周琴 孔海波 王艷茹 何保梅

癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus,SE）可導(dǎo)致以海馬組織為主的腦損傷，其病理學(xué)基礎(chǔ)包括細(xì)胞凋亡與壞死[1]。由于SE后的細(xì)胞凋亡具有可調(diào)控性，故其研究日益受到重視[2]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，在SE大鼠的海馬組織中，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4,TLR4）/NF-κB信號(hào)通路被激活，進(jìn)一步促進(jìn)了下游炎癥因子的釋放，提示免疫炎癥反應(yīng)參與了SE后的腦損傷[3]。木犀草素是存在于多種植物中的一種天然黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抑制凋亡等多種生物藥理學(xué)作用[4]。本研究通過(guò)構(gòu)建發(fā)育期SE幼年大鼠（下稱幼鼠）模型，并使用木犀草素干預(yù)，旨在研究木犀草素是否可通過(guò)TLR4/NF-kB信號(hào)通路抑制SE后幼鼠腦內(nèi)海馬組織的免疫炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，從而起到腦保護(hù)的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 21日齡清潔級(jí)雄性SD幼鼠156只，體重50～80g，購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SYXK（浙）2020-0024]。幼鼠飼養(yǎng)在杭州鷹旸生物醫(yī)藥研發(fā)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，相對(duì)濕度70%，溫度25℃，晝夜照明12 h/12 h變化。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)杭州鷹旸生物醫(yī)藥研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)編號(hào)：EYOUNG-20201124-04）。

1.2 試劑和儀器 主要試劑：氯化鋰（批號(hào)：K73036）、匹羅卡品（批號(hào)：K80477）均購(gòu)于美國(guó)Fluka公司；溴化甲基東莨菪堿（批號(hào)：S8502）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；木犀草素（批號(hào)：B20888）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：CW2569）購(gòu)于江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（批號(hào)：RR820A）購(gòu)于日本Takara公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：pc0020）、蛋白marker（批號(hào)：PR1910）均購(gòu)于北京Solarbio科技有限公司；TLR4一抗（批號(hào)：AF7017）和二抗（批號(hào)：S0009）均購(gòu)于美國(guó)Afinity公司。TUNEL試劑盒（批號(hào)：G1501）購(gòu)于武漢Servicebio生物科技有限公司。主要儀器：Micro17R低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO RAD公司；EPS300電泳儀、EPS300電泳槽、VE186轉(zhuǎn)膜儀均購(gòu)自浙江天能公司；610020-9Q化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；RM2016病理切片機(jī)購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司；Nikon Eclipse C1正置熒光顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統(tǒng)均購(gòu)自日本尼康公司。

1.3 動(dòng)物分組與模型制作 （1）動(dòng)物分組：按照隨機(jī)數(shù)字表法將幼鼠分為對(duì)照組12只、模型組48只、木犀草素1組（低劑量20 mg/kg）48只和木犀草素2組（高劑量50 mg/kg）48只，其中模型組、木犀草素1組和木犀草素2組在癲癇發(fā)作后的1、2、3和7 d分別處死12只幼鼠。（2）SE模型制作：采用氯化鋰-匹羅卡品法制作幼鼠SE模型，幼鼠先予127 mg/kg氯化鋰，所有給藥方式均為腹腔注射，18 h后給予1 mg/kg溴化甲基東莨菪堿，30 min后予100 mg/kg匹羅卡品。幼鼠癲癇發(fā)作程度分級(jí)[5]：0級(jí)，無(wú)驚厥發(fā)作；Ⅰ級(jí)，面部抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)，節(jié)律性點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)，前肢陣攣抽搐；Ⅳ級(jí)，全身強(qiáng)直伴站立；Ⅴ級(jí)，全身強(qiáng)直陣攣。驚厥程度達(dá)Ⅳ級(jí)以上，持續(xù)達(dá)30 min，且驚厥后幼鼠一般狀況良好的為合格幼鼠模型。幼鼠癲癇發(fā)作30 min時(shí)給予1 mg/kg阿托品和400 mg/kg水合氯醛，SE后幼鼠給予光照取暖，30 min后予以0.9%氯化鈉注射液和10%葡萄糖注射液各10 ml/kg。對(duì)照組以0.9%氯化鈉注射液取代匹羅卡品，其余用藥均同模型組。木犀草素1組和木犀草素2組在幼鼠驚止后30 min，予不同劑量的木犀草素（20、50 mg/kg），此后每天重復(fù)注射1次，直到處死。

1.4 幼鼠腦標(biāo)本的采取及制作 幼鼠經(jīng)腹腔注射400 mg/kg水合氯醛麻醉，斷頭完整分離出海馬，右側(cè)放入-80℃液氮中保存；左側(cè)置于4%多聚甲醛中固定，脫水、石蠟包埋。

1.5 幼鼠海馬組織中TLR4、NF-κB、半胱氨酸門冬氨酸特異性蛋白酶3（cysteine-containing aspartate-specific proteases-3,Caspase-3）、TNF-α mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取右側(cè)海馬標(biāo)本制作勻漿，TRI Reagent法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，反應(yīng)條件：95 ℃，10 min變性；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；40次循環(huán)。引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TLR4、NF-κB、Caspase-3、TNF-α相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列（5'-3'）

1.6 幼鼠海馬組織中TLR4蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。經(jīng)液氮研磨后的右側(cè)海馬標(biāo)本放入離心管，蛋白定量采用BCA蛋白定量試劑盒，取等量緩沖液與樣本混勻后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗后4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3次，加二抗孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，最后曝光、顯影。目的蛋白的表達(dá)水平以TLR4蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值來(lái)表示。

1.7 幼鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 采用TUNEL法。取石蠟切片，定位于海馬CA1區(qū)，常規(guī)脫蠟脫水后，用蛋白酶K消化，滴加平衡緩沖液，孵育20 min，棄去緩沖液，滴加適量TDT酶、dUTP、buffer按1∶5∶50比例混合液，37℃孵育2 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。最后熒光顯微鏡觀察并采集圖像，顯色藍(lán)色為正常細(xì)胞，綠色為陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞凋亡率=陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，方差齊性時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d各組幼鼠海馬組織中TLR4、NF-κB、Caspase-3、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d模型組幼鼠海馬組織中TLR4、NF-κB、Caspase-3、TNF-α mRNA表達(dá)水平均升高（均P＜0.01）；與模型組比較，癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d木犀草素2組幼鼠海馬組織中TLR4、NF-κB、Caspase-3、TNF-α mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）；癲癇發(fā)作后3和7 d木犀草素1組幼鼠海馬組織中TLR4 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），癲癇發(fā)作后1和3 d木犀草素1組幼鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），癲癇發(fā)作后3 d木犀草素1組幼鼠海馬組織中TNF-α mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.01），見表2。

表2 癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d各組幼鼠海馬組織中TLR4、NF-κB、Caspase-3、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較

2.2 癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d各組幼鼠海馬組織中TLR4蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d模型組幼鼠海馬組織中TLR4蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.01）。與模型組比較，癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d木犀草素2組幼鼠海馬組織中TLR4蛋白表達(dá)水平均降低（均P＜0.01），僅在癲癇發(fā)作后7 d木犀草素1組幼鼠海馬組織中TLR4蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖1和表3。

圖1 癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d各組幼鼠海馬組織中TLR4蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d各組幼鼠海馬組織中TLR4蛋白表達(dá)水平比較

2.3 癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d各組幼鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 與對(duì)照組比較，癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d模型組幼鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均升高（均P＜0.01）；與模型組比較，癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d木犀草素2組幼鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均降低（均P＜0.01），癲癇發(fā)作后2、3和7 d木犀草素1組幼鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均降低（均P＜0.05），見圖2和表4。

圖2 癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d各組幼鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡表達(dá)情況（TUNEL染色，×400）

表4 癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d各組幼鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較（%）

3 討論

SE是小兒時(shí)期最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急危重癥之一，可引起學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知損害，給患兒的生活造成極大影響[6]。海馬是癲癇發(fā)作后腦損傷的重要部位，其主要病理特征是過(guò)度的免疫炎癥，以及神經(jīng)細(xì)胞的壞死、凋亡、丟失等[7]，抑制海馬區(qū)免疫炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)于預(yù)防及減輕癲癇發(fā)作后的腦損傷至關(guān)重要。

TLR4是重要的天然免疫受體，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的免疫應(yīng)答[8]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4可表達(dá)于癲癇小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中[9]，通過(guò)抑制TLR4可預(yù)防毛果蕓香堿誘發(fā)的大鼠癲癇發(fā)作[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SE幼鼠海馬組織中TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，在驚厥后24 h達(dá)到高峰。此結(jié)果說(shuō)明，在SE后的幼鼠海馬組織中，TLR4被迅速激活。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作后1、2、3和7 d幼鼠海馬組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)水平均升高，其變化趨勢(shì)與TLR4基本一致，提示NF-κB在癲癇發(fā)作后也迅速活化，并促使TNF-α的合成與釋放。這一結(jié)果說(shuō)明，TLR4/NF-κB通路參與了幼鼠SE后海馬內(nèi)的免疫炎癥反應(yīng)。

近年來(lái)，木犀草素的神經(jīng)保護(hù)作用日益得到重視[11]。Lin等[12]研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以減少海人酸所致癲癇大鼠的海馬損傷，減輕癲癇發(fā)作的程度，通過(guò)減少谷氨酸水平，減輕炎癥反應(yīng)。在戊四氮所致大鼠和小鼠癲癇模型中，使用木犀草素可以減輕癲癇的發(fā)作時(shí)間和強(qiáng)度，減輕癲癇后期的認(rèn)知損害，減少腦神經(jīng)的氧化應(yīng)激損傷[13-14]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，經(jīng)高劑量的木犀草素干預(yù)后，海馬組織中TLR4、NF-κB、TNF-α表達(dá)水平均有降低，而低劑量的木犀草素干預(yù)效果欠佳。這一結(jié)果提示，木犀草素可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB通路，減輕癲癇發(fā)作后海馬的免疫炎癥反應(yīng)，且高劑量的抑制效果更佳。

Caspase-3在海馬組織凋亡中起最后樞紐作用，是激活凋亡途徑最關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白酶[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在癲癇發(fā)作后24 h Caspase-3 mRNA的表達(dá)已迅速達(dá)到高峰，此后隨時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)水平逐步下降，其變化趨勢(shì)與檢測(cè)到的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率一致，這一結(jié)果表明，SE后幼鼠海馬區(qū)出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡的過(guò)度激活。在癲癇造模后給予高劑量的木犀草素干預(yù)，海馬組織中Caspase-3表達(dá)水平及神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均降低，而低劑量抑制效果有限，提示高劑量的木犀草素能更好地抑制幼鼠SE后海馬組織神經(jīng)細(xì)胞中Caspase-3的激活，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，木犀草素可減輕SE幼鼠海馬組織的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控TLR4/NF-κB通路來(lái)達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。