平明芳 楊霞 劉偉榮 顧偉忠 舒小莉 江米足

慢性咳嗽是影響人們生活質(zhì)量的最常見的臨床問題之一，全世界約有10%的人受到慢性咳嗽的困擾[1-3]。胃食管反流性咳嗽（gastroesophageal reflux cough,GERC）是引起慢性咳嗽的三大病因之一[4]。胃食管反流的主要病理生理特征是酸反流，抑酸治療可使部分GERC患者咳嗽癥狀得到緩解，但也有很大一部分患者即使抗酸治療仍有持續(xù)的咳嗽癥狀[5-7]。目前抗酸治療無效的GERC是臨床上一個棘手的問題[8-9]。GERC主要與食管-支氣管神經(jīng)反射及氣道高反應(yīng)性有關(guān)，兩者均與迷走神經(jīng)通路介導的神經(jīng)反射引起氣道神經(jīng)源性炎癥相關(guān)[10-11]，但具體的通路及機制尚不清楚。本研究通過建立GERC大鼠模型，觀察迷走神經(jīng)C傳入纖維通路在GERC中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 普通級健康雄性Wistar新生大鼠45只，體質(zhì)量5～6 g，購于浙江大學實驗動物中心，所有新生大鼠均喂養(yǎng)至8周。飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境下，實驗過程中所有的操作都嚴格遵守《實驗動物管理條例》。

1.2 儀器與試劑 微量紫外分光光度計（Nano-Drop?ND-1000）、ABI 7500熒光定量PCR儀（美國賽默飛公司）；辣椒素（上海廣銳生物科技有限公司）；胃蛋白酶、瓊脂糖、烏拉坦、乙酰甲膽堿（methacholine,Mch）（日本Sigma公司）；鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)集團）；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate,DEPC）水（上海生物工程技術(shù)有限公司）；6×電泳上樣緩沖液、SYBR Premix Ex TaqⅡ（Perfect Real Time）、引物、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、支氣管激發(fā)試驗相關(guān)試劑（日本Takara公司）。

1.3 造模方法和分組 采用隨機數(shù)字表法將45只大鼠分為4組，R1組大鼠10只，實驗過程中死亡1只；R2組大鼠10只，實驗過程中死亡3只；R3組大鼠15只，實驗過程中死亡6只；R4組大鼠10只，實驗過程中死亡2只。R1組：陽性對照組（鹽酸灌注組）；R2組：暫時性食管迷走神經(jīng)C傳入纖維變性型實驗組；R3組：持久性食管迷走神經(jīng)C傳入纖維變性型實驗組；R4組：陰性對照組（0.9%氯化鈉溶液灌注組）。每次實驗操作前，各組大鼠灌注鹽酸之前均先腹腔注射500 mg/kg鹽酸氯胺酮注射液進行輕度麻醉，然后用5 F胃管經(jīng)口插至食管中下段，并將微量注射泵與胃管外端相連。R1組：新生大鼠飼養(yǎng)到8周齡后將濃度0.1 mol/L鹽酸溶液置于注射泵中緩慢灌注，速率為18 ml/h，20 min/次，1次/d，連續(xù)2周。R2組：新生鼠飼養(yǎng)到8周齡后皮下注射50 mg/kg辣椒素，連續(xù)2 d，連續(xù)酸灌注2周（灌注方式同R1組）。R3組：新生鼠生后2 d皮下注射50 mg/kg辣椒素，連續(xù)2 d，8周齡后連續(xù)酸灌注2周（灌注方式同R1組）。R4組：新生大鼠飼養(yǎng)到8周齡后連續(xù)食管內(nèi)0.9%氯化鈉溶液灌注2周（灌注方式同R1組）。

1.4 支氣管激發(fā)試驗 最后1次食管灌注24 h后，使用25%烏拉坦（按1.2 mg/kg劑量）腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后完成氣管插管，并將大鼠移到體積描記器內(nèi)。通過分析體積描記器相連接的生物信號記錄測定跨肺壓、基礎(chǔ)潮氣量及氣道流速，然后將0.9%氯化鈉溶液、Mch分別裝入霧化罐后連接氣管插管霧化刺激大鼠30 s，Mch 激發(fā)濃度分別為 0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mmol/L，觀察用不同濃度Mch行支氣管激發(fā)試驗后大鼠的跨肺壓、潮氣量及氣道流速的變化情況。計算公式：肺阻力（cmH2O·ml-1·s-1）=跨肺壓/氣道流速；動態(tài)肺順應(yīng)性（ml/cmH2O）=潮氣量/跨肺壓；肺阻力增加百分比=（激發(fā)后肺阻力-基礎(chǔ)肺阻力）/基礎(chǔ)肺阻力×100%；動態(tài)肺順應(yīng)性減少百分比=（基礎(chǔ)動態(tài)肺順應(yīng)性-激發(fā)后動態(tài)肺順應(yīng)性）/基礎(chǔ)動態(tài)肺順應(yīng)性×100%。

1.5 標本收集與病理檢查 各組小鼠在完成激發(fā)試驗后，腹腔注射25%烏拉坦（按0.6 mg/kg劑量）補充麻醉，斷頭處死。取氣管組織、右側(cè)肺近肺門約0.5 cm處肺組織及食管下端近括約肌處0.5 cm食管組織，放在10%多聚甲醛中12 h，固定，用石蠟包埋、切片、制片，并用HE染色處理標本。

1.6 肺組織神經(jīng)激肽受體1（neurokinin 1 receptor,NK1R）、神經(jīng)激肽受體2（neurokinin 2 receptor,NK2R）、神經(jīng)激肽受體3（neurokinin 3 receptor,NK3R）及食管組織5-羥色胺受體3（5-hydroxytyptamine receptor 3，5-HT3R）、瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid receptor 1,TRPV1）、酸敏感離子通道3（acid-sensing ion channel 3,ASIC3）mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。采用Trizol法分別提取肺組織和食管組織總RNA，嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。用微量紫外分光光度計（NanoDrop?ND-1000）檢測肺組織、食管組織總RNA純度和含量。6個目的基因的上下游引物序列及產(chǎn)物長度見表1。在ABI 7500型實時熒光定量PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計算 NK1R、NK2R、NK3R、5-HT3R、TRPV1和 ASIC3 mRNA表達水平。

表1 6個基因的上下游引物序列及產(chǎn)物長度

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠肺阻力及順應(yīng)性的變化與比較 當Mch濃度升到0.25、0.5 mmol/L時，R1組大鼠肺阻力增加百分比明顯大于R2組、R3組、R4組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。當Mch濃度升到0.5 mmol/L時，R1組大鼠動態(tài)肺順應(yīng)性減少百分比大于R2組、R3組及R4組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示大鼠氣道反應(yīng)性增高，見圖1。

圖1 Mch刺激后4組大鼠肺阻力和肺順應(yīng)性的變化與比較

2.2 4組大鼠氣管、肺和食管組織病理學改變的比較 病理檢查發(fā)現(xiàn)，與R2、R3和R4組比較，R1組大鼠氣管組織、肺組織及食管組織的炎癥性病變更為明顯，見圖2-4。

圖2 4組大鼠氣管組織病理變化的比較（a：R1組氣管組織纖毛柱狀上皮增生增厚明顯，排列紊亂，部分脫落，黏膜下層血管出血性充血明顯，炎癥細胞浸潤明顯；b-c：R2、R3組氣管纖毛柱狀上皮有少許脫落，有少許炎癥細胞浸潤；d：R4組氣管結(jié)構(gòu)清晰，白細胞分類基本正常，未見明顯炎癥細胞浸潤和血管充血；HE染色，×100）

圖3 4組大鼠肺組織病理變化的比較（a：R1組肺組織的炎癥細胞浸潤明顯增多，小氣道管壁增厚，氣道狹窄，分泌物增多；b-c：R2、R3組肺組織中炎癥細胞輕度增多；d：R4組肺泡結(jié)構(gòu)正常；HE染色，×100）

圖4 4組大鼠食管組織病理變化的比較（a：R1組食管鱗狀上皮增厚，上皮基底層乳頭延長，固有層炎癥細胞浸潤明顯；b-c：R2、R3組食管鱗狀上皮輕度增厚，上皮基底層呈波浪形，固有層見輕度炎癥細胞浸潤；d：R4組食管鱗狀上皮結(jié)構(gòu)基本正常，炎癥細胞不明顯；HE染色，×100）

2.3 4組大鼠肺組織中NK1R、NK2R、NK3R mRNA表達水平比較 4組大鼠肺組織中NK1R、NK2R mRNA表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），R3組大鼠肺組織中NK3R mRNA表達水平高于R1組、R2組和R4組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖5。

圖5 4組大鼠肺組織中NK1R、NK2R、NK3R mRNA表達水平比較

2.4 4組大鼠食管組織中5-HT3R、TRPV1和ASIC3 mRNA表達水平比較 4組大鼠食管組織中5-HT3R、TRPV1和ASIC3 mRNA表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖6。

圖6 4組大鼠食管組織中5-HT3R、TRPV1和ASIC3 mRNA表達水平比較

3 討論

現(xiàn)有研究表明GERC發(fā)病的機制包括食管-支氣管神經(jīng)反射及氣道高反應(yīng)性[12]，它們均與迷走神經(jīng)C傳入纖維通路有關(guān)[13]。迷走神經(jīng)支氣管肺C類神經(jīng)纖維是一種廣泛分布在支氣管、肺部的傷害感受器，它對許多炎癥介質(zhì)如緩激肽、5-羥色胺及TRPV1受體激活劑特別敏感[14]。觸發(fā)支氣管肺C纖維傷害感受器可引起神經(jīng)肽如P物質(zhì)（substance P,SP）、神經(jīng)肽A（neurokinin A,NKA）、神經(jīng)肽B（neurokinin B,NKB）的釋放，當神經(jīng)肽物質(zhì)大量釋放時可以誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥，主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、黏液分泌增加、心動過緩甚至呼吸暫停。臨床研究表明GERC患者質(zhì)子泵抑制劑及促胃動力劑治療4周后，如果咳嗽明顯緩解、血漿和痰SP水平明顯增高，需考慮與神經(jīng)源性炎癥相關(guān)[15]。動物實驗發(fā)現(xiàn)給豚鼠及兔的食管灌注鹽酸，可以激發(fā)其氣道神經(jīng)源性炎癥，當使用NK1R和NK3R阻斷劑后可以明顯抑制這種炎癥的產(chǎn)生[16-18]。既往研究認為迷走神經(jīng)傳入通路中的感覺纖維也在調(diào)節(jié)咳嗽反射中起著重要作用[19]。Chen等[20]在豚鼠的食管下段內(nèi)注射鹽酸溶液，發(fā)現(xiàn)行迷走神經(jīng)切斷術(shù)組豚鼠血漿中SP濃度和氣道微血管滲漏均低于其他組，表明迷走神經(jīng)可能介導了由食管-支氣管反射引起的GERC的氣道炎癥。本研究通過對大鼠進行鹽酸食管內(nèi)持續(xù)灌注2周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在顯微鏡下R1組食管鱗狀上皮增厚，上皮基底層乳頭延長，固有層炎癥細胞浸潤明顯。通過支氣管激發(fā)試驗檢測大鼠肺阻力和順應(yīng)性時發(fā)現(xiàn)，當Mch濃度升到0.25及0.5 mmol/L時，R1組大鼠肺阻力增加百分比明顯高于R2、R3和R4組，而當Mch濃度升到0.5 mmol/L時，R1組大鼠動態(tài)肺順應(yīng)性減少百分比明顯高于R2、R3和R4組，上述表型提示鹽酸灌注后大鼠氣道反應(yīng)性增高，對環(huán)境的刺激閾值降低，在受到外界有害的環(huán)境刺激物刺激時更易出現(xiàn)咳嗽及氣促、胸悶等癥狀，提示迷走神經(jīng)通路在GERC中起著重要作用。進一步肺部研究發(fā)現(xiàn)，與其他3組相比，R3組NK3R mRNA表達水平明顯升高，考慮迷走神經(jīng)持久變性后，鹽酸灌注后未能引起大鼠肺內(nèi)NKB增多，而大鼠肺內(nèi)NK3R表達明顯增多，使NKB更容易與NK3R結(jié)合，讓NKB更大地發(fā)揮其作用，提示迷走神經(jīng)C傳入纖維在GERC中的重要作用，綜合迷走神經(jīng)對有害刺激的反應(yīng)，考慮迷走神經(jīng)C傳入纖維是GERC的主要傳入纖維。

綜上所述，大鼠食管酸灌注模型可以引起食管組織的黏膜損傷、氣道高反應(yīng)性以及氣道神經(jīng)源性炎癥。食管酸灌注及持久迷走神經(jīng)C纖維損傷可引起肺組織內(nèi)NK3R增高，迷走神經(jīng)C傳入纖維通路可能在GERC中起著重要作用。本實驗不足之處是未對肺組織內(nèi)的神經(jīng)肽SP、NKA、NKB含量進行直接測定，這將在后續(xù)的研究中進一步完善。