統(tǒng)是存在于細菌內(nèi)的一種信號傳導系統(tǒng)，是細菌適應選擇壓力的一種機制。嘌呤在生物體的能量供應、代謝調(diào)節(jié)及組成輔酶等方面起著十分重要的作用。上述功能基因及代謝通路豐度變化結(jié)果顯示，微細氣泡處理影響細胞跨膜運輸、信號傳導及嘌呤代謝等功能。

3 結(jié)論

(1)在本研究中，利用宏基因組學方法分析了微納米氣泡在池塘水處理過程中對微生物群落的生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)，納米氣泡處理可以降低變形菌和藍藻等微生物的相對豐度，并促進放線菌門等微生物的生長，改變了水體微生物種群的多樣性，進而調(diào)節(jié)了池塘水體微生物菌落的平衡。

(2)變形菌門微生物對于水體的氮、硫代謝發(fā)揮重要作用，而放線菌門微生物在富含有機質(zhì)的水體中比較活躍，因此，微納米氣泡處理后，水體中變形菌門和放線菌門微生物豐度的演變可能意味著水體從氮、硫循環(huán)旺盛的體系演化為有機質(zhì)代謝旺盛的體系。此外，水體中藍藻豐度的降低進一步表明微納米氣泡促進了水體的修復。

(3)納米氣泡處理可以調(diào)節(jié)池塘水體中微生物運貨受體活性基因和營養(yǎng)庫活性基因占比以及ABC轉(zhuǎn)運器、雙組分系統(tǒng)和嘌呤代謝等代謝通路，進而調(diào)整池塘微生物群落的生物學功能，最終有利于水質(zhì)的優(yōu)化。

(4)本研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)水體中微生物群落結(jié)構(gòu)及基因功能的平衡、維持其穩(wěn)定性可能是微納米氣泡在水處理中的潛在作用機制，為理解微納米氣泡效應提供了新的視角。