王晉,匡偉,何宗亮,高鵬,祝啟釗,楊銘宣,楊海霞,虞徳兵

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

生長曲線是研究動(dòng)物生長性能最常用的數(shù)學(xué)模型,用來發(fā)掘生長規(guī)律及進(jìn)行群體間比較,在遺傳育種實(shí)踐中發(fā)揮重要作用。Gompertz和Logistic模型是畜禽上應(yīng)用較多的生長模型,在牛[1]、雞[2]、鴨[3]等動(dòng)物的研究中發(fā)揮了重要作用,并且在禽類生長分析上具有一定優(yōu)勢(shì)[4]。金陵白鴨是本課題組和南京市畜牧家禽科學(xué)研究所合作,通過快大型櫻桃谷鴨和小型地方連城白鴨雜交、橫交固定,歷經(jīng)6個(gè)世代的群體繼代選育后形成的新品系,金陵白鴨為暫定名。7周齡群體均重2.0 kg,料重比3∶1,年產(chǎn)蛋260枚,肉質(zhì)鮮美,并且同連城白鴨一樣具有很高的藥用價(jià)值[5-7]。肉用動(dòng)物軀體的40%為骨骼肌,而肌纖維是骨骼肌的主要成分。相比腿肌,禽類胸肌結(jié)構(gòu)簡單,主要以快肌纖維為主,是研究品種間差異很好的對(duì)象[8]。此外,物種間的肌纖維數(shù)量具有顯著的差異[9],且不同品種間肌纖維的密度和直徑具有不同水平的差異[10]。因此,不同品種間肌纖維形成過程的研究具有重要價(jià)值。

生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factor,MRF)家族、肌增強(qiáng)因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2)家族等基因共同參與調(diào)控肌細(xì)胞的生成和發(fā)育[11-12],但肌纖維數(shù)量在胚胎期就已經(jīng)確定,出生后肌纖維肥大主要靠衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化和肌蛋白的沉積[13]。生肌決定因子(myogenic factor 5,Myf5)、肌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(myogenic differentiation 1,MyoD1)是主要生肌調(diào)節(jié)因子,肌生成素(myogenin,MyoG)是成肌細(xì)胞分化融合的關(guān)鍵基因,肌增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)與MyoG具有協(xié)同作用[14]。本研究為完善連城白鴨的配套系選育,運(yùn)用 Logistic和Gompertz 模型擬合生長曲線,探求北京鴨、金陵白鴨及其正反交群體的生長規(guī)律;并對(duì)肌纖維特性和肌發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行比較,分析肌發(fā)育相關(guān)基因分別與胸肌重和肌纖維特性的相關(guān)性,為地方鴨品種資源開發(fā)利用、品種選育等后續(xù)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年7月至11月在江蘇省南京市畜牧家禽科學(xué)研究所淳化基地完成。試驗(yàn)分為4組,分別為北京鴨純繁組(P,對(duì)照組)、金陵白鴨純繁組(J)、北京鴨和金陵白鴨的正交組(PJ)和金陵白鴨和北京鴨的反交組(JP)。4組均未設(shè)重復(fù)試驗(yàn)。每組選取健康狀況相近的1日齡公母混合雛鴨50只分別飼養(yǎng)。育雛期(0～2周)網(wǎng)床養(yǎng)殖,育成期(3～7周)地面平養(yǎng),乳頭飲水器飲水,桶料飼喂,自由采食。其他常規(guī)飼養(yǎng)管理如免疫等嚴(yán)格按鴨場飼養(yǎng)管理措施進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生長性能測定生長性能測定根據(jù)《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計(jì)方法:NY/T 823—2020》進(jìn)行。期間每2周在禁食6 h后,每組隨機(jī)選擇10只鴨稱重并記錄。7周齡按同樣方法稱重后選擇6只體重在均重附近的公鴨屠宰,取胸肌稱重并采樣。在同一部位取胸肌組織樣2份,1份修剪為2 cm×1 cm×1 cm 的組織塊后放入4%多聚甲醛溶液中固定,用于制作石蠟切片;另外1份放入凍存管置液氮中速凍,后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

1.2.2 生長曲線擬合分析根據(jù)Logistic函數(shù)模型和Gompertz函數(shù)模型對(duì)4組生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析[15]。采用高斯-牛頓(Gauss-Newton)算法,逐次迭代計(jì)算各參數(shù)值直到收斂,收斂標(biāo)準(zhǔn)精度為0.001,同時(shí)計(jì)算殘差平方和(E)和擬合度(R2)選做參考標(biāo)準(zhǔn),求出最適擬合曲線模型。每組選擇R2最大和E最小的函數(shù)模型進(jìn)一步計(jì)算并使用相關(guān)性最高的曲線預(yù)測其拐點(diǎn)體重、拐點(diǎn)周齡和最大周增重。Logistic:Y=A/(1+Be-KT);Gompertz:Y=Ae-Be-KT。式中:T為周齡;Y為T周齡時(shí)體重;A為體重的極限參數(shù);K為接近生長極限值時(shí)的生長速度;B為調(diào)節(jié)參數(shù)。

1.2.3 石蠟切片制作與HE染色將固定24 h的胸肌組織樣流水沖洗3 h,按梯度使用乙醇溶液脫水 2次;再依次經(jīng)過乙醇與二甲苯的等體積混合液、二甲苯2次;恒溫箱中依次經(jīng)過石蠟與二甲苯的等量混合液、石蠟后,用紙質(zhì)包埋盒包埋;待石蠟完全凝結(jié),修蠟塊為梯形,切片,撈片。將切片依次浸入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ 20 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、75%乙醇5 min、自來水洗;浸蘇木素染液3～5 min,自來水洗,分化液分化,自來水洗,返藍(lán)液返藍(lán),自來水沖洗;切片依次浸85%、95%乙醇5 min,伊紅染液5 min;切片依次浸無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ 5 min、無水乙醇Ⅲ 5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ 5 min,中性樹膠封片,顯微鏡鏡檢合格后用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

1.2.4 RT-qPCR用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取胸肌組織總RNA。經(jīng)NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測合格后,利用5×All-In-One RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Abm公司)冰上反轉(zhuǎn)錄(RT)成cDNA。RT反應(yīng)體系及程序:800 ng總RNA、反轉(zhuǎn)錄酶4 μL,加無酶去離子水至20 μL;37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋成400 ng·μL-1后,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因,利用EvaGreen 2×qPCR Master Mix熒光定量試劑盒(Abm公司)對(duì)與肌肉發(fā)育和肌纖維類型相關(guān)基因(表1)mRNA表達(dá)水平進(jìn)行qPCR。引物經(jīng)Primer Premier 5.0在線設(shè)計(jì),被NCBI primer-blast網(wǎng)站驗(yàn)證后由南京擎科生物公司合成。反應(yīng)體系:上、下游引物各0.6 μL,cDNA模板2 μL,定量酶10 μl,加無酶去離子水至20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。熔解曲線程序:95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同群體鴨生長性能比較分析

由表2可知:P組鴨體重始終具有優(yōu)勢(shì),雜交組介于父本純繁和母本純繁組之間,但是在4周齡時(shí)各組體重比較接近。另外,P組生長速度(即曲線斜率)始終高于其他組,斜率由大到小依次是P、PJ、JP、J,這說明北京鴨生長速度最快,最慢是金陵白鴨。第2周齡時(shí),PJ組體重略大于JP組外,JP組體重整體略重于PJ組(P>0.05)。在不同時(shí)間點(diǎn),P與J組體重具有極顯著差異(P<0.01)。由表3可知:7周齡4組公鴨活體重和胸肌重互相之間差異極顯著(P<0.01),而胸肌率PJ與P相近,并與其他組有極顯著差異(P<0.01)。親代胸肌率平均值明顯低于F1代,體現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。

表2 不同群體鴨不同時(shí)間點(diǎn)體重比較Table 2 Comparison of body weight of different groups of ducks at different time

表3 不同群體公鴨7周齡胸肌重和胸肌率比較Table 3 Comparison of breast muscle weight and breast muscle rate of different groups of male ducks at 7 week age

2.2 不同群體鴨生長曲線擬合分析

Logistic和 Gompertz函數(shù)模型的擬合結(jié)果如表4和圖1所示。其中P、PJ和JP組選擇Logistic函數(shù)模型,R2分別為0.994、0.986、0.994,E為每組最小值。J組選擇Gompertz函數(shù)模型,R2=1,E=751.49,其對(duì)應(yīng)模型曲線公式如表5所示。其中拐點(diǎn)周齡均預(yù)測為4周齡(26～30 日齡)左右,拐點(diǎn)體重由大到小依次為P、JP、PJ和J組,符合實(shí)際觀測值。最大周增重反映了拐點(diǎn)時(shí)期各組鴨的生長速度,各組之間大小順序同拐點(diǎn)體重。圖1將各組鴨體重實(shí)際觀測值和擬合值可視化,直觀展示擬合度的高低。以上均說明4周齡是鴨生長重要時(shí)期,需要相對(duì)嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理。

圖1 不同群體鴨實(shí)際與累積生長曲線比較Fig.1 Comparison of actual and cumulative growth curves of different duck groups

表4 生長曲線擬合相關(guān)參數(shù)Table 4 Relevant parameters of growth curve fitting

表5 不同群體鴨最適函數(shù)模型及其拐點(diǎn)分析和最大周增重Table 5 Optimal function model of different groups and their inflection point analysis and maximum weekly weight gain

2.3 不同群體鴨絕對(duì)和相對(duì)生長率

用最適函數(shù)模型計(jì)算鴨的相對(duì)生長和絕對(duì)生長曲線相對(duì)增長率。如圖2所示:4組鴨的相對(duì)生長率整體差異不大,并且隨周齡增加呈下降趨勢(shì)。但J組在0周齡(1日齡)時(shí),相對(duì)生長率大于1,這是由于計(jì)算函數(shù)模型的誤差造成的(圖2-A)。由圖2-B可知,P組的生長水平高于其他3組,而PJ和JP組相差不大,但在4～6周齡JP組下降速度超過PJ組,在6周齡后J組的下降趨勢(shì)逐漸減緩。4周齡時(shí),4組絕對(duì)生長差異較為明顯并達(dá)到頂峰。分別計(jì)算對(duì)應(yīng)雜種優(yōu)勢(shì)率得知(圖3):在4周齡之前,雖然相對(duì)生長率逐漸降低,但其和絕對(duì)生長率的雜種優(yōu)勢(shì)率均逐漸上升,在4周后開始下降。其中,F1代在2～5周的相對(duì)生長率表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢(shì),但在絕對(duì)生長率并不明顯。在4周前,JP組的絕對(duì)生長率較PJ組始終具有明顯的優(yōu)勢(shì),這也說明其前期生長速度快。在6周齡后,JP組的瞬時(shí)生長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PJ組,PJ組在后期的生長速度具有一定優(yōu)勢(shì),這些結(jié)果表明母體效應(yīng)明顯。

圖2 不同群體最適相對(duì)生長率(A)和絕對(duì)生長率(B)Fig.2 The optimum curve of relative growth rate(A)and absolute growth rate(B)of different groups

圖3 雜交一代(F1)相對(duì)增長率(A)和絕對(duì)增長率(B)的雜種優(yōu)勢(shì)率Fig.3 Heterosis rate of relative growth rate(A)and absolute growth rate(B)of the first hybrid generation(F1)

2.4 不同群體公鴨肌纖維特性指標(biāo)和相關(guān)基因表達(dá)水平比較

如圖4所示:7周齡公鴨胸肌肌纖維從大到小依次為P、JP、PJ、J。如表6所示:經(jīng)過計(jì)算,P組的肌纖維直徑、橫截面積和密度與其他3組均有極顯著差異(P<0.01),各組的直徑越大,密度越小;雜交組的各指標(biāo)均介于親本之間。此外,J和JP組肌纖維直徑差異顯著(P<0.05);J、PJ和JP組肌纖維橫截面積差異不顯著(P>0.05);J組肌纖維密度與其他3組差異均極顯著(P<0.01),但PJ與JP組差異不顯著(P>0.05)。

由圖5可知:與肌肉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平在不同品種間具有差異,在P組的水平最高。各組Myf5基因的表達(dá)水平表明,P組與J組分別均與其他組具有極顯著差異(P<0.01),而在PJ和JP組差異不顯著(P>0.05);在MyoD1和MyoG的表達(dá)水平中,P組與其他3組具有極顯著差異(P<0.01),而J、PJ、JP組之間并不具有顯著差異(P>0.05);然而,P和JP組MEF2C的表達(dá)水平與其他組均具有極顯著差異(P<0.01),J和PJ組表達(dá)水平相對(duì)較低,且差異不顯著(P>0.05)。

圖4 7周齡不同群體公鴨胸肌切片F(xiàn)ig.4 Paraffin sections of pectoral muscles of 7 week age male ducks of different groups

表6 不同群體公鴨肌纖維特性指標(biāo)的比較Table 6 Comparison of muscle fiber characteristics of different male ducks

圖5 肌肉發(fā)育相關(guān)基因在不同群體公鴨的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of muscle development related genes in male ducks of different groups柱上不同大寫字母表示在0.01水平差異極顯著。Different upper case letters on the column are significantly differnet at the level of 0.01.

2.5 胸肌重與肌纖維特性指標(biāo)和相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性分析

由表7可知:胸肌重分別與肌纖維直徑、MEF2C表達(dá)水平極顯著相關(guān),與肌纖維密度極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),表明MEF2C的表達(dá)水平對(duì)肌纖維直徑和胸肌重有重要影響,還需進(jìn)一步加深對(duì)肌發(fā)生相關(guān)基因的研究。肌纖維直徑、肌纖維面積均與肌纖維密度極顯著負(fù)相關(guān),從側(cè)面證明了相關(guān)性分析的準(zhǔn)確性。Myf5、MyoD1、MyoG、MEF2C之間均具有顯著相關(guān)性(P<0.05),表明基因之間的協(xié)同作用。

表7 肌纖維特性指標(biāo)和相關(guān)基因表達(dá)水平與體重的相關(guān)性(R2)Table 7 Correlation analysis between muscle fiber characteristics,related gene expression level and body weight(R2)

3 討論

Gompertz和Logistic均屬于S型生長曲線的計(jì)算模型,但由函數(shù)可以看出其一階、二階導(dǎo)數(shù)在中期具有一定差異。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)僅有J組的2種模型擬合度最高,且Gompertz模型擬合度為1,而其他3組最適用Logistic模型擬合。這從側(cè)面說明金陵白鴨經(jīng)過北京鴨雜交改良后,生長速度明顯提高且中期生長速度加快,而金陵白鴨在后期的生長速度具有一定優(yōu)勢(shì),這與Z型北京鴨品系的曲線擬合結(jié)果相似[16-17]。但是,畜禽的生長滿足這種生長規(guī)律的同時(shí),易受環(huán)境和人為因素的影響,如丁賢群等[17]比較北京鴨生長模型時(shí),最適曲線為Gompertz,且拐點(diǎn)為3.5周齡,與本試驗(yàn)結(jié)果不同。JP組4周齡的生長速度出現(xiàn)明顯雜種優(yōu)勢(shì),而PJ組在6周后才出現(xiàn)優(yōu)勢(shì),這為F1代在后續(xù)選育中提供參考。

生長性能同樣影響屠宰性能。胸肌作為與體重相關(guān)的育種指標(biāo)被廣泛研究。通過計(jì)算7周齡胸肌和活重的比率發(fā)現(xiàn)F1均具有雜種優(yōu)勢(shì),而胸肌肌纖維的形成過程是造成品種間差異的主要原因。研究表明,不同條件不同品種肉牛的肌纖維及其類型具有顯著差異[18],但是對(duì)鴨的研究中,由于缺乏鴨Ⅱ型肌纖維的抗體,很遺憾未能研究雜交后代之間與親代的肌纖維類型差異。在出生后肌肉肥大過程中,不同時(shí)期的基因表達(dá)水平不同[19-20],但在不同品種,尤其是雜交后代中的差異研究很少。本研究中MEF2C表達(dá)水平在7周齡正反交鴨之間差異極顯著,但肌纖維特性和其他基因表達(dá)水平在正反交組未體現(xiàn)出顯著差異。