劉龍龍，羅 鳴，陳傅曉，劉金葉

（1.海南熱帶海洋學(xué)院，熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，三亞 572022；2.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海口 571126）

鹽度是影響魚類生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的重要環(huán)境因子［1］。廣鹽性硬骨魚可以通過(guò)有效的滲透壓調(diào)節(jié)維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，以適應(yīng)生活環(huán)境中鹽度的改變［2］。魚類的滲透壓調(diào)節(jié)作用是由一系列器官協(xié)同完成的，包括鰓、腸和腎［3］。鰓是魚類主要的滲透壓調(diào)節(jié)器官，位于鰓上皮富含線粒體的泌氯細(xì)胞是負(fù)責(zé)離子吸收和分泌的主要場(chǎng)所［4］。Na+／K+-ATPase是一種跨膜蛋白，是維持Na+和K+梯度的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)酶，在離子交換和滲透壓調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用［5］。Na+／K+-ATPase由兩個(gè)亞基（α和β）組成，它們非共價(jià)配對(duì)形成αβ-異源二聚體。在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)了3種α亞型（α1、α2和α3）和4種β亞型（β1、β2、β3、β4）［6-7］，Na+／K+-ATPase活性不僅受物種不同和棲息地環(huán)境差異的影響，還受到α、β亞型組成比例轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)的影響［8］，關(guān)于不同的α及β亞型對(duì)Na+／K+-ATPase活性的影響在不同硬骨魚研究中存在爭(zhēng)議［3］。

棕點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）又稱為褐點(diǎn)石斑魚，俗稱老虎斑，隸屬硬骨魚綱（Osteichthyes），鱸形目（Perciformes），鱸亞目（Percoidei），鮨 科（Serranidae），石斑魚亞科（Epinephelinae），石斑魚屬。由于其肉味鮮美、生長(zhǎng)快、市場(chǎng)潛力大，養(yǎng)殖前景較好，近年來(lái)已經(jīng)成為福建、廣東、海南等地海水養(yǎng)殖的重要名優(yōu)品種。棕點(diǎn)石斑魚對(duì)鹽度耐受范圍大，在鹽度11‰～41‰水域都能生存，因此在不同鹽度水域都開展了養(yǎng)殖［9］。對(duì)棕點(diǎn)石斑魚的現(xiàn)有研究主要集中在生長(zhǎng)繁育［10］、飼料營(yíng)養(yǎng)［11-14］、養(yǎng)殖技術(shù)［15-16］、病害防治［17-18］等方面，關(guān)于鹽度對(duì)棕點(diǎn)石斑魚影響的研究相對(duì)較少，主要涉及鹽度的耐受性［9］、在鹽度22‰～28‰范圍內(nèi)生長(zhǎng)情況［19］及在不同鹽度下血清皮質(zhì)醇水平及存活率［20］，關(guān)于低鹽環(huán)境下棕點(diǎn)石斑魚滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定棕點(diǎn)石斑魚在低鹽條件下血清滲透壓及離子水平、鰓Na+／K+-ATPase活性及相關(guān)基因表達(dá)、鰓組織學(xué)、耗氧率的影響，探討其在低鹽環(huán)境下的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為棕點(diǎn)石斑魚在不同鹽度水體中養(yǎng)殖研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用棕點(diǎn)石斑魚幼魚在海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院瓊?？蒲谢胤趸B(yǎng)殖，試驗(yàn)魚幼魚體質(zhì)量（56.8±3.5）g。暫養(yǎng)在體積為800 L的玻璃鋼圓筒內(nèi)，養(yǎng)殖期間水溫（27.5±0.5）℃、養(yǎng)殖水體pH（8.0±0.1）、鹽度（32±1）‰，實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)充氣，每天投喂人工配合飼料1次，投料1 h后吸凈養(yǎng)殖容器底部殘餌并接近全量換水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在瓊?？蒲谢厥覂?nèi)進(jìn)行，養(yǎng)殖容器與暫養(yǎng)期間一致，不同處理鹽度海水采用過(guò)濾后自來(lái)水稀釋自然海水配制而成。實(shí)驗(yàn)設(shè)置鹽度6‰、12‰、24‰、32‰ 4個(gè)梯度，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾魚，實(shí)驗(yàn)時(shí)將棕點(diǎn)石斑魚從自然海水（鹽度32‰）直接轉(zhuǎn)移到調(diào)整好的鹽度為6‰、12‰、24‰、32‰（對(duì)照）圓桶中。根據(jù)前期研究，與棕點(diǎn)石斑魚幼魚適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境鹽度變化相關(guān)的組織結(jié)構(gòu)、生化和生理反應(yīng)預(yù)計(jì)在遷移到新的鹽度條件后的10 d內(nèi)已經(jīng)發(fā)生［21-22］，故實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行10 d。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定耗氧率。每組隨機(jī)抽取3尾魚，用丁香酚麻醉，尾靜脈取血，4℃下靜置分層后，再經(jīng)冷凍離心機(jī)（4℃）6 000 r·min-1離心20 min，取無(wú)溶血血清用于測(cè)量血清滲透壓及離子濃度；同時(shí)取各鹽度組幼魚左側(cè)第二鰓弓上的0.1 g鰓絲經(jīng)生理鹽水潤(rùn)洗后置于2 mL凍存管經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，用于測(cè)定鰓 Na+／K+-ATPase活性及NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3基因的表達(dá)。另取鹽度6‰、12‰、32‰組幼魚右側(cè)第二鰓弓中間部位腮絲用中性組織固定液（4%多聚甲醛，PB緩沖液）固定，用于鰓絲組織切片觀察；取魚體軀干部肌肉組織，剔除魚骨、魚皮，用紙巾擦凈肌肉上的水和血，用于測(cè)量魚體肌肉含水量。

1.2.2 海水和魚血清滲透壓及離子濃度

實(shí)驗(yàn)魚血清和海水滲透壓采用全自動(dòng)組織滲透壓儀（Osmo210，德國(guó)）測(cè)定，血清Na+、Cl-、K+離子濃度采用全自動(dòng)生化分析儀（Chemray 240，中國(guó)）測(cè)定。

1.2.3 肌肉含水量的測(cè)定

肌肉含水量的測(cè)定先稱取肌肉組織鮮重，再通過(guò)鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9076A，中國(guó)）100℃下連續(xù)烘烤48 h后稱取肌肉組織干重，計(jì)算獲得。

1.2.4 鰓Na+／K+-ATPase活性測(cè)定

鰓Na+／K+-ATPase活性采用南京建成生物工程研究所超微量Na+／K+-ATPase試劑盒測(cè)定。稱取實(shí)驗(yàn)魚鰓絲樣品0.1 g加入9倍體積生理鹽水，冰浴條件下勻漿，4℃離心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)定鰓 Na+／K+-ATPase活 性（超微量 Na+／K+-ATPase試劑盒，南京建成）。

1.2.5 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

用總RNA抽提試劑盒（Invitrogen，美國(guó)）根據(jù)Trizol法從鰓組織提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品核酸質(zhì)量，用1.5%變性瓊脂糖膠測(cè)定RNA質(zhì)量和產(chǎn)率。用無(wú)RNA脫氧核糖核酸酶處理RNA（Takara，日本），逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈作為基因表達(dá)分析模板（Takara，日本）。以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行棕點(diǎn)石斑魚鰓組織NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3基因的實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定（ABI StepOne PULS，美國(guó)），擴(kuò)增體系體積為20 μL，其中包含10 μL的SybrGreen qPCR Master Mix、0.8μL引物（10 μmol· L-1）、7.2μL的無(wú)核酸酶水和2μL的cDNA模板。實(shí)時(shí)定量RT-PCR的反應(yīng)程序如下：95℃3 min，然后95℃5 s，60℃30 s，共45個(gè)循環(huán)，在最后一個(gè)PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)制作溶解曲線，確認(rèn)產(chǎn)物的特異性。棕點(diǎn)石斑魚NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3和內(nèi)參β-actin引物根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并驗(yàn)證（表1）。用5個(gè)不同稀釋度（每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)）的cDNA樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)E＝10（-1／slope）-1分析擴(kuò)增效率，確保擴(kuò)增效率在0.9～1.1之間。獲得CT值后代入2-ΔΔCT公式計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3和內(nèi)參β-actin基因qPCR引物序列Tab.1 Primers of NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3 and internal reference geneβ-actin in quantitative PCR

1.2.6 泌氯細(xì)胞數(shù)量和長(zhǎng)徑

將用中性組織固定液固定的鰓組織樣品進(jìn)行酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片（厚度4μm）、H.E染色、掃描（Pannoramic MIDI掃描儀，匈牙利）。用CaseViewer圖像分析軟件（3DHISTECH Ltd.）分別統(tǒng)計(jì)鹽度6‰、12‰、32‰組試驗(yàn)魚泌氯細(xì)胞數(shù)量和長(zhǎng)徑。泌氯細(xì)胞的計(jì)數(shù)參考UCHIDA［23］及趙峰等［24］方法，隨機(jī)選取鰓絲（包含鰓小葉基部）和鰓小葉各6個(gè)部位，統(tǒng)計(jì)每100 μm鰓絲或鰓小葉上的泌氯細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.7 耗氧率的測(cè)定

測(cè)定前將魚禁食12 h以上確保魚活動(dòng)減少，實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組用于計(jì)算不放魚時(shí)的耗氧率變化值，將各圓桶水面用透明塑料薄膜覆蓋封閉，分別測(cè)定初始和3 h后溶解氧濃度（In-Situ SMARTROLL MP便攜式多參數(shù)監(jiān)測(cè)儀，美國(guó)），耗氧率的計(jì)算公式為：RO＝（Oi-Ot-Ob）V／（m·t），式中，RO為耗氧率［mg·g-1·h-1］；Oi、Ot分別為初始、t時(shí)溶解氧含量（mg·L-1）；Ob為空白組溶解氧含量變化值（mg·L-1）；V是實(shí)驗(yàn)水體體積（L）；m是魚體質(zhì)量（g）；t為測(cè)量值之間的時(shí)間間隔（h）。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）形式表示。統(tǒng)計(jì)前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差同質(zhì)性檢驗(yàn)，用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA）和Duncan多重比較進(jìn)行檢測(cè)，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚血清滲透壓、血清離子濃度及肌肉含水量的比較

經(jīng)過(guò)10 d的低鹽適應(yīng)，各鹽度組棕點(diǎn)石斑魚血清滲透壓、血清Na+、Cl-、K+濃度及肌肉含水量如圖1所示。隨鹽度的降低，棕點(diǎn)石斑魚血清滲透壓呈降低趨勢(shì)，其中鹽度6‰組血清滲透壓顯著低于其他組（P＜0.05）；血清Na+和K+濃度隨鹽度降低有降低趨勢(shì)，其中鹽度6‰組Na+、K+濃度顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；各組間血清Cl-濃度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；肌肉含水量隨鹽度的降低有上升趨勢(shì)，但各組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚幼魚血清滲透壓（A）、血清Na+、Cl-濃度（B）、血清K+濃度（C）、肌肉含水量（D）Fig.1 Serum osmolality（A），serum Na+and Cl-（B），serum K+（C），muscle water content（D）of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

線性回歸分析表明（圖2），血清滲透壓與環(huán)境水滲透壓呈線性相關(guān)（R2＝0.82，P＜0.05），回歸直線與等滲線交點(diǎn)為等滲點(diǎn)滲透壓343.73 mOsm·kg-1，所對(duì)應(yīng)海水鹽度為12.59‰。

圖2 棕點(diǎn)石斑魚幼魚在不同鹽度下血清滲透壓和環(huán)境滲透壓的關(guān)系Fig.2 Relationship between ambient water osmolality and serum osmolality of juvenile Epinephelus fuscoguttatus

2.2 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚的Na+／K+-ATPase活性

經(jīng)10 d低鹽適應(yīng)，棕點(diǎn)石斑魚鰓Na+／K+-ATPase活性如圖3所示，隨著鹽度的降低，鰓Na+／K+-ATPase活性先降低后上升，其中鹽度12‰組活性最低，顯著低于其他組（P＜0.05）。

圖3 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚幼魚鰓Na+／K+-ATPase活性Fig.3 Gill Na+／K+-ATPase activity of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

2.3 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚的NKA基因表達(dá)

鹽度對(duì)鰓NKA基因表達(dá)影響如圖4所示，經(jīng)過(guò)10 d低鹽的適應(yīng)，隨鹽度的降低NKAα1基因表達(dá)量無(wú)顯著變化（P＞0.05）。NKAβ1b基因表達(dá)量隨鹽度的降低先降低后升高；鹽度12‰組基因表達(dá)量最低，顯著低于其他鹽度組（P＜0.05）；鹽度6‰組顯著低于24‰、32‰組（P＜0.05）。NKAα2a基因表達(dá)量隨鹽度的降低先升高后降低，鹽度12‰基因表達(dá)量最高且顯著高于其他鹽度組（P＜0.05）；鹽度6‰、24‰與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。NKAα3基因表達(dá)量隨鹽度的降低而降低，其中鹽度6‰組最低且顯著低于其他鹽度組（P＜0.05），鹽度32‰組最高且顯著高于其他組（P＜0.05）。

圖4 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚幼魚鰓NKAα1、NKAβ1b、NKAα2a、NKAα3基因表達(dá)Fig.4 Expressions of NKAα1，NKAβ1b，NKAα2a，NKAα3 genes in gill of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

2.4 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚泌氯細(xì)胞數(shù)量與長(zhǎng)徑

如圖5所示，各鹽度組棕點(diǎn)石斑魚泌氯細(xì)胞在鰓絲及鰓小葉均有分布且主要分布在鰓絲及鰓小葉基部。不同鹽度組鰓組織泌氯細(xì)胞數(shù)量與長(zhǎng)徑如圖6所示，隨鹽度的降低，鰓絲泌氯細(xì)胞數(shù)量先減少后增加，在鹽度12‰時(shí)最少，且顯著低于鹽度6‰、32‰組（P＜0.05）；鰓小葉泌氯細(xì)胞數(shù)量在鹽度32‰時(shí)最多且顯著高于鹽度6‰組、12‰組（P＜0.05）。各鹽度組鰓絲、鰓小葉泌氯細(xì)胞長(zhǎng)徑無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖5 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚幼魚鰓泌氯細(xì)胞（箭頭）Fig.5 Gill chloride cells（arrows）of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

圖6 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚幼魚鰓絲、鰓小葉泌氯細(xì)胞數(shù)量及長(zhǎng)徑Fig.6 Number and diameter of chloride cells in filaments and lamellae of juvenile Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

2.5 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚的耗氧率

不同鹽度組棕點(diǎn)石斑魚的耗氧率如圖7所示。經(jīng)過(guò)10 d的低鹽馴化，鹽度的降低導(dǎo)致棕點(diǎn)石斑魚耗氧率呈上升趨勢(shì)，在鹽度32‰時(shí)最低，且顯著低于6‰組、24‰組（P＜0.05）；鹽度6‰組、12‰組、24‰組之間耗氧率無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖7 不同鹽度下棕點(diǎn)石斑魚的耗氧率Fig.7 Oxygen consumption rate of Epinephelus fuscoguttatus at different salinities

3 討論

3.1 鹽度對(duì)棕點(diǎn)石斑魚血清滲透壓調(diào)節(jié)的影響

當(dāng)機(jī)體處于低滲或高滲環(huán)境時(shí)，血漿內(nèi)環(huán)境與外界水環(huán)境之間存在一定的滲透壓差，機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)離子平衡來(lái)維持體內(nèi)滲透壓的穩(wěn)定［25］。不同廣鹽性硬骨魚的肌肉含水量通常在環(huán)境鹽度的耐受范圍內(nèi)發(fā)生較小變化，黑鯛（Mylio macrocephalus）從海水轉(zhuǎn)移到淡水后肌肉含水量增加［26］，青鳉（Oryzias latipes）從淡水轉(zhuǎn)移到海水后肌肉含水量暫時(shí)下降，并在適應(yīng)7 d后恢復(fù)［27］。本研究中棕點(diǎn)石斑魚經(jīng)過(guò)10 d的適應(yīng)，各鹽度組肌肉含水量并無(wú)顯著性差異，這表明在6‰～32‰鹽度條件下棕點(diǎn)石斑魚能夠?qū)w內(nèi)離子環(huán)境進(jìn)行有效的調(diào)控。

血漿Cl-濃度會(huì)影響血漿的酸堿平衡，在低鹽水體中，當(dāng)血漿Na+的降低速度高于血漿Cl-的降低速度時(shí)，有可能導(dǎo)致魚類發(fā)生短暫的代謝性酸中毒［28］，本研究中棕點(diǎn)石斑魚從鹽度32‰自然海水轉(zhuǎn)移到鹽度32‰、24‰、12‰、6‰環(huán)境中適應(yīng)10 d后，鹽度6‰組魚血清Cl-濃度并沒(méi)有隨血清Na+、K+濃度的降低而降低，這預(yù)示著在該鹽度下棕點(diǎn)石斑魚可能會(huì)發(fā)生輕微的代謝性酸中毒。環(huán)境鹽度的變化不僅會(huì)影響魚類的體內(nèi)離子平衡，并可能影響魚類的生理狀態(tài)，如游泳、食欲等［29］，在本研究中鹽度6‰組棕點(diǎn)石斑魚攝食幾乎停止，活動(dòng)量降低，這表明盡管在10 d時(shí)間內(nèi)棕點(diǎn)石斑魚能應(yīng)對(duì)鹽度6‰的水環(huán)境變化，但在該鹽度環(huán)境中已經(jīng)受到了低鹽脅迫影響，可以預(yù)測(cè)，如果棕點(diǎn)石斑魚長(zhǎng)期暴露于鹽度6‰下可能會(huì)對(duì)血清滲透壓和離子平衡產(chǎn)生更嚴(yán)重的影響。

狹鹽性海洋硬骨魚的血漿滲透壓為370～480 mOsm·kg-1，而狹鹽性淡水硬骨魚的血漿滲透壓為260～330 mOsm·kg-1［30］，本研究中棕點(diǎn)石斑魚血清滲透壓隨鹽度的降低而降低，其滲透壓變化范圍介于兩類之間，這表明棕點(diǎn)石斑魚具有廣鹽性，經(jīng)回歸分析估算棕點(diǎn)石斑魚等滲點(diǎn)343.73 mOsm· kg-1，所對(duì)應(yīng)海水鹽度為12.59‰，這與大部分廣鹽性硬骨魚類等滲點(diǎn)相似［21］。

3.2 鹽度對(duì)棕點(diǎn)石斑魚鰓Na+／K+-ATPase活性及耗氧率的影響

鰓Na+／K+-ATPase是硬骨魚類適應(yīng)外界鹽度變化、進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，鰓Na+／K+-ATPase活性能反映機(jī)體對(duì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的能量需求［31］。不同魚類鰓Na+／K+-ATPase活性與鹽度變化的關(guān)系不同，主要有兩種類型：1）一種是溯河性魚類存在的線性關(guān)系，即隨鹽度的升高Na+／K+-ATPase活性隨著增加［23］；2）多數(shù)廣鹽性魚類存在“U”型關(guān)系，即鰓Na+／K+-ATPase在中等鹽度下活性較低，在低鹽和高鹽下活性較高。在本研究中，棕點(diǎn)石斑魚經(jīng)過(guò)10 d的適應(yīng)，隨鹽度的降低，Na+／K+-ATPase酶活性先降低后上升，符合“U”型變化，且在等滲點(diǎn)附近時(shí)具有較低的酶活性，這與軍曹魚（Rachycentron canadum）［32］、褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）［33］、珍珠龍膽石斑魚（E.lanceolatus×E.fuscoguttatus）［22］等相似，這是由于在等滲點(diǎn)環(huán)境細(xì)胞外液和環(huán)境水之間的離子梯度最小，保持離子平衡所需能量更少。

鰓Na+／K+-ATPase活性受基因表達(dá)變化的調(diào)控，許多研究表明，環(huán)境鹽度變化不僅影響魚鰓Na+／K+-ATPase活性，而且也影響NKA基因表達(dá)和蛋白的合成［34］。Na+／K+-ATPase具有復(fù)雜的分子異質(zhì)性，有α和β類多種亞型表達(dá)。經(jīng)10 d的低鹽馴化，4種NKA亞型（α1，β1b，α2a和α3）中有3種亞基對(duì)低鹽環(huán)境響應(yīng)存在差異：NKAβ1b基因表達(dá)量隨鹽度的降低先降低后升高；NKAα2a基因表達(dá)量隨鹽度的降低先升高后降低；NKAα3基因表達(dá)量隨鹽度的降低而降低，這表明不同鹽度環(huán)境下Na+／K+-ATPase分子結(jié)構(gòu)存在差異，并可能在不同的鹽度環(huán)境中發(fā)揮特定的作用［7］。有研究認(rèn)為，NKAα1是影響Na+／K+-ATPase活性關(guān)鍵基因，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間適應(yīng)后NKAα1基因表達(dá)量的變化與Na+／K+-ATPase活性變化一致［35-36］。也有研究表明，NKAβ基因表達(dá)量變化與Na+／K+-ATPase活性變化相一致［37］。在本研究中，各鹽度組NKAα1基因表達(dá)量無(wú)明顯變化，不同鹽度Na+／K+-ATPase活性變化與NKAβ1b基因表達(dá)量變化趨勢(shì)相似。有研究認(rèn)為，魚鰓表達(dá)多種α和β亞型，多亞型異構(gòu)體可能會(huì)改變以適應(yīng)鹽度轉(zhuǎn)移過(guò)程中外界水環(huán)境離子的變化［7］，并且β糖基化位點(diǎn)的突變可以改變酶的活性［38］，后續(xù)研究將關(guān)注此方面的內(nèi)容。

鰓重構(gòu)是鰓組織的形態(tài)學(xué)變化，由細(xì)胞活動(dòng)所致，當(dāng)硬骨魚面臨外環(huán)境鹽度變化時(shí)經(jīng)常發(fā)生，其典型特征就是細(xì)胞數(shù)量或大小發(fā)生變化［39-40］。魚類在適應(yīng)鹽度變化過(guò)程中會(huì)引起泌氯細(xì)胞的改變或重塑，如中華鱘（Acipenser sinensis）幼魚在半咸水條件下與在淡水條件下相比，鰓上皮泌氯細(xì)胞數(shù)量和大小均顯著增加［24］；珍珠龍膽石斑魚隨鹽度的降低，泌氯細(xì)胞長(zhǎng)徑變小，數(shù)量也略有減少［41］。這些改變對(duì)魚類適應(yīng)外界環(huán)境鹽度變化有重要意義［42-43］，鰓Na+／K+-ATPase活性的變化可能受泌氯細(xì)胞數(shù)量或大小的變化影響而不僅是基因表達(dá)的變化［7］。在本研究中鰓泌氯細(xì)胞數(shù)量隨鹽度的降低先減少后增加，鰓小葉泌氯細(xì)胞在鹽度32‰時(shí)最多，而各鹽度組泌氯細(xì)胞的長(zhǎng)徑并無(wú)顯著差異，這表明泌氯細(xì)胞的數(shù)量可能是影響鰓Na+／K+-ATPase活性變化的重要因素。

耗氧率反映了魚類在靜息狀態(tài)所消耗的氧氣，包括用于維持離子和滲透壓調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和基本的心肺功能等的消耗量［44］。滲透壓調(diào)節(jié)是一個(gè)耗能的過(guò)程，能量動(dòng)態(tài)變化與平衡能準(zhǔn)確反映魚類對(duì)不同環(huán)境條件的適應(yīng)性［45］，大部分魚類總能量預(yù)算的20%～50%用于滲透壓調(diào)節(jié)［46］。許多研究通過(guò)不同鹽度下耗氧率來(lái)估算離子和滲透壓調(diào)節(jié)成本［47］，但并沒(méi)有形成共識(shí)。ERN和ESBAUGH［47］對(duì)美國(guó)紅魚（Sciaenops ocellatus）研究后認(rèn)為，滲透調(diào)節(jié)的成本是基礎(chǔ)代謝的次要組成部分，滲透壓調(diào)節(jié)能量成本不能用全動(dòng)物耗氧量來(lái)檢測(cè)。在本研究中，隨鹽度的降低耗氧率有升高趨勢(shì)，且在鹽度32‰時(shí)最低，而在等滲點(diǎn)附近（鹽度12‰）時(shí)耗氧率并沒(méi)有明顯降低，這表明在一定鹽度范圍內(nèi)鰓Na+／K+-ATPase進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)所消耗能量可能只是棕點(diǎn)石斑魚總代謝的一個(gè)相對(duì)較小的組成部分。MUHAMMADAR等［19］通過(guò)研究棕點(diǎn)石斑魚在鹽度22‰、28‰、32‰水體中生長(zhǎng)速度，認(rèn)為棕點(diǎn)石斑魚在鹽度32‰條件生長(zhǎng)速度最佳；TAHIR等［20］研究認(rèn)為，與31‰鹽度相比，棕點(diǎn)石斑魚在5‰～15‰鹽度時(shí)血清皮質(zhì)醇水平及死亡率增加；MORGAN和IWAMA［48］研究認(rèn)為，魚類對(duì)鹽度變化的代謝反應(yīng)，在很大程度上取決于其生活史階段，即物種在自然棲息地環(huán)境代謝率最低，比較適合其生長(zhǎng)。該批棕點(diǎn)石斑魚從孵化到養(yǎng)成一直生活在鹽度32‰自然海水中，且在鹽度32‰時(shí)耗氧率最低，這可能是長(zhǎng)期鹽度適應(yīng)的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)棕點(diǎn)石斑魚低鹽適應(yīng)10 d后血清滲透壓、血清Na+、Cl-、K+濃度、鰓Na+／K+-ATPase活性及相關(guān)基因表達(dá)、鰓組織學(xué)及耗氧率等變化綜合分析，在10 d時(shí)間內(nèi)棕點(diǎn)石斑魚能有效應(yīng)對(duì)鹽度6‰的水環(huán)境鹽度變化，但已經(jīng)受到了低鹽脅迫，長(zhǎng)期暴露于這種鹽度可能會(huì)對(duì)血清滲透壓和離子平衡產(chǎn)生更嚴(yán)重的影響。鰓Na+／K+-ATPase活性的變化不僅受NKA基因表達(dá)量影響，也受到了細(xì)胞數(shù)量變化的影響。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，棕點(diǎn)石斑魚在鹽度12‰時(shí)鰓Na+／K+-ATPase活性最低，但代謝率在鹽度32‰即自然棲息地鹽度環(huán)境時(shí)最低，這表明在一定鹽度范圍內(nèi)，鰓Na+／K+-ATPase滲透壓調(diào)節(jié)所消耗能量可能只是棕點(diǎn)石斑魚總代謝的一個(gè)相對(duì)較小的組成部分。