陳秀， 李蕾， 張鶴達， 張建

乳腺癌是女性健康的首位殺手，每年發(fā)病率和死亡率遙遙領(lǐng)先[1]。目前乳腺癌的治療方法主要為手術(shù)治療、化學(xué)治療、靶向治療、免疫治療等綜合治療，隨著新技術(shù)、新藥物的研發(fā)，乳腺癌患者的生存率有所提高，但仍有20%～30%的患者會出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)性死亡[2]。乳腺癌發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機制和腫瘤特異性或分期特異性標(biāo)志物的缺失進一步加大了治療的難度。

骨轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，已知乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的主要病理生理基礎(chǔ)是腫瘤細(xì)胞促進骨組織中鈣離子的釋放，破壞了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的生理平衡[3]。鈣磷蛋白(calcyphosine，CAPS)是一種鈣結(jié)合蛋白家族成員，參與了鈣離子的轉(zhuǎn)運過程，在腫瘤骨轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要的作用。近來大量研究發(fā)現(xiàn)骨微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)因子主要與成骨細(xì)胞相互作用維持“骨平衡”，當(dāng)各種因素導(dǎo)致骨微環(huán)境中免疫細(xì)胞功能缺陷時，會促使腫瘤骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]。同時有學(xué)者證實了腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的高密度浸潤對乳腺癌患者的骨轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有明確的相關(guān)性[5]，由此探究腫瘤微環(huán)境相關(guān)免疫細(xì)胞與骨微環(huán)境之間的聯(lián)系為乳腺癌的治療開辟了新方向。然而，CAPS與乳腺癌微環(huán)境相關(guān)免疫細(xì)胞之間是否具有關(guān)聯(lián)尚無研究。

本研究通過分析CAPS在乳腺癌患者中的表達情況及與腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的關(guān)系，探討CAPS在乳腺癌預(yù)后評估中的臨床價值及作為治療靶標(biāo)的可能性。

1 資料與方法

1.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析 UALCAN數(shù)據(jù)庫(http：//ualcan. path. uab. edu)中涵蓋了TCGA數(shù)據(jù)庫中31種惡性腫瘤的RNA-seq結(jié)果和臨床資料[6]，我們通過該數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌組織和癌旁組織中基因的表達水平，以及在不同腫瘤分級、分期等臨床病理特征條件下基因的表達情況。

1.2 LinkedOmics LinkedOmics(http：//www.linkedomics.org/login.php)是分析TCGA數(shù)據(jù)庫中32個腫瘤相關(guān)多維數(shù)據(jù)集的一個平臺[7]。使用Pearson相關(guān)分析統(tǒng)計出CAPS的相關(guān)基因，并以火山圖、熱圖或散點圖展示。LinkedOmics平臺使用基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)計算出基因生理過程(GO_BP)、KEGG信號通路、激酶-靶點、miRNA-靶點、轉(zhuǎn)錄因子-靶點富集分析，F(xiàn)DR<0.05的相關(guān)基因會展示在圖表中。

1.3 Kaplan-Meier Plotter生存分析 Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站羅列了18 674個惡性腫瘤樣本(7 830例乳腺癌)患者，我們通過該網(wǎng)站分析CAPS與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。CAPS檢測探針I(yè)D為226424_at。樣本根據(jù)CAPS的表達量分為低表達組和高表達組，通過K-M生存曲線和Log-rank方法分析基因和總生存期(overall survival，OS)、無復(fù)發(fā)生存期(relapse free survival，RFS)、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期(distant metastasis free survival，DMFS)的關(guān)系，并計算對應(yīng)的風(fēng)險病例數(shù)、風(fēng)險比(hazard ratios，HRs)、95%可信區(qū)間(confident intervals，CIs)、P值。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 TIMER2.0 TIMER(https：//cistrome. shinyapps. io/timer/)能夠?qū)CGA數(shù)據(jù)庫中不同惡性腫瘤的免疫微環(huán)境進行系統(tǒng)性分析，其囊括了32種惡性腫瘤的10 897樣本[8-9]。TIMER應(yīng)用反卷積法[10]反映腫瘤相關(guān)浸潤免疫細(xì)胞的數(shù)量(tumor-infiltrating immune cells，TIICs)。我們分析了乳腺癌患者CAPS和B細(xì)胞、CD4+ T淋巴細(xì)胞、CD8+ T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞及與腫瘤純度的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中CAPS的表達量比較TCGA數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計了1 076個乳腺癌組織樣本和114個癌旁組織樣本中標(biāo)準(zhǔn)化后CAPS基因的表達量，發(fā)現(xiàn)CAPS基因在乳腺癌組織的中位表達量為4.865/107，較癌旁組織中位表達量的3.146/107，呈現(xiàn)出明顯的高表達(圖1A)。CPTAC數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計了125個癌組織樣本CAPS蛋白表達量比18個癌旁組織樣本表達量高(圖1B)。因此，CPAS基因和蛋白均可以作為乳腺癌的潛在診斷因子。

*：P<0.05圖1 CAPS在乳腺癌組織與正常組織中的表達水平

2.2 不同亞組乳腺癌中CAPS的表達量比較 基于臨床病理學(xué)特征的多樣性，我們使用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析了TCGA-BRCA和CPTAC-BRCA中不同亞組患者體內(nèi)CAPS的基因和蛋白水平表達量，發(fā)現(xiàn)腫瘤分級、人種、性別、年齡、月經(jīng)狀態(tài)、分子分型、病理類型等亞組中，CAPS的表達量與對照組存在顯著性差異(圖2～3)。因此CAPS有希望作為判斷乳腺癌患者亞組甚至預(yù)后的潛在預(yù)測因子。

*：P<0.05圖2 不同亞組中CAPS基因的表達水平

*：P<0.05圖3 不同亞組中CAPS蛋白的表達水平

2.3 生存分析 使用Kaplan-Meier生存曲線分析TCGA數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者預(yù)后情況和CAPS的關(guān)系，根據(jù)CAPS的中位數(shù)將患者分為高表達組和低表達組，分析發(fā)現(xiàn)CAPS高表達組乳腺癌患者的OS、RFS、DMFS均較短(圖4，log-rank testP<0.05)。通過GO、KEGG分析發(fā)現(xiàn)CAPS可能參與人體的免疫調(diào)節(jié)。

注：OS為完全生存期；RFS為無復(fù)發(fā)生存期；DMFS為無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期；HR為風(fēng)險比圖4 CAPS與乳腺癌OS、RFS、DMFS的生存曲線

2.4 免疫相關(guān)性 我們使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析了CAPS與乳腺癌免疫微環(huán)境的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAPS不僅與乳腺癌腫瘤純度相關(guān)(r=0.086，P<0.05)，而且與腫瘤微環(huán)境中的主要免疫細(xì)胞相關(guān)(圖5)。

圖5 CAPS與乳腺癌浸潤相關(guān)免疫細(xì)胞的關(guān)系

3 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是乳腺癌診療過程中我們面臨的巨大挑戰(zhàn)，而骨轉(zhuǎn)移的病理生理機制主要是腫瘤細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境阻礙了骨的生成和骨的破壞之間的動態(tài)平衡，在這個過程當(dāng)中鈣的代謝發(fā)揮著舉足輕重的作用。鈣結(jié)合蛋白是細(xì)胞第二信使系統(tǒng)的重要組成部分，密切參與了鈣離子的轉(zhuǎn)運過程，而CAPS作為鈣結(jié)合蛋白家族的成員，參與了鈣離子代謝的調(diào)節(jié)作用，從而進一步加速骨轉(zhuǎn)移的過程。

有研究收集了36例結(jié)直腸癌患者的癌組織和癌旁組織，發(fā)現(xiàn)癌組織中CAPS的含量顯著高于癌旁正常組織，然后結(jié)合臨床病理學(xué)特征分析發(fā)現(xiàn)CAPS的表達水平與結(jié)直腸癌患者的組織分級、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，因此推斷CAPS高表達可能預(yù)測結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后[11]。同時，CAPS的表達與非小細(xì)胞肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高水平的CAPS可能促進非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移能力[12]。然而在肺腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)CAPS的表達量明顯低于正常肺組織，并且在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者中，CAPS低水平者的生存期更長[13]。由此我們推斷CAPS在不同實體腫瘤中可能發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用，本研究旨在探索CAPS是否參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中CAPS的基因和蛋白表達量遠(yuǎn)高于癌旁正常組織，且高表達CAPS的乳腺癌患者生存期較短，我們推斷CAPS參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。而不同腫瘤分期患者之間CAPS的基因和蛋白表達水平差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，分析其中原因可能是由于各個腫瘤分期的患者人數(shù)較少且不均質(zhì)，缺乏可比性，因此CAPS是否具有預(yù)測不良腫瘤分期的作用還需要更多的大樣本臨床研究來佐證。在不同人種之間CAPS的比較可以得出結(jié)論：黑人乳腺癌患者的CAPS基因表達水平高于白種人和黃種人患者。這與黑人乳腺癌患者的預(yù)后相對較差相一致[14]，側(cè)面證實了CAPS有評估乳腺癌患者預(yù)后的功能。在不同年齡段患者之間的比較發(fā)現(xiàn)：41～60歲患者中CAPS的基因表達明顯高于21～40歲患者，而與>60歲患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，并且不同年齡段之間CAPS基因的表達未發(fā)現(xiàn)顯著差異性，由此我們推測在不同年齡段患者中CAPS蛋白的診斷價值可能高于預(yù)后評估價值。同時我們發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期患者的CAPS基因表達低于絕經(jīng)前和絕經(jīng)后患者，可能與納入研究的圍絕經(jīng)期患者數(shù)量較少有關(guān)，而不同月經(jīng)狀態(tài)下的CAPS蛋白水平的研究數(shù)據(jù)尚欠缺，同時考慮到基因只有在轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白分子后才發(fā)揮生理作用，因此該結(jié)論有待進一步研究證實。不同分子分型亞組分析中，luminal型患者CAPS基因表達較三陰型患者低，尤其低于BL1型和M型三陰型乳腺癌患者?？紤]到納入蛋白層面研究的病例數(shù)較少，不同分子類型間CAPS蛋白水平的差異性無統(tǒng)計學(xué)意義。病理類型亞組分析中，由于組間數(shù)量的偏差性導(dǎo)致結(jié)論的可靠性有所欠缺，但CAPS蛋白在正常組織和IDC之間的差異性仍具有極高的可信度。

目前腫瘤微環(huán)境的調(diào)控已成為打破乳腺癌治療瓶頸的關(guān)鍵，腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的功能與乳腺癌患者的預(yù)后息息相關(guān)[15]，這與本研究中高水平CD4+ T細(xì)胞乳腺癌患者生存期較長的結(jié)果相一致。針對接受內(nèi)分泌治療的激素受體陽性乳腺癌患者，約三分之一會因為耐藥性而使療效大打折扣[16]。有研究者將內(nèi)分泌治療耐藥患者和內(nèi)分泌治療敏感患者的乳腺癌組織中蛋白分子表達進行了比較，發(fā)現(xiàn)CAPS高表達的乳腺癌患者更容易發(fā)生內(nèi)分泌治療的耐藥性，具有一定程度的預(yù)測功能[17]。結(jié)合本研究中，在激素受體陽性患者中CAPS與免疫細(xì)胞的關(guān)系，尤其是與T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的負(fù)相關(guān)關(guān)系，由此推斷CAPS可能通過抑制Luminal型乳腺癌患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞功能從而誘導(dǎo)內(nèi)分泌藥物耐藥性的產(chǎn)生，最終影響患者的預(yù)后。

綜上，我們認(rèn)為CAPS可以作為乳腺癌診斷的潛在分子標(biāo)志物，并且CAPS可能通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的功能導(dǎo)致乳腺癌的不良預(yù)后，尤其與激素受體陽性乳腺癌患者的預(yù)后緊密相關(guān)。