趙玥， 付永強(qiáng)， 周真林， 楊明， 黃維超， 方雅蘭

據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心(IARC)發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬(wàn)例，成為全球第一大癌癥[1]。手術(shù)、放療、化療、靶向治療是乳腺癌的主要治療手段[2]，其中化療在乳腺癌綜合治療中占有不可替代的地位，但是幾乎不可避免的化療耐藥一直是限制乳腺癌治療的瓶頸[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌耐藥與乳腺癌患者復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，耐藥乳腺癌更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移的乳腺癌更具藥物耐受性[4]，這也成為乳腺癌治療過(guò)程中的主要障礙和難題。

外泌體可以參與腫瘤及腫瘤耐藥的調(diào)節(jié)[5]，外泌體是細(xì)胞分泌的納米級(jí)膜微粒，它是包含了復(fù)雜RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子受體等活性物質(zhì)的小膜泡(30～150 nm)[6]。機(jī)體的多種細(xì)胞均可分泌外泌體，其廣泛分布于唾液、血漿、乳汁等體液中。外泌體可以參與細(xì)胞間通訊，是轉(zhuǎn)移物質(zhì)及信息蛋白質(zhì)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)的優(yōu)良中介，而不需要直接的細(xì)胞間接觸[7]。研究表明，腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞均可分泌攜帶有耐藥相關(guān)分子的外泌體，并通過(guò)外泌體在腫瘤微環(huán)境中相互作用，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性[8]。

環(huán)狀RNA(circRNA)是具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性非編碼RNA，它通過(guò)外顯子環(huán)化或內(nèi)含子環(huán)化將3′和5′末端連接起來(lái)，形成完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)[9]。circRNA可通過(guò)充當(dāng)miRNA海綿，或是與蛋白質(zhì)相結(jié)合，從而參與基因表達(dá)調(diào)控并影響蛋白質(zhì)的功能。有研究發(fā)現(xiàn)circRNA與腫瘤存在緊密關(guān)聯(lián)[10]。其高度穩(wěn)定性和特異性使之有望成為腫瘤潛在的預(yù)測(cè)及治療靶點(diǎn)[11]。本研究通過(guò)研究外泌體中circ-RPPH1對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，以期探究circ-RPPH1在乳腺癌耐藥中的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 生物信息數(shù)據(jù)檢索

檢索高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus，GEO)，分析乳腺癌患者腫瘤組織與正常組織間差異表達(dá)的circRNA，通過(guò)circular RNA interactome數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)目標(biāo)circRNA的靶向miRNA，通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶向miRNA的下游靶向關(guān)系。

1.2 病例資料

收集2020年2月至2021年10月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬貴航三OO醫(yī)院診治的53例乳腺癌患者，均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，均使用紫杉醇行新輔助化療，依據(jù)化療過(guò)程中腫瘤體積的變化程度進(jìn)行分類：腫瘤體積縮小為紫杉醇敏感組(24例)，腫瘤體積不變或進(jìn)展為紫杉醇耐藥組(29例)；另選擇同期我院收治的非乳腺癌患者(33例)作為正常組。取3組患者的血清學(xué)樣本及手術(shù)切除組織樣本，存放于液氮中，冷凍過(guò)夜后再轉(zhuǎn)移至-80 ℃低溫冰箱中保存。

1.3 主要細(xì)胞和試劑

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細(xì)胞、小干擾RNA(siRNA)和慢病毒均由泰安華啟生物科技有限公司構(gòu)建。全外泌體純化試劑(Total Exosome Isolation Reagent)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。miRNA分離試劑盒(miRNA Isolation Kit)、TRIzol RNA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。多合一miRNA RT-qPCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)購(gòu)自日本Toyobo公司。熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒、Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒、Imax轉(zhuǎn)染試劑及MTT試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。黏蛋白19(MUC19)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)MyBioSource公司。RIPA緩沖液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和蛋白質(zhì)定量試劑盒均購(gòu)自南京維諾贊公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。10只BALB/c-nu型裸鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19篩選

通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌患者腫瘤組織與正常組織差異表達(dá)的circRNA，借助circRNA表達(dá)譜熱圖分析篩選出circ-RPPH1；通過(guò)circular RNA interactome數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)circ-RPPH1靶向miRNA的為miR-146b-3p；通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶向miR-146b-3p的下游靶向?yàn)镸UC19。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)circ-RPPH1和miR-146b-3p表達(dá)水平 于53例乳腺癌患者中隨機(jī)選取33例作為乳腺癌組，分別取乳腺癌組與正常組、紫杉醇敏感組與耐藥組患者血清，應(yīng)用TRIzol RNA試劑盒分別提取細(xì)胞RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，使用SYBR Green Ⅰ進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)各組血清circ-RPPH1表達(dá)水平。使用miRNA分離試劑盒分離miR-146b-3p，miRNA RT-qPCR 檢測(cè)試劑盒反轉(zhuǎn)錄miR-146b-3p，TRIzol RNA試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，qRT-PCR檢測(cè)miR-146b-3p表達(dá)情況，以2-ΔΔCt計(jì)算其表達(dá)水平。circ-RPPH1正向引物：5′-TTGGGAAGGTCTGAGACTAGGG-3′;反向引物5′-CCACTGATGAGCTTCCCTCC-3′。GAPDH正向引物：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′;反向引物：5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。miR-146b-3p正向引物：5′-TGAGAACTGAATTCCATAGGCT-3′;反向引物：5′-GCACTGTCAGACCGAGACAAG-3′。U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT3′;反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC3′。

1.4.3 ELISA測(cè)定MUC19水平 使用MUC19 ELISA試劑盒按照說(shuō)明書操作，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，記錄MUC19濃度。

1.4.4 外泌體分離 使用全外泌體純化試劑盒，選取狀態(tài)較好的乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，加入新鮮的不含外泌體血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集20 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，4 ℃、300 ×g離心30 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾過(guò)膜過(guò)濾后，加入50 kd超濾管中，4 ℃、4 000 ×g離心10 min，吸取2 ml濃縮細(xì)胞培養(yǎng)液至新的離心管中，加入1 ml外泌體提取試劑，混勻后4 ℃過(guò)夜，4 ℃、10 000 ×g離心1 h，棄上清液，用200 μl PBS重懸沉淀，用于后續(xù)鑒定分析。

1.4.5 外泌體鑒定 用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)：取20 μl外泌體懸液，均勻涂布在電鏡銅網(wǎng)上，室溫放置10 min；用濾紙吸干液體，然后用30 μl磷鎢酸(20 mg/ml)對(duì)外泌體樣品室溫負(fù)染1 min，濾紙吸干液體后，放于烤燈下烤干，安裝銅網(wǎng)于樣品槽中，在透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)并拍照；采用Western blotting法檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白，將提取的細(xì)胞外泌體蛋白經(jīng)BCA法蛋白定量后，取20 μg樣品，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉，PBS洗滌，將膜與CD63、CD9、CD81及TSG101一抗孵育，4 ℃過(guò)夜，然后與二抗孵育 1 h，與ECL試劑溫育后分析印跡。

1.4.6 外泌體攝取實(shí)驗(yàn) 取耐藥細(xì)胞外泌體200 μl，與1 ml細(xì)胞膜熒光標(biāo)志試劑(PKH67)混勻，室溫孵育5 min后，加入2 ml BSA(0.5%)結(jié)合過(guò)量的PKH67終止染色，然后使用外泌體沉淀液沉淀出PHK67標(biāo)記的外泌體，用9.6 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀；取250 μl PKH67標(biāo)記的外泌體，與乳腺癌細(xì)胞在37 ℃共孵育3 h，PBS清洗細(xì)胞后，室溫固定1 h，DAPI染色10 min，利用熒光顯微鏡觀察外泌體攝入情況。

1.4.7 circ-RPPH1外結(jié)構(gòu)驗(yàn)證 將紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX分為3組，不加入試劑者為對(duì)照組，加入核酸內(nèi)切酶(RNaseA)者為RNaseA組，加入核酸內(nèi)切酶+去垢劑(RNaseA+Trition X100)者為RNaseA+Trition X100組，檢測(cè)每組細(xì)胞中的circ-RPPH1含量。

1.4.8 紫杉醇耐藥性檢測(cè) 以半數(shù)抑制濃度(IC50)表示細(xì)胞系對(duì)紫杉醇的耐藥性，用GraphPad Prism7軟件計(jì)算乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌耐藥細(xì)胞系及敲低circ-RPPH1表達(dá)后乳腺癌耐藥細(xì)胞系的IC50值。

1.4.9 細(xì)胞培養(yǎng) 將紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及0.1%的雙抗青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。然后置于37 ℃含5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的情況更換新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4.10 siRNA轉(zhuǎn)染 待細(xì)胞融合度達(dá)30%～50%，加入5 μl siRNA轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞并提取RNA，作為si-circ-RPPH1組，以空白質(zhì)粒(si-NC)作參照為si-NC組，使用RT-qPCR法檢測(cè)各組circRNA的量。siRNA正向引物：5′-CGGGGAGGGAAGCUCAUCATT-3′；反向引物：5′-UGAUGAGCUUCCCUCCCCGTT-3′。

1.4.11 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞以合適的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，分別選取培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞進(jìn)行增殖能力測(cè)定。分別向每個(gè)細(xì)胞孔中加入20 μl MTT溶液(5 μg/ml)，孵育4 h。輕輕吸取上層培養(yǎng)基后，向每孔中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，以充分溶解結(jié)晶物，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，為了便于統(tǒng)計(jì)分析，將吸光度值乘以100倍。

1.4.12 細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) ①遷移實(shí)驗(yàn)：用2 ml含1%FBS的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于12孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用PBS清洗2次，加入4%多聚甲醛固定，于4 ℃冰箱中固定30 min，經(jīng)PBS清洗后以結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下拍照3個(gè)視野，計(jì)數(shù)其細(xì)胞數(shù)并取其平均數(shù)。②侵襲實(shí)驗(yàn)：基質(zhì)膠4 ℃過(guò)夜融化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至1 mg/ml，取100 μl稀釋后，將基質(zhì)膠加入Transwell上室，于37 ℃培育4 h使之形成膠狀，后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.4.13 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞消化重懸后計(jì)數(shù)，以1 000個(gè)/孔接種于6孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育2周，用結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗3次，統(tǒng)計(jì)克隆形成數(shù)。

1.4.14 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 將細(xì)胞接種于6孔板，濃度調(diào)整為2×106/ml，于37 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書加入試劑處理細(xì)胞，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.4.15 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP) 收集細(xì)胞，用磁珠和抗Ago2抗體孵育24 h后，洗滌后用蛋白酶K消化蛋白，依次用酚-氯仿-異戊醇試劑純化RNA，用RT-qPCR檢測(cè)RNA，以IgG作為陰性對(duì)照。用3′-生物素化miRNA模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后裂解細(xì)胞并與鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)珠孵育，形成生物素-miRNA-circRNA復(fù)合物，用蛋白酶K消化后，用RT-qPCR檢測(cè)circRNA含量，以此證實(shí)miRNA與circRNA結(jié)合。

1.4.16 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性 根據(jù)circ-RPPH1、miRNA和mRNA結(jié)合位點(diǎn)，利用軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)引物，并構(gòu)建野生型、突變型circ-RPPH1熒光素酶載體，收集各組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶的活性。

1.4.17 裸鼠移植瘤模型體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況及其與circ-RPPH1的關(guān)系 于裸鼠背部右側(cè)皮下注射穩(wěn)轉(zhuǎn)circ-RPPH1的細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠移植腫瘤模型，實(shí)驗(yàn)分為2組：空白對(duì)照組(sh-NC組)、質(zhì)粒包裹的circ-RPPH1組(sh-circ-RPPH1組)，每組各3例，每3天測(cè)一次裸鼠的腫瘤體積，待腫瘤生長(zhǎng)到一定體積，取出腫瘤，測(cè)定小鼠腫瘤的體積及質(zhì)量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，同時(shí)檢測(cè)circ-RPPH1的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 circ-RPPH1在乳腺癌組織與正常組織中的表達(dá)情況

circRNA表達(dá)譜熱圖及GEO數(shù)據(jù)分析circ-RPPH1表達(dá)圖譜結(jié)果顯示，circ-RPPH1在乳腺癌患者與正常組織中存在差異化表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 circ-RPPH1在乳腺癌組織與正常組織中存在差異化表達(dá)

2.2 乳腺癌與非乳腺癌患者血清中circ-RPPH1的表達(dá)水平比較

乳腺癌組血清中的circ-RPPH1表達(dá)水平高于正常組(3.16±0.79vs.1.30±0.51，t=11.421，P<0.001)；紫杉醇耐藥組患者血清中的circ-RPPH1表達(dá)水平高于紫杉醇敏感組(9.27±1.22vs.2.73±0.84，t=23.062，P<0.001)，見(jiàn)圖2。

圖2 乳腺癌與非乳腺癌患者血清中circ-RPPH1的表達(dá)水平比較

2.3 circ-RPPH1在乳腺癌細(xì)胞系及紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表達(dá)水平為(1.89±0.15)、(2.56±0.25)，均高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中circ-RPPH1的表達(dá)水平(1.00±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.810、10.163，P<0.001)。紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中circ-RPPH1的表達(dá)水平為(3.69±0.35)、(5.32±0.55)，均高于乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表達(dá)水平(t=8.187、7.902，P<0.001，圖3)。

圖3 circ-RPPH1在正常乳腺上皮細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞系及紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平比較

2.4 circ-RPPH1在乳腺癌紫杉醇耐藥組和紫杉醇敏感組患者血清外泌體中的表達(dá)水平

乳腺癌紫杉醇耐藥組患者血清外泌體中的circ-RPPH1水平高于乳腺癌紫杉醇敏感組(11.23±1.37vs.3.93±0.86)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.886，P<0.001)。

2.5 外泌體觀察和鑒定

透射電鏡掃描可見(jiàn)，乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細(xì)胞中的外泌體均表現(xiàn)為典型的直徑60～100 nm的囊泡狀結(jié)構(gòu)；且血清及細(xì)胞外泌體中均表達(dá)CD63、CD9、CD81和TSG101，上清液中則無(wú)此4種標(biāo)志蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖4。

圖4 外泌體照片及外泌體免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

2.6 乳腺癌耐藥細(xì)胞中circ-RPPH1含量比較

在紫杉醇乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中，RNaseA+Trition X100組的circ-RPPH1含量為(0.36±0.05)、(0.20±0.04)，均低于RNaseA組的circ-RPPH1含量(分別為0.90±0.12、0.95±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.767、12.865，P<0.001，圖5)。

圖5 對(duì)照組、RNaseA組、RNaseA+Trition X100組中circ-RPPH1含量比較

2.7 外泌體負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)circ-RPPH1并影響乳腺癌細(xì)胞的耐藥能力

外泌體攝取實(shí)驗(yàn)中，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231攝取乳腺癌耐藥細(xì)胞外泌體后circ-RPPH1的表達(dá)水平為(2.60±0.25)、(3.90±0.33)，均高于PBS處理組中circ-RPPH1的表達(dá)水平(1.00±0.12、1.00±0.15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.993、13.857，P<0.001，圖6A)。

敲低乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中circ-RPPH1的表達(dá)后，circ-RPPH1的表達(dá)量為(1.45±0.15)、(1.75±0.17)，低于si-NC組circ-RPPH1的表達(dá)量(2.60±0.25)、(4.00±0.40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.832、8.967，P<0.001，圖6B)；乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231對(duì)紫杉醇的IC50為(24.30±2.40)nmol/L、(18.30±1.80)nmol/L，低于si-NC組的IC50為(40.00±3.20)nmol/L、(31.00±2.20)nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.798、7.739，P<0.001，圖6C)。

6A：共孵化后乳腺癌細(xì)胞系攝取circ-RPPH1水平；6B：敲低circ-RPPH1后乳腺癌細(xì)胞系中circ-RPPH1表達(dá)水平；6C：敲低circ-RPPH1后乳腺癌細(xì)胞系對(duì)紫杉醇耐藥能力的影響圖6 外泌體負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)circ-RPPH1并影響乳腺癌細(xì)胞的耐藥能力

2.8 外泌體中circ-RPPH1調(diào)控乳腺癌耐藥細(xì)胞系對(duì)紫杉醇的耐藥能力

乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX對(duì)PTX耐藥性的IC50為(193.0±10.8)nmol/L、(132.0±12.3)nmol/L，分別高于乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231對(duì)PTX的IC50(21.2±1.8)nmol/L、(14.5±1.2)nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.1178、16.468，P<0.001，圖7)。敲低乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中circ-RPPH1的表達(dá)后，circ-RPPH1的表達(dá)水平為(0.30±0.04)、(0.36±0.06)，低于si-NC組(1.02±0.15、1.00±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.033、10.248，P<0.001，圖8A)；乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX對(duì)紫杉醇的IC50為(89.0±8.0)nmol/L、(72.0±7.0)nmol/L，分別低于si-NC組(182.0±14.0)nmol/L、(131.0±14.0)nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.990、6.999，P<0.001，圖8B)。

圖7 乳腺癌細(xì)胞系及耐藥細(xì)胞系對(duì)紫杉醇的耐藥性

8A：敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細(xì)胞系中circ-RPPH1的表達(dá)；8B：敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細(xì)胞系對(duì)紫杉醇的耐藥情況圖8 circ-RPPH1調(diào)控乳腺癌耐藥細(xì)胞系對(duì)紫杉醇的耐藥能力

2.9 敲低乳腺癌耐藥細(xì)胞系中circ-RPPH1表達(dá)后乳腺癌耐藥細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力變化

敲低乳腺癌耐藥細(xì)胞系中circ-RPPH1的表達(dá)后，增殖實(shí)驗(yàn)中乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值分別為(33.0±3.0)、(42.0±4.0)，低于Si-NC組的吸光度值(95.0±8.0、110.0±12.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.569、9.311，P<0.001，圖9)。遷移實(shí)驗(yàn)中乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細(xì)胞計(jì)數(shù)為(55.0±5.0)個(gè)、(63.0±6.0)個(gè)，低于Si-NC組細(xì)胞計(jì)數(shù)(105.0±9.0)個(gè)、(159.0±13.0)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.412、11.613，P<0.001，圖10)。侵襲實(shí)驗(yàn)中乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX細(xì)胞計(jì)數(shù)為(52.0±5.0)個(gè)、(68.0±6.0)個(gè)，低于Si-NC組細(xì)胞計(jì)數(shù)(110.0±10.0)個(gè)、(147.0±12.0)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.985、10.199，P<0.001，圖11)。

圖9 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細(xì)胞系增殖情況

圖10 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細(xì)胞系遷移情況

圖11 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細(xì)胞系侵襲情況

2.10 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細(xì)胞株細(xì)胞周期的變化

敲低circ-RPPH1的表達(dá)后，乳腺癌耐藥細(xì)胞系細(xì)胞DNA合成受阻，細(xì)胞阻滯于S期，見(jiàn)圖12、表1。

圖12 敲低circ-RPPH1后乳腺癌耐藥細(xì)胞系細(xì)胞周期

表1 敲低circ-RPPH1表達(dá)后乳腺癌耐藥細(xì)胞系細(xì)胞周期變化

2.11 circ-RPPH1與miR-146b-3p之間存在靶向調(diào)控關(guān)系

經(jīng)circular RNA interactome數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)circ-RPPH1直接關(guān)聯(lián)的miRNAs，預(yù)測(cè)circ-RPPH1與miR-146b-3p之間具有靶向關(guān)系，見(jiàn)圖13。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，野生型circ-RPPH1與miR-146b-3p結(jié)合后熒光數(shù)減少，提示野生型circ-RPPH1與miR-146b-3p結(jié)合且結(jié)合后下調(diào)miR-146b-3p啟動(dòng)子表達(dá)，見(jiàn)表2；RIP法檢測(cè)circ-RPPH1與miR-146b-3p關(guān)系表明，circ-RPPH1可與miR-146b-3p相結(jié)合，見(jiàn)表3。紫杉醇耐藥組患者血清miR-146b-3p表達(dá)水平為0.84±0.41，低于敏感組(3.12±0.75)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.109，P<0.001，圖14)；乳腺癌耐藥患者血清中circ-RPPH1與miR-146b-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.754，P<0.001，圖15)。

圖13 circ-RPPH1與miR-146b-3p具有靶向關(guān)系

表2 野生型及突變型circ-RPPH1與miR-146b-3p結(jié)合后熒光數(shù)

表3 circ-RPPH1與miR-146b-3p結(jié)合后IgG、Ago2檢測(cè)

圖14 兩組患者血清miR-146b-3p表達(dá)水平比較

圖15 circ-RPPH1與miR-146b-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)

2.12 miR-146b-3p與MUC19之間存在靶向關(guān)系

用TargetScan對(duì)miR-146b-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，推測(cè)miR-146b-3p與MUC19之間存在一定的靶向關(guān)系，見(jiàn)圖16。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，見(jiàn)野生型MUC19 3′UTR與miR-146b-3p結(jié)合后可檢測(cè)熒光數(shù)量較前減少，提示miR-146b-3p可與野生型MUC19結(jié)合且負(fù)向調(diào)控，見(jiàn)表4。RIP檢測(cè)二者關(guān)系結(jié)果顯示，miR-146b-3p可與MUC19結(jié)合，見(jiàn)表5。紫杉醇耐藥組患者血清MUC19吸光度值高于敏感組(4.73±1.01vs.1.51±0.55)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.961，P<0.001，圖17)；乳腺癌耐藥患者血清MUC19與miR-146b-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.562，P<0.001，圖18)。

圖16 miR-146b-3p與MUC19之間存在靶向關(guān)系

表4 miR-146b-3p與野生型及突變型MUC19結(jié)合后熒光數(shù)

表5 miR-146b-3p與MUC19結(jié)合后IgG、Ago2檢測(cè)

圖17 兩組患者血清MUC19吸光度值比較

圖18 MUC19與miR-146b-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)

2.13 敲低circ-RPPH1腫瘤的生長(zhǎng)情況

敲低circ-RPPH1后23 d，sh-circ-RPPH1組腫瘤體積較sh-NC組縮小[(410±90)mm3vs.(890±130)mm3]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.263，P=0.006，圖19、20)；sh-circ-RPPH1組瘤體質(zhì)量較sh-NC組降低[(400±120)mgvs.(840±160)mg]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.812，P=0.019，圖21)；sh-circ-RPPH1組腫瘤中circ-RPPH1表達(dá)水平較sh-NC組下降(0.39±0.07vs.1.00±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.267，P<0.001)。

圖19 裸鼠腫瘤照片

圖20 腫瘤體積變化

圖21 腫瘤質(zhì)量變化

3 討論

乳腺癌耐藥仍是制約乳腺癌治療的一大瓶頸，其分子作用機(jī)制尚不完全明確，探究乳腺癌耐藥的發(fā)生機(jī)制，尋找新的標(biāo)志物來(lái)有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥，對(duì)于降低乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及提高生存率具有重要意義?，F(xiàn)已證實(shí)外泌體是細(xì)胞通訊中重要的調(diào)節(jié)者，其主要參與細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信息交流，在多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)外泌體參與調(diào)控乳腺癌耐藥過(guò)程，如Tang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體HOTAIR具有作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，HOTAIR高表達(dá)與乳腺癌患者生存率和化療敏感性顯著相關(guān)。Zheng等[14]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體lnc-AGAP2-AS1在曲妥珠單抗乳腺癌耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高，抑制lnc-AGAP2-AS1的表達(dá)可以增加化療敏感性，含lnc-AGAP2-AS1的外泌體與敏感細(xì)胞共培養(yǎng)可減少曲妥珠單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌耐藥細(xì)胞中l(wèi)nc-H19的表達(dá)增加，抑制H19可有效降低細(xì)胞活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并顯著降低乳腺癌對(duì)阿霉素的耐藥性。此外，細(xì)胞外的H19可以通過(guò)與外泌體結(jié)合轉(zhuǎn)移到敏感細(xì)胞。用耐藥細(xì)胞的外泌體處理敏感細(xì)胞可增加敏感細(xì)胞的耐藥性，而下調(diào)敏感細(xì)胞中的H19則可增加細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。Dong等[16]發(fā)現(xiàn)外泌體lnc-SNHG14能夠參與調(diào)節(jié)曲妥珠單抗的耐藥性，外泌體lnc-SNHG14可能通過(guò)靶向Bcl 2/BAX信號(hào)通路來(lái)影響曲妥珠單抗的化療敏感性。本研究結(jié)果顯示，circ-RPPH1在乳腺癌患者血清、乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)升高，特別在紫杉醇耐藥細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX中表達(dá)明顯增高；circ-RPPH1由外泌體包裹轉(zhuǎn)運(yùn)，circ-RPPH1表達(dá)量可影響乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性，提示circRNA與腫瘤耐藥密切相關(guān)，有望成為一種新型生物標(biāo)志物及臨床治療靶點(diǎn)。

目前大量研究發(fā)現(xiàn)circRNA參與調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[17]。Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲低circ-ABCB10可促進(jìn)乳腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，抑制紫杉醇耐藥細(xì)胞的侵襲和自噬，其作用機(jī)制是circ-ABCB10通過(guò)海綿化let-7a-5p影響DUSP7的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)紫杉醇耐藥細(xì)胞的敏感性、凋亡、侵襲及自噬等過(guò)程。Liang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，circ-KDM4C在乳腺癌組織中表達(dá)降低，且較低的circ-KDM4C表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后和轉(zhuǎn)移有關(guān)，且circ-KDM4C在體內(nèi)外都能顯著抑制乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移及阿霉素耐藥性，其作用機(jī)制是circ-KDM4C通過(guò)靶向miR-548p/PBLD軸影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程。Liang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，circ-BMPR2在乳腺癌轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)較低，circ-BMPR2的表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的活力呈負(fù)相關(guān)；功能研究發(fā)現(xiàn)敲低circ-BMPR2可有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，下調(diào)circ-BMPR2可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫西芬的耐藥性；機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)circ-BMPR2可能作為miR-553的海綿發(fā)揮作用，進(jìn)而減輕對(duì)USP4的抑制，從而抑制乳腺癌的進(jìn)展及其對(duì)他莫西芬的耐藥。Sang等[21]建立耐他莫西芬的MCF-7細(xì)胞株，并通過(guò)RNA測(cè)序?qū)ζ洵h(huán)狀RNA表達(dá)譜進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0025202在耐藥細(xì)胞株和腫瘤組織中表達(dá)較低，功能研究證實(shí)hsa_circ_0025202可以抑制細(xì)胞增殖、集落形成和遷移，增加細(xì)胞凋亡和對(duì)他莫西芬的敏感性。機(jī)制研究證實(shí)hsa_circ_0025202可海綿化miR-182-5p調(diào)控FOXO3a的表達(dá)從而發(fā)揮抑瘤作用以及增加對(duì)他莫西芬的敏感性。上述研究為circRNA在乳腺癌中的研究奠定重要基礎(chǔ)。本研究顯示干擾circ-RPPH1的表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231及乳腺癌耐紫杉醇細(xì)胞系MCF-7/PTX、MDA-MB-231/PTX的增殖、遷移、侵襲能力下降，細(xì)胞合成受阻，提示circ-RPPH1與乳腺癌發(fā)展存在密切關(guān)系，本研究也通過(guò)體外裸鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)。同時(shí)本研究通過(guò)使用TargetScan、interactome預(yù)測(cè)circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19之間存在一定的靶向關(guān)系，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該推測(cè)。

綜上所述，circ-RPPH1通過(guò)外泌體包裹轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控circ-RPPH1/miR-146b-3p/MUC19通路軸對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞株生物學(xué)功能的影響，在調(diào)控乳腺癌耐藥細(xì)胞耐藥、增殖、克隆、遷移和侵襲能力等方面發(fā)揮重要作用；敲低circ-RPPH1表達(dá)可抑制乳腺腫瘤生長(zhǎng)。