萬(wàn)思迪， 苗華彪， 韓楠玉,2,3

1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 云南昆明 650500； 2. 生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心， 云南昆明 650500； 3. 云南師范大學(xué)酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南昆明 650500

脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)廣泛存在于微生物、動(dòng)物和植物中，是一類能夠催化酯鍵斷裂和形成的酶[1]。脂肪酶在制革工業(yè)、食品加工、醫(yī)藥用品、日用化工等行業(yè)都具有良好的應(yīng)用前景[2]。雖然脂肪酶廣泛分布于自然界中，但直至1843年科學(xué)家才首次發(fā)現(xiàn)兔胰腺中的脂肪酶，隨后在1854年和1864年又分別發(fā)現(xiàn)了胃脂肪酶和豬胰脂肪酶[3]，微生物脂肪酶一直到1901年才被發(fā)現(xiàn)[4]。由于微生物具有種類繁多、易于操作、生長(zhǎng)周期短、底物專一性強(qiáng)，并且具有較廣的pH和溫度適應(yīng)性，因此來(lái)源于微生物的脂肪酶已經(jīng)成為工業(yè)生產(chǎn)的重要來(lái)源[5]。疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyceslanuginosuslipase，TLL)是一種嗜堿性、底物專一性強(qiáng)且酶活高的脂肪酶?；赥LL的以上特點(diǎn)，諾維信公司開(kāi)發(fā)了可溶性TLL(Lipozyme TL 100 L)和固定化TLL(Lipozyme TL IM)，共兩種TLL商品酶以供工業(yè)生產(chǎn)使用?；诖耍琓LL在生物柴油的生產(chǎn)、純對(duì)映異構(gòu)體和區(qū)域異構(gòu)體的生產(chǎn)、聚合物的降解等方面得到了廣泛應(yīng)用[6]。然而，工業(yè)生產(chǎn)中往往歷經(jīng)高溫條件，天然的TLL會(huì)喪失部分酶活，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高，致使TLL的應(yīng)用受到限制。因此，對(duì)TLL耐熱性進(jìn)行改造以滿足工業(yè)需求極其必要。

目前，可以通過(guò)化學(xué)修飾[7]、固定化[8]、蛋白質(zhì)工程[9]、介質(zhì)工程[10]等多種策略提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，其中蛋白質(zhì)工程主要通過(guò)理性設(shè)計(jì)、半理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)等方法對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造[11]。理性設(shè)計(jì)基于對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、功能和催化活性進(jìn)行分析，在酶的特定位點(diǎn)上通過(guò)定點(diǎn)突變引入特異性的突變[12]，通常會(huì)借助同源序列比對(duì)、晶體結(jié)構(gòu)分析以及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)等手段對(duì)酶進(jìn)行改造。魏子翔[13]等人通過(guò)對(duì)TLL的蓋子(lid)和loop 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，獲得了一款新型的高活性、耐高溫的脂肪酶突變體，并實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。姜占寶[14]等人通過(guò)定點(diǎn)誘變引入二硫鍵，致使突變體脂肪酶在60 ℃下耐受20 min后比野生型脂肪酶剩余酶活提高了17.6%。ZHANG[15]等也利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法提高解脂耶氏酵母脂肪酶的熱穩(wěn)定性，最終獲得最適溫度提高5 ℃的突變體V213P，且催化活性與野生型相當(dāng)。溫露文[16]等人采用預(yù)測(cè)軟件PoPMuSiC和FoldX計(jì)算CALB潛在熱穩(wěn)定性突變位點(diǎn)，利用重疊延伸PCR技術(shù)在基因CALB中引入10個(gè)單點(diǎn)突變，最終獲得比野生型熱穩(wěn)定性提高的3個(gè)單突變體A146G、A151P和L278M，對(duì)其組合突變得到比野生型最適反應(yīng)溫度均提高了5 ℃的突變體A146G-L278M和A146G-L278M-A151P，Tm值也分別提高了3.3 ℃和4.2 ℃。WANG[17]等也利用計(jì)算軟件Fold X預(yù)測(cè)出4個(gè)能提高華根霉脂肪酶熱穩(wěn)定性的單突變位點(diǎn)S142A、D217 V、Q239F 和 S250Y，然后對(duì)其進(jìn)行組合產(chǎn)生4倍突變體m31，m31最適溫度提高5 ℃、在60 ℃下半衰期為野生型的41.7 倍，表現(xiàn)出增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。王睿[18]基于B-factor和RMSF值為篩選依據(jù)以提高脂肪酶分子的熱穩(wěn)定性，選取30個(gè)突變體進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)突變體的熱穩(wěn)定性得到顯著提高。

本研究借助Rosetta旗下自由能計(jì)算模塊ddg_monomer得出三個(gè)突變體(T114W、R175W、R195W)的自由能變化相對(duì)野生型TLL小于-5 kcal/mol，預(yù)測(cè)其為熱穩(wěn)定性可能提高的脂肪酶突變體，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)成功表達(dá)該三個(gè)突變體。研究發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)突變體(T114W和R195W)的熱穩(wěn)定性和生物柴油轉(zhuǎn)化率較野生型TLL明顯提高。迄今通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)提高TLL熱穩(wěn)定性的研究較少，該突變體的成功構(gòu)建為今后研究脂肪酶熱穩(wěn)定性及活性提高提供了參考，得到的TLL突變體T114W和R195W將能很好的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種來(lái)源

TLL連接的pPIC9K載體菌株(pPIC9K-TLL)和大腸桿菌(DH5α)由本實(shí)驗(yàn)室保存，畢赤酵母GS115和表達(dá)載體pPIC9K均購(gòu)自于Invitrogen公司。

1.1.2主要培養(yǎng)基

① LB培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1% NaCl，pH自然(約為7)，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2%(w/v)瓊脂。② YPD培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2%(w/v)瓊脂。③ BMGY培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%蛋白胨, 2%甘油，滅菌后超凈工作臺(tái)加入1%生物素，10%YNB溶液，10%磷酸儲(chǔ)備液。④ BMMY培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%蛋白胨，滅菌后超凈工作臺(tái)加入2%甲醇溶液，1%生物素，10%YNB溶液，10%磷酸儲(chǔ)備液。

1.1.3試劑與儀器

棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(pNPP)購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)品棕櫚酸甲酯購(gòu)于Sigma公司，其余均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑；基因擴(kuò)增儀(ETC811，蘇州東盛興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)，電轉(zhuǎn)化儀(MicroPulserTm，Bio-Rad)，電子恒溫水浴鍋(DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Multiskan，美國(guó))，核酸電泳儀(DYC，北京六一)，凝膠成像儀(UniversalHoodⅡ，Bio-Rad)，蛋白純化系統(tǒng)(GE Healthcare AKTA Purifier 10)。

1.1.4引物

引物由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 定點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物

1.2 方法

1.2.1計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)方法

TLL晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：1DT3)[19]的單體(共269個(gè)氨基酸)用于自由能變化的計(jì)算，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性預(yù)測(cè)工具Rosetta ddg_monomer[20]用于計(jì)算TLL所有單位點(diǎn)突變體(共計(jì)5 111個(gè))與野生型之間的自由能變化差值(ΔΔG)。首先，對(duì)TLL單體的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化計(jì)算；能量最小化完成后執(zhí)行循環(huán)次數(shù)設(shè)置為50次Rosetta ddg_monomer程序，具體的命令如下(/path/to/ddg_monomer.linuxgccrelease-in:file:s TLL.pdb-ddg::mut_file each_mutant.mutfile-ddg:weight_file soft_rep_design-database /usr/local/rosetta/main/database/-fa_max_dis 9.0-ddg:minimization_scorefunction talaris2013-ddg::iterations 50-ddg::dump_pdbs true-ignore_unrecognized_res-ddg::local_opt_only false-ddg::min_cst true-constraints::cst_file input.cst-ddg::suppress_checkpointing true-in::file::fullatom-ddg::mean false-ddg::min true-ddg::sc_min_only false-ddg::ramp_repulsive true-unmute core.optimization.LineMinimizer-ddg::output_silent)。結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，只有三個(gè)突變體的ΔΔG<-5 kcal/mol(T114W、R175W、R195W)，預(yù)測(cè)其為熱穩(wěn)定性可能提高的脂肪酶突變體。

1.2.2定點(diǎn)突變和基因克隆

在定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)中，利用pPIC9K-TLL作為模板構(gòu)建了三種脂肪酶單突變體T114W、R175W、R195W(圖1A)，定點(diǎn)突變PCR方法均參照定點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書進(jìn)行。然后將5 μL PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)至50 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴半小時(shí)后于42 ℃水浴鍋熱激1 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)加入提前滅好菌的200 μL LB培養(yǎng)基，放入搖床進(jìn)行孵育，最后將培養(yǎng)獲得的菌體涂于固體LB培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)。次日，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證后(圖1B)，再將驗(yàn)證成功的單菌落送至測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 電泳圖(A)為野生型TLL及突變體T114W、R175W、R195W的突變條帶，M為15 000 bp的Marker，泳道1：野生型TLL，泳道2：T114W，泳道3：R175W，泳道4：R195W。(B)為突變體T114W、R175W、R195W陽(yáng)性克隆驗(yàn)證成功的條帶，M為2000 bp的Marker，泳道1、2、3為T114W陽(yáng)性克隆驗(yàn)證成功的條帶，泳道4、5、6為R175W陽(yáng)性克隆驗(yàn)證成功的條帶，泳道7、8為R195W陽(yáng)性克隆驗(yàn)證成功的條帶。(C)為野生型TLL及突變體T114W、R175W、R195W的蛋白膠圖，M為97.2 kDa的Marker，泳道1：野生型TLL，泳道2：T114W，泳道3：R175W，泳道4：R195W。

1.2.3蛋白表達(dá)與純化

① 電轉(zhuǎn)化：用限制性核酸內(nèi)切酶SalI 線性化野生型pPIC9K-TLL和三種脂肪酶單突變體T114W、R175W、R195W，之后電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115菌株中；② 菌株培養(yǎng)：將菌液涂至含有山梨醇的YPD固體培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，之后用含有遺傳霉素的YPD固體培養(yǎng)基篩選出至少30個(gè)克隆子，再轉(zhuǎn)至YPD固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)48 h；③ 發(fā)酵：各挑取YPD固體培養(yǎng)基上的菌株于裝有2 mL已滅菌BMGY培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h，到超凈工作臺(tái)取出菌液，8 000 r/min離心10 min收集菌體，再將菌體轉(zhuǎn)至裝有2 mL已滅菌BMMY培養(yǎng)基的試管中，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h獲得發(fā)酵液；④ 純化：將獲得的上清液加入Ni2+-NTA親和層析柱，用含有不同濃度的咪唑洗脫液進(jìn)行洗脫，最終用SDS-PAGE確認(rèn)純化結(jié)果(圖1C)。

1.2.4酶活力測(cè)定

取適度稀釋的酶液50 μL加至已經(jīng)在37 ℃電子恒溫水浴鍋中預(yù)熱2 min的450 μL底物溶液中，反應(yīng)5 min，然后加入50 μL 10%的SDS終止反應(yīng)，對(duì)照則在其它反應(yīng)條件皆相同的情況下先加入SDS再加入酶液，最后皆加入500 μL 0.1 mmol/L的碳酸鈉溶液。各吸取200 μL反應(yīng)液和對(duì)照液在405 nm下測(cè)定吸光值。根據(jù)pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.051x+0.011(R2=0.999 8)算出pNP的濃度，帶入脂肪酶酶活力計(jì)算公式算出其酶活力。棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(pNPP)測(cè)定酶活的原理：為每分鐘水解底物pNPP生成1umol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(1 U)[21]。

1.2.5最適pH、溫度和 pH、溫度穩(wěn)定性測(cè)定

對(duì)野生型脂肪酶pPIC9K-TLL和三種脂肪酶單突變體T114W、R175W、R195W進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的分析，最適pH測(cè)定：取適當(dāng)稀釋過(guò)的酶液在37 ℃、不同pH(4～12)下進(jìn)行酶促反應(yīng)測(cè)定最適pH；最適溫度測(cè)定：取適當(dāng)稀釋過(guò)的酶液在最適pH時(shí)分別在30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃進(jìn)行酶促反應(yīng)測(cè)定最適溫度；pH穩(wěn)定性測(cè)定：用不同pH(4～12)的緩沖液適當(dāng)稀釋后的酶液在37 ℃下耐受1 h，之后在最適pH 、37 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的稀釋酶液作為 100%；溫度穩(wěn)定性測(cè)定：取適當(dāng)稀釋過(guò)的酶液在最適pH時(shí)分別在70 ℃下耐受1 min、3 min、5 min、7 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min進(jìn)行酶促反應(yīng)測(cè)定溫度穩(wěn)定性；取適當(dāng)稀釋過(guò)的酶液在最適pH時(shí)分別在80 ℃下耐受1 min、3 min、5 min、7 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min進(jìn)行酶促反應(yīng)測(cè)定溫度穩(wěn)定性。

1.2.6動(dòng)力學(xué)測(cè)定

在37 ℃、pH為9.0時(shí)，以0.006 mmol/L 、0.012 mmol/L、0.030 mmol/L、0.045 mmol/L、0.060 mmol/L、0.120 mmol/L 、0.180 mmol/L、0.240 mmol/L、0.360 mmol/L和0.480 mmol/L濃度的pNPP進(jìn)行酶促反應(yīng)，利用GraphPad Prism 5的酶動(dòng)力學(xué)(Enzyme kinetics)中的米氏方程(Michaelis-Menten)計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值、Vmax值、kcat值。

1.2.7生物柴油轉(zhuǎn)酯率測(cè)定及統(tǒng)計(jì)分析

先制備野生型脂肪酶及突變體催化酯交換反應(yīng)制備生物柴油的反應(yīng)體系，稱取50 g已經(jīng)除過(guò)雜質(zhì)的地溝油置于100 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入6 000 U酶活單位的脂肪酶(野生型和突變體)，再加入7.5 mL甲醇、2.5 mL正己烷、35 μL Span60和5 mL的水。配置完成之后將錐形瓶置于37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)8 h，反應(yīng)結(jié)束后置于80 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱滅活30 min，12 000 r/min離心10 min取上層油酯相測(cè)定酯交換反應(yīng)所得脂肪酸甲酯的含量。然后再吸取1 mL地溝油于50 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入10 mL 10%鹽酸-甲醇溶液、5 mL甲苯、1 mL飽和NaCl溶液，于50 ℃水浴反應(yīng)8 h結(jié)束后，加入5 mL正己烷混勻，5 000 r/min離心3 min取上層有機(jī)相測(cè)定地溝油完全甲酯化后脂肪酸甲酯的含量。

對(duì)TLL酶比活力與脂肪酶突變體酶比活力的差異、TLL轉(zhuǎn)酯率與脂肪酶突變體轉(zhuǎn)酯率的差異，分別用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent-Sample T Tests)進(jìn)行了比較，所有數(shù)據(jù)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

TLL序列全長(zhǎng)825 bp，共編碼275(含6個(gè)His標(biāo)簽)個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為29.9 kDa。通過(guò)純化后的SDS-PAGE分析證明(圖1C)，TLL及突變體T114W、R175W、R195W分子量一致, 活性分別為311 U/mg 、191 U/mg、3 U/mg、262 U/mg。

2.2 TLL及突變體T114W、R175W和R195W的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

野生型脂肪酶TLL的最適溫度為40 ℃；突變體T114W和突變體R195W的最適溫度為40 ℃與野生型相同；然而，突變體R175W的最適溫度為35 ℃，較野生型降低了5 ℃(圖2A)。將野生型脂肪酶TLL及突變體T114W、R175W、R195W置于70 ℃和80 ℃下進(jìn)行耐受處理(圖2B、2C)，具體表現(xiàn)為：在70 ℃下，野生型TLL處理90 min相對(duì)剩余酶活下降到44.49%，T114W、R175W和R195W在相同條件下相對(duì)剩余酶活下降到57.95%、39.63%和67.37%。溫度耐受結(jié)果表明相比野生型TLL，突變體T114W和R195W在70 ℃下耐受90 min后相對(duì)剩余酶活分別提高了13.46%和22.88%，耐熱性相比TLL有所提高。在80 ℃下，野生型TLL耐受30 min后相對(duì)剩余酶活降到47.03%，T114W、R175W和R195W在相同條件下相對(duì)剩余酶活下降到59.26%、11.88%和21.72%。溫度耐受結(jié)果顯示突變體T114W在80 ℃下的熱穩(wěn)定性相比TLL有所提高，相對(duì)剩余酶活提高了17.26%。

圖A為最適溫度

圖B為在70 ℃下溫度穩(wěn)定性

圖C為在80 ℃下溫度穩(wěn)定性圖2 TLL及突變體T114W、R175W、R195W溫度圖

2.3 TLL及突變體T114W、R175W、R195W的最適pH及pH穩(wěn)定性

脂肪酶TLL與三個(gè)突變體的最適pH均為9.0，偏堿性(圖3A)。對(duì)野生型和突變體在37 ℃、pH 4.0～12.0下處理1 h,發(fā)現(xiàn)耐熱性提高的突變體T114W和R195W在pH 4.0～12.0的相對(duì)剩余酶活也均高于野生型，提高了10%～15%。而突變體R175W相比于野生型TLL在pH 3.0～10.0的pH耐受性無(wú)明顯變化(圖3B)。表明突變體T114W和R195W比野生型TLL的pH穩(wěn)定性有所提高。

圖A為最適pH

圖B為pH穩(wěn)定性圖3 TLL及突變體T114W、R175W、R195W的pH圖

2.4 TLL及突變體T114W、R175W、R195W的動(dòng)力學(xué)分析

TLL及突變體T114W、R175W、R195W的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2，T114W和R195W的Km與野生型相比有所下降，Km下降表明這兩個(gè)突變體對(duì)底物的親和力變大。而R175W的Km比野生型大則表明該突變體對(duì)底物親和力相對(duì)較弱，聯(lián)系到R175W的酶活性僅有3 U/mg，也間接表明了該突變體在酯水解反應(yīng)中的催化作用極差。R195W的kcat/Km值比TLL的有所提高，則表明該突變體在催化速率方面有所升高，然而其余兩個(gè)突變體在催化速率方面并未變化。綜上表明，突變體R195W有更高的動(dòng)力學(xué)和催化效率。

表2 TLL、T114W、R175W、R195W動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.5 TLL及突變體T114W、R175W、R195W的生物柴油轉(zhuǎn)酯率分析

經(jīng)測(cè)定，野生型脂肪酶TLL及突變體T114W、R175W、R195W的轉(zhuǎn)酯率分別為49.70%、64.82%、25.13%和58.20%，突變體T114W和R195W比野生型分別提高了15.12%和8.50%。對(duì)TLL及突變體的酶比活力和生物柴油轉(zhuǎn)酯率進(jìn)行了相關(guān)性分析，圖4表明脂肪酶的酶比活力和生物柴油轉(zhuǎn)酯率呈顯著正相關(guān)(r=0.793，P=0.002)，隨著脂肪酶的酶比活力增高其轉(zhuǎn)酯率也相應(yīng)提高。

圖A為酶比活力

圖B為轉(zhuǎn)酯率

圖C為二者相關(guān)性分析

3 討論

本研究借助Rosetta旗下自由能計(jì)算模塊ddg_monomer預(yù)測(cè)出三個(gè)突變體(T114W、R175W、R195W)的熱穩(wěn)定性相比于野生型TLL可能提高，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)成功表達(dá)該三個(gè)突變體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)突變體(T114W和R195W)的熱穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)酯率較野生型TLL明顯提高，而R175W由于突變位置導(dǎo)致其酶活幾乎喪失。Rosetta ddg_monomer預(yù)測(cè)的三個(gè)突變體均為將原有序列突變?yōu)樯彼?，?duì)原始結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn)T114和R195雖然均為極性氨基酸，但其并未和任何周圍氨基酸形成氫鍵或者鹽橋類的相互作用，當(dāng)將這兩個(gè)位點(diǎn)突變?yōu)樯彼?Trp，W)時(shí)，位于α螺旋上的W114很有可能和相距0.3 nm的loop結(jié)構(gòu)形成cation-π的相互作用；而當(dāng)將195位的精氨酸(Arg，R)突變位色氨酸時(shí)，位于β折疊上的W195可以與H215的環(huán)狀側(cè)鏈形成穩(wěn)定的π-π相互作用，這兩種新增范德華力的形成，導(dǎo)致了TLL突變體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，且并不影響其活性，基于位點(diǎn)114和195的色氨酸突變體最終使得TLL的熱穩(wěn)定性、生物柴油轉(zhuǎn)化率得以大幅度提高(圖5)。這也說(shuō)明了芳香類氨基酸可以通過(guò)cation-π或者π-π相互作用使TLL脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，后續(xù)對(duì)TLL的進(jìn)一步改造提供了指導(dǎo)意義。

圖5 TLL、T114W和R195W的3D結(jié)構(gòu)比較

目前在優(yōu)化TLL耐熱性的研究中有很多是對(duì)其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，替換不穩(wěn)定的“蓋子”或 loop區(qū)域氨基酸，得到耐熱性提高的突變體酶[13]。除此之外，利用化學(xué)法或者物理法將脂肪酶制備成不溶于水但仍具備催化活性的固定化復(fù)合酶，來(lái)提高酶的熱穩(wěn)定性。但是該方法存在一些限制，工業(yè)條件下需要考慮到酶的穩(wěn)定性、活性、純度和對(duì)底物的選擇性、特異性等問(wèn)題，以及如何從反應(yīng)介質(zhì)中分離出高活性的酶，增加了工藝成本[22]。還有通過(guò)化學(xué)修飾，如增加糖基化位點(diǎn)等得到耐熱性提高的突變體酶[23]。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)利用理性設(shè)計(jì)手段優(yōu)化 TLL 耐熱性的研究十分稀少，針對(duì) TLL 耐熱性的改造研究全部集中在固定化的技術(shù)革新上，本研究利用 Rosetta 軟件對(duì)TLL及其突變體進(jìn)行ΔΔG計(jì)算，通過(guò)對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行分析和篩選得到熱穩(wěn)定性提高的兩個(gè)突變體酶，與以往提高TLL熱穩(wěn)定性的方法相比更加精準(zhǔn)和有效。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)脂肪酶的水解活性與其生物柴油轉(zhuǎn)化率呈顯著正相關(guān)。由于脂肪酶的活性測(cè)定是測(cè)定其水解脂肪的效率屬于水解反應(yīng)，地溝油或其它脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物柴油雖然為酯交換反應(yīng)，但其催化途徑類似，均是通過(guò)脂肪酶的催化作用將水或者醇類物質(zhì)的羥基與氫離子或碳鏈部分通過(guò)親核取代反應(yīng)分離，最終達(dá)到生成甘油和脂肪酸或生物柴油的目的。因此，當(dāng)對(duì)脂肪酶進(jìn)行改造時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)其催化活性有所提高，也間接證明其生物柴油轉(zhuǎn)化率可能會(huì)有所升高。

綜上，本研究證明利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件提供潛在耐熱TLL突變體的研究策略是有效而且可靠的，研究產(chǎn)生的耐熱突變體T114W和R195W也能夠用于極端條件下的工業(yè)生產(chǎn)中，且該研究為提高工業(yè)用酶耐熱性提供了參考依據(jù)。