張雁飛 吳中杰 胡奕 丁聰毅

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，具有高復發(fā)率的特點[1]。盡管近年來手術(shù)切除、免疫治療、化療、放療等肺癌治療方式得到不斷改進，但是肺癌患者的預后仍較差[2]。因此，迫切需要尋求新的具有治療價值和預后監(jiān)測價值的分子靶點。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）屬于非編碼RNA分子，長度＞200個核苷酸，其通過在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)特定基因譜的表達，影響細胞表觀遺傳信號傳導，從而參與各種細胞活動[3]。越來越多的研究顯示，lncRNA在肺癌的發(fā)生和進展過程中起到關(guān)鍵作用，在肺癌組織和細胞系中表現(xiàn)為多種lncRNA表達水平的異常降低或升高[4-6]。根據(jù)Ensembl Release v105數(shù)據(jù)庫顯示，RP11-680F8.1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，長度為2 588個核苷酸。RP11-680F8.1在腫瘤特別是肺癌中的表達和作用尚未闡明。本研究通過分析RP11-680F8.1表達水平與肺癌患者總生存期和無病生存期的關(guān)系，檢測肺癌組織和細胞系中RP11-680F8.1的表達，構(gòu)建敲減RP11-680F8.1的肺癌細胞模型，探討RP11-680F8.1調(diào)節(jié)肺癌細胞增殖和侵襲的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系、試劑和儀器 人肺癌細胞系H1650、A549、HCC1588、H1299、HCC827和正常肺泡上皮細胞系HPAEpiC均購自美國ATCC細胞培養(yǎng)中心。FBS、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和基質(zhì)膠均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒均購自北京索萊寶生物科技公司；抗RP11-680F8.1慢病毒、非靶向?qū)φ章《?、RP11-680F8.1-WT載體、RP11-680F8.1-Mut載體、miR-NC、miR-195-5p均購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和Transwell小室均購自美國Invitrogen公司；Ⅰ抗和Ⅱ抗叉頭框K1（forkhead box K1,FOXK1）、磷脂酰肌醇3-磷酸（phosphatidylinositol 3-phosphate,PI3P）、磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B,p-Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體1（mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）、磷酸化血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（phosphorylated serum and glucocorticoid-induced protein kinase 1,p-SGK1）、beta肌動蛋白（beta actin,β-actin）均購自美國Santa Cruz公司。酶標儀（型號：Multiskan?FC）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。凝膠成像儀（型號：ChemiDoc MP）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 臨床標本 收集2021年2月至2022年1月嘉興市第一醫(yī)院心胸外科手術(shù)切除的肺癌組織及相應癌旁組織32對，均經(jīng)至少2位病理科專家確診。所有標本均冷凍保存在液氮中，所有患者術(shù)前均未接受放化療及生物治療。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 生物信息學方法 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析RP11-680F8.1表達水平與肺癌患者總生存期和無病生存期的關(guān)系。采用LncBase Predicted v.2軟件分析RP11-680F8.1與miR-195-5p的靶向關(guān)系。

1.4 細胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 H1650、HCC1588、H1299、HCC827細胞培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，A549和HPAEpiC細胞培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。選擇RP11-680F8.1表達水平最高的HCC1588細胞為研究對象，將對數(shù)生長期的HCC1588細胞接種到6孔板，培養(yǎng)至融合度65%。將HCC1588細胞分別轉(zhuǎn)染抗RP11-680F8.1慢病毒以敲減RP11-680F8.1的表達（sh-RP11-680F8.1組）和非靶向?qū)φ章《荆╯h-NC組）。轉(zhuǎn)染時將 200 μl RPMI 1640 培養(yǎng)基與 10 μl慢病毒混勻，靜置15 min，添加至HCC1588細胞培養(yǎng)基中；72 h后，采用RT-qPCR驗證慢病毒轉(zhuǎn)染后的敲減效率。

1.5 RP11-680F8.1、miR-195-5p和FOXK1 mRNA表達水平檢測 采用RT-qPCR法。采用Trizol試劑分離組織或細胞中的總RNA，進一步反向轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR反應條件：97℃預變性7 min、54℃ 20 s、71℃20 s，共32個循環(huán)。GAPDH用于標準化RP11-680F8.1和FOXK1 mRNA的相對表達，U6用于標準化miR-195-5p的相對表達。RP11-680F8.1上游引物：5'-CCCCAGGTAAGAGGGAAGAG-3'，下 游 引 物 ：5'-CCAACACACCTGTTGGTCAG-3'；FOXK1上游引物：5'-TCCAGGAGCCGCACTTCTA-3'，下游引物：5'-CTCCGGGATGTGGATCTTCA-3'；GAPDH上游引物：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'；U6 上 游 引 物 ：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-195-5p 上游引物 ：5'-GCGTAGCAGCACAGAAATATTGGC-3'，下游引物：5'-CTGTCGTCGTAGAGCCAGGGAA-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 計 算RP11-680F8.1、miR-195-5p和FOXK1 mRNA相對表達水平。

1.6 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將兩組HCC1588細胞以每孔2.5×103個接種至96孔板，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d。每天相同時間點，每孔加入40 μl CCK-8溶液，避光孵育3 h，通過酶標儀分析每孔在450 nm波長處的吸光度（A）值。A值越大，HCC1588細胞增殖能力越強。

1.7 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。將兩組HCC1588細胞以每孔2.5×104個接種至涂有基質(zhì)膠的Transwell上室，在下室中加入500 μl完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，用2%多聚甲醛溶液固定，用0.3%結(jié)晶紫溶液染色。在倒置顯微鏡下拍照，隨機選取5個視野計數(shù)侵襲細胞數(shù)。

1.8 RP11-680F8.1和miR-195-5p的靶向關(guān)系檢測采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。采用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別將RP11-680F8.1-WT+miR-195-5p、RP11-680F8.1-WT+miR-NC、RP11-680F8.1-Mut+miR-195-5p、RP11-680F8.1-Mut+miR-NC共轉(zhuǎn)染HCC1588細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，采用裂解液裂解細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測每組細胞的相對熒光素酶活性。

1.9 FOXK1蛋白水平和PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號通路蛋白水平檢測 采用Western blot法。棄去細胞培養(yǎng)基，加入細胞裂解液，采用細胞刮收集細胞裂解物。以恒壓120 V經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，以恒流200 mA轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。在10%脫脂牛奶中常溫封閉3.5 h，經(jīng)TBST溶液洗膜，加入Ⅰ抗FOXK1抗體（1∶2 000）、PI3P（1∶2 500）、p-Akt（1∶3 500）、mTORC1（1∶3 500）、p-SGK1（1∶3 500）、β-actin（1∶3 000），冰箱內(nèi)孵育 15 h。經(jīng)TBST溶液洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（1∶20 000），室溫孵育3.5 h。經(jīng)TBST溶液洗膜，加入增強化學發(fā)光液，在凝膠成像儀中曝光、顯影。使用Image J軟件計算各個條帶的灰度值，即蛋白表達水平。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同RP11-680F8.1表達水平肺癌患者總生存期和無病生存期比較 GEPIA數(shù)據(jù)庫資料分析顯示，與RP11-680F8.1高表達患者相比，RP11-680F8.1低表達患者總生存期和無病生存期均較長（均P＜0.01），見圖1。

圖1 不同RP11-680F8.1表達水平肺癌患者總生存期和無病生存期比較（a：總生存期；b：無病生存期）

2.2 RP11-680F8.1在肺癌組織和肺癌細胞系中的表達 與癌旁組織相比，肺癌組織中RP11-680F8.1表達水平明顯上調(diào)（1.48±0.12比5.53±0.24，P＜0.01），見圖2。與正常肺泡上皮細胞系HPAEpiC相比，肺癌細胞系H1650、A549、HCC1588、H1299、HCC827中RP11-680F8.1表達水平均上調(diào)（均P＜0.05），其中HCC1588細胞中RP11-680F8.1表達水平最高，見圖3。

圖2 肺癌組織和癌旁組織中RP11-680F8.1表達水平比較

圖3 不同肺癌細胞中RP11-680F8.1表達水平比較

2.3 轉(zhuǎn)染抗RP11-680F8.1慢病毒的敲減效率 在HCC1588細胞中轉(zhuǎn)染抗RP11-680F8.1慢病毒和非靶向?qū)φ章《竞?，sh-NC組和sh-RP11-680F8.1組細胞中RP11-680F8.1表達水平分別為7.50±0.75和1.02±0.10，與sh-NC組相比，sh-RP11-680F8.1組細胞中RP11-680F8.1表達水平明顯下降（P＜0.01）。

2.4 敲減RP11-680F8.1表達對HCC1588細胞增殖能力的影響 sh-RP11-680F8.1組細胞在2、3、4、5 d時的增殖能力均明顯低于sh-NC組（均P＜0.05），見圖4，提示敲減RP11-680F8.1表達降低了HCC1588細胞增殖能力。

圖4 敲減RP11-680F8.1表達對HCC1588細胞增殖能力的影響

2.5 敲減RP11-680F8.1表達對HCC1588細胞侵襲能力的影響 sh-NC組和sh-RP11-680F8.1組侵襲細胞數(shù)分別為（70.56±4.71）和（37.33±8.32）個/視野，sh-NC組侵襲細胞數(shù)明顯多于sh-RP11-680F8.1組（P＜0.05），見圖5，提示敲減RP11-680F8.1表達抑制了HCC1588細胞侵襲能力。

圖5 敲減RP11-680F8.1表達對HCC1588細胞侵襲的影響（a：侵襲細胞染色圖；b：侵襲細胞數(shù)柱狀統(tǒng)計圖，與sh-NC組相比，**P＜0.01）

2.6 RP11-680F8.1和miR-195-5p之間的靶向關(guān)系LncBase Predicted v.2軟件預測顯示，miR-195-5p可能是RP11-680F8.1的靶點，見圖6。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，與共轉(zhuǎn)染miR-NC和RP11-680F8.1-WT相比，共轉(zhuǎn)染miR-195-5p和RP11-680F8.1-WT的HCC1588細胞相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），見圖7，證實miR-195-5p是RP11-680F8.1的直接靶點。

圖6 RP11-680F8.1與miR-195-5p的結(jié)合位點

圖7 RP11-680F8.1與miR-195-5p的靶向關(guān)系

2.7 敲減RP11-680F8.1表達對miR-195-5p和FOXK1 mRNA表達的影響 與sh-NC組相比，sh-RP11-680F8.1組細胞中miR-195-5p表達水平上調(diào)、FOXK1 mRNA表達水平下調(diào)（均P＜0.01），見表1，提示敲減RP11-680F8.1表達促進了miR-195-5p表達，抑制了FOXK1 mRNA表達。

表1 敲減RP11-680F8.1表達對miR-195-5p和FOXK1 mRNA表達的影響

2.8 敲減RP11-680F8.1表達對FOXK1蛋白和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響 與sh-NC組相比，sh-RP11-680F8.1組HCC1588細胞中FOXK1蛋白表達水平降低，PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達水平降低，見圖8。

圖8 敲減RP11-680F8.1后HCC1588細胞FOXK1蛋白和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的電泳圖

3 討論

隨著深度測序的廣泛應用，lncRNA已成為表觀遺傳學研究領(lǐng)域的熱點[7]。lncRNA通過調(diào)節(jié)各種分子信號通路，在細胞的生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，有望成為各種疾病的早期診斷標志物和治療靶標[8]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中存在異常過表達或低表達的lncRNA，與肺癌患者的病理分期、化療敏感性、放療敏感性等密切相關(guān)[9-11]。Feng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PGM5P4-AS1在肺癌組織中的表達低于癌旁組織，其過表達在體外抑制了肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，在體內(nèi)抑制了裸鼠肺癌腫瘤的生長。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA AC079630.4在肺癌組織中顯著下調(diào)，其低表達的樣本比高表達的樣本具有更晚期的病理分期和更差的預后。Cheng等[13]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PSMA3-AS1在肺癌細胞系中的表達明顯高于人支氣管正常上皮細胞，敲低lncRNA PSMA3-AS1通過競爭性結(jié)合miR-17-5p，顯著抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。RP11-680F8.1是一種罕見報道的lncRNA，其在肺癌中的表達和功能尚未被探討。

本研究首先通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析RP11-680F8.1表達水平與肺癌患者總生存期和無病生存期的關(guān)系，證明RP11-680F8.1低表達患者的總生存期和無病生存期均較長，提示RP11-680F8.1可能是促癌lncRNA。本研究進一步顯示，RP11-680F8.1在人肺癌組織和細胞系中高表達，敲減RP11-680F8.1表達能夠抑制體外肺癌細胞的增殖和侵襲，證實RP11-680F8.1是一種癌基因，其可能作為肺癌治療的靶點。先前研究顯示，lncRNA通過競爭性結(jié)合微小RNA，促進腫瘤相關(guān)基因表達[14-16]。本研究使用生物信息學數(shù)據(jù)庫LncBase Predicted v.2分析顯示，miR-195-5p可能與RP11-680F8.1相互作用。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實RP11-680F8.1能夠靶向結(jié)合miR-195-5p。

研究表明，miR-195-5p在前列腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，其表達與患者腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均呈負相關(guān)[17-20]。值得注意的是，Long等[21]發(fā)現(xiàn)miR-195-5p在肺癌組織和肺癌細胞系中下調(diào)，過表達miR-195-5p通過下調(diào)FOXK1基因表達抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究中，敲減RP11-680F8.1表達后，miR-195-5p表達明顯增加，F(xiàn)OXK1 mRNA表達明顯降低，證實RP11-680F8.1通過調(diào)節(jié)miR-195-5p和FOXK1表達發(fā)揮作用。FOXK1基因通過活化PI3K/Akt/mTOR信號通路，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移[22-23]。本研究中，敲減RP11-680F8.1表達后，PI3K/Akt/mTOR信號通路活化被抑制，間接提示RP11-680F8.1發(fā)揮作用依賴于miR-195-5p/FOXK1信號通路。

綜上所述，本研究證實RP11-680F8.1是肺癌中的癌基因，與肺癌患者的總生存期和無病生存期密切相關(guān)。敲減RP11-680F8.1通過上調(diào)miR-195-5p表達，下調(diào)FOXK1 mRNA表達，進而抑制肺癌HCC1588細胞的增殖和侵襲。RP11-680F8.1可能為肺癌的治療和預后監(jiān)測提供了有效的分子靶點。