李 瑩 陳建玲 吳佩蔚 黃亞哲 張 帥 劉 晴

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡女性常見(jiàn)的內(nèi)分泌失調(diào)疾病，臨床表現(xiàn)呈高度異質(zhì)性，常見(jiàn)有肥胖癥、高雄激素癥、無(wú)排卵、多毛和精神問(wèn)題等。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，育齡期女性中PCOS發(fā)生率為8%～13%[1]。研究表明，卵泡發(fā)育障礙是PCOS的主要原因[2]。卵巢顆粒細(xì)胞是卵泡發(fā)育重要的支持細(xì)胞，正常情況下卵巢細(xì)胞增殖和自噬、凋亡處于平衡狀態(tài)[3]。而卵巢顆粒細(xì)胞自噬異常激活可能會(huì)導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯，從而導(dǎo)致PCOS的發(fā)生[4]。有研究表明，通過(guò)抑制PCOS卵泡顆粒細(xì)胞過(guò)度自噬，可改善卵巢功能[5]。抑癌基因P53/AMP活化蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞自噬起到雙向的調(diào)節(jié)作用可參與調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞自噬，可作為PCOS治療藥物的新靶點(diǎn)，為PCOS、不孕癥等婦科疑難病癥臨床診療提供新思路[6]。車(chē)前子為常用中藥材，常和其他藥物配伍用于治療PCOS[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立PCOS大鼠模型，探究車(chē)前子醇提物對(duì)PCOS改善作用及可能作用機(jī)制，旨在為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:(1)動(dòng)物:雌性SPF級(jí)SD大鼠125只，8周齡，體質(zhì)量200～220g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002。采用獨(dú)立通風(fēng)籠具分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～24℃，相對(duì)濕度為40%～60%，每天光照10h。(2)試劑與儀器:車(chē)前子醇提物95%，購(gòu)自陜西鳳棲梧生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium salt，CMC-Na)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；來(lái)曲唑購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；自噬阻斷劑3MA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)一抗、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase，p-AMPK)、抑癌基因p53和微管結(jié)合蛋白輕鏈3B(LC3B)一抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自中國(guó)BioBase公司；EPS300型蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；石蠟包埋機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法:(1)PCOS大鼠模型建立:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，取24只作為對(duì)照組，用普通飼料飼養(yǎng)，并用超純水配制成0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CMC-Na溶液，按照100g/ml灌胃，每天1次。取剩余101只大鼠構(gòu)建PCOS模型：使用高脂飼料喂養(yǎng)，并將1mg/(kg·d)的來(lái)曲唑溶于0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CMC-Na溶液中配制成來(lái)曲唑混懸液，按照100g/ml灌胃，每天1次，連續(xù)21天[8]。于造模第10天起，取大鼠陰道分泌物，制備涂片，若無(wú)完整動(dòng)情周期，則視為造模成功[9]。(2)分組及干預(yù)方法：建模成功的96只大鼠按體質(zhì)量排序編號(hào)，利用計(jì)算機(jī)生成隨機(jī)數(shù)分成4組，分別為模型組(n=24)、3MA組(n=24)、車(chē)前子醇提物低劑量組(n=24)和車(chē)前子醇提物高劑量組(n=24)。建模成功的第2天，開(kāi)始灌胃給藥。低劑量組按10mg/(kg·d)灌胃車(chē)前子醇提物，高劑量組按20mg/(kg·d)灌胃車(chē)前子醇提物，3MA組按10mg/(kg·d)灌胃自噬阻斷劑3MA，對(duì)照組和模型組灌胃相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續(xù)14天[10]。(3)大鼠血清性激素水平檢測(cè)：末次灌藥后24h，腹主動(dòng)脈采血4ml，4℃放置2h，離心半徑40cm，3000r/min離心20min，取上清液[11]。用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)法，450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T)及雌二醇(estradiol，E2)水平。(4)卵巢組織病理觀察:每組取8只大鼠，用30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉大鼠，刨腹取出新鮮卵巢組織，10%中性甲醛浸泡固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，約4μm厚度，脫蠟、水化，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察大鼠卵巢組織病理形態(tài)變化。(5)卵巢顆粒細(xì)胞自噬率檢測(cè):每組取8只大鼠，將卵巢組織取出后用磷酸緩沖液(phosphate buffer，PBS)沖洗3次，每次5min。剔除脂肪組織，刺破卵泡，用吸管將卵母細(xì)胞吸出，收集顆粒細(xì)胞，PBS沖洗，200目篩過(guò)濾。離心半徑10cm，800r/min離心5min。取下層沉淀物，PBS清洗3次，加入完全培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/毫升。用濃度0.05mmol/L單丹磺酰尸胺(dansylcadaverine，MDC)染色，37℃溫育60min，之后用PBS清洗。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞的自噬率[12]。(6)卵巢組織LC3B、p53、p-mTOR、p-AMPK蛋白的表達(dá)：每組取8只大鼠，采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法，取卵巢組織勻漿，并以PBS沖洗，于4℃下，離心半徑60cm，12000r/min離心15min，棄去上清夜。研磨、離心、提取總蛋白，BCA試劑盒定量檢測(cè)蛋白質(zhì)。定量后每孔10μl上樣電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1h，一抗4℃過(guò)夜孵育，蛋白稀釋濃度為L(zhǎng)C3B(1∶1000)、p53(1∶1000)、mTOR(1∶2000)、p-mTOR(1∶1000)、AMPK(1∶2000)、p-AMPK(1∶2000)、GAPDH(1∶2000)，二抗室溫?fù)u床孵育2h，蛋白稀釋濃度為二抗(1∶5000)。以ECL顯色，暗室曝光、顯影和定影，采用Quantity One軟件測(cè)定蛋白條帶的光密度值[13]。

結(jié) 果

1.各組大鼠血清性激素水平:大鼠血清性激素水平多組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組、3MA組、車(chē)前子醇提物低、高劑量組大鼠血清LH、T和FSH水平升高，E2水平降低(P<0.05)。與模型組比較，車(chē)前子醇提物低、高劑量組和3MA組血清LH、T和FSH水平降低，E2水平升高(P<0.05)。各組與模型組比較的指標(biāo)變化中，3MA組指標(biāo)變化高于車(chē)前子醇提物低劑量組，低于車(chē)前子醇提物高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 大鼠血清性激素水平比較

2.卵巢組織病理學(xué)變化觀察:對(duì)照組細(xì)胞規(guī)整，排列整齊，可見(jiàn)不同發(fā)育時(shí)期的各種形態(tài)卵泡，大多均可見(jiàn)卵丘，顆粒細(xì)胞可達(dá)8～9層，可見(jiàn)多個(gè)黃體；模型組細(xì)胞極度不規(guī)整，囊狀擴(kuò)張卵泡和閉鎖卵泡數(shù)目增多，顆粒細(xì)胞僅1～2層，僅有極少量黃體組織； 3MA組卵泡結(jié)構(gòu)輕微混亂，顆粒細(xì)胞5～6層，有黃體組織；車(chē)前子醇提物低劑量組卵泡結(jié)構(gòu)混亂，顆粒細(xì)胞3～4層，有少量黃體組織；車(chē)前子醇提物高劑量組卵泡少部分結(jié)構(gòu)不清，顆粒細(xì)胞可達(dá)7～8層，有較多黃體組織，可見(jiàn)卵丘(圖1)。

圖1 卵巢組織病理學(xué)觀察(HE，×200)A.對(duì)照組;B.模型組;C.3MA組;D.車(chē)前子醇提物低劑量組;E.車(chē)前子醇提物高劑量組

3.卵巢顆粒細(xì)胞自噬率對(duì)比較：卵巢顆粒細(xì)胞自噬率多組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組(7.11%±1.36%)比較，模型組(19.83%±2.85%)、3MA組(12.01%±1.32%)、車(chē)前子醇提物低(14.02%±1.83%)、高(9.23%±1.12%)劑量組自噬率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，3MA組及車(chē)前子醇提物低、高劑量組自噬率有所下降(P<0.05)；3MA組自噬率低于車(chē)前子醇提物低劑量組，高于車(chē)前子醇提物高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4.顆粒細(xì)胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、p53、p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響:顆粒細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ、p53、p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)水平多組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK蛋白表達(dá)顯著升高，p53、p-mTOR蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，3MA組及車(chē)前子醇提物低、高劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK蛋白表達(dá)降低，p53、p-mTOR蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。各組與模型組比較的蛋白表達(dá)水平變化量中，3MA組蛋白表達(dá)水平變化量高于車(chē)前子醇提物低劑量組，低于車(chē)前子醇提物高劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2、圖2)。

表2 各組p-AMPK、p-mTOR、p53、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖2 車(chē)前子醇提物對(duì)顆粒細(xì)胞中LC3Ⅱ、p53、p-mTOR、p-AMPK蛋白表達(dá)的影響1～5分別為對(duì)照組、模型組、3MA組、車(chē)前子醇提物低劑量組、車(chē)前子醇提物高劑量組

討 論

PCOS病因不明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。中醫(yī)認(rèn)為PCOS主要是脾、肝、腎三臟及沖任二脈功能失調(diào)所致，常選用穴位埋線、針灸，或健脾化痰、補(bǔ)腎疏肝、調(diào)理沖任治療。西醫(yī)認(rèn)為，其主要與高雄激素血癥、慢性炎癥及胰島素抵抗密切相關(guān)，常采用避孕藥、胰島素增敏劑，或生活干預(yù)、手術(shù)治療[14]。車(chē)前子在治療PCOS時(shí)常配合其他藥物一起服用，具有清熱利尿、滲濕止渴、祛痰消炎、降血糖的功效[15,16]。探究其作用機(jī)制，有利于中西醫(yī)結(jié)合在臨床的應(yīng)用。

本研究通過(guò)血清性激素含量測(cè)定、卵巢組織病理學(xué)變化觀察、卵巢顆粒細(xì)胞自噬率變化可以看出，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清性激素水平失調(diào)，卵巢組織發(fā)生雙側(cè)卵巢明顯增大、出現(xiàn)大小不一的卵泡等病變，卵巢顆粒細(xì)胞自噬率升高等現(xiàn)象；經(jīng)過(guò)車(chē)前子醇提物及3MA作用后，血清LH、T和FSH有所降低，E2有所回升，卵巢組織病變程度減輕，顆粒細(xì)胞自噬降低，說(shuō)明車(chē)前子醇提物可調(diào)節(jié)性激素水平，減輕卵巢病變，減少顆粒細(xì)胞自噬，可以一定程度上緩解PCOS病癥，且PCOS大鼠的病情與車(chē)前子醇提物的劑量也有一定關(guān)系，與車(chē)前子醇提物低劑量組比較，車(chē)前子高劑量組大鼠病情越輕。邢玉等[17]研究含有車(chē)前子的歸術(shù)益坤方可通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵基因表達(dá)，來(lái)抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞自噬。黃玉華等[18]使用車(chē)前子作為重要藥材治療PCOS，以往的研究也證實(shí)了車(chē)前子對(duì)PCOS的有效性。

自噬是一種精確調(diào)節(jié)的細(xì)胞程序，多條通路在自噬過(guò)程中發(fā)揮重要作用。p53/AMPK信號(hào)通路是調(diào)控自噬的重要通路，p53是一種抑癌基因，與細(xì)胞自噬性死亡相關(guān)，AMPK是真核細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器，與細(xì)胞能量生成、凋亡和自噬等過(guò)程有關(guān)，mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、存活和自噬等上游通路的匯合點(diǎn)，在自噬過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。自噬通常是AMPK激活和mTOR失活的結(jié)果，在AMPK/mTOR通路中，AMPK在細(xì)胞內(nèi)被激活后，可磷酸化活化下游mTOR，進(jìn)而觸發(fā)自噬[19]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)p53累積時(shí)，AMPK/mTOR通路信號(hào)減弱，抑制細(xì)胞自噬[20]。LC3是自噬相關(guān)蛋白，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化是發(fā)生自噬的表現(xiàn)[21]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組p53和p-mTOR蛋白表達(dá)水平下降，p-AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)上升，通過(guò)車(chē)前子醇提物及自噬阻斷劑3MA的作用，p53和p-mTOR蛋白表達(dá)水平上升，p-AMPK和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平下降，且高劑量組的作用效果優(yōu)于低劑量組，與3MA效果一致，說(shuō)明車(chē)前子醇提物起到了調(diào)節(jié)p53/AMPK信息通路自噬因子的作用，調(diào)控效果與以往研究相符[22]。綜上所述，車(chē)前子醇提物可能通過(guò)調(diào)控p53/AMPK信號(hào)通路來(lái)抑制PCOS大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的自噬，這可能是車(chē)前子醇提物治療PCOS的新機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)從宏觀、微觀上研究車(chē)前子醇提物對(duì)PCOS大鼠的影響作用。宏觀上車(chē)前子醇提物可改善卵巢中性激素水平，減輕病變，降低自噬率。微觀上，通過(guò)對(duì)p53/AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)了改變，說(shuō)明車(chē)前子醇提物減少PCOS顆粒細(xì)胞自噬，可能與調(diào)控p53/AMPK信號(hào)通路有關(guān)。另外，本研究每只動(dòng)物建模和末次灌胃存在時(shí)間差，檢測(cè)數(shù)據(jù)可能存在偏倚，進(jìn)一步的研究中應(yīng)盡量使動(dòng)物的干預(yù)時(shí)間保持一致，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，車(chē)前子醇提物是否存在其他調(diào)控通路，尚需進(jìn)一步研究。