孫廷麗， 楊秀茳， 李彩玲， 李 東， 周少璐， 劉永龍， 謝小保*

1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心， 華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070; 2.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣州 510663

隨著生活水平的提高，人們對于日化產(chǎn)品的要求也不斷提高。安全、綠色及多功能等要求，都對日化產(chǎn)品的微生物控制提出了更高的挑戰(zhàn)。為滿足這些要求，一方面，要嚴(yán)格控制防腐劑的種類及添加量[1-2]，另一方面，越來越多的生物活性物質(zhì)被應(yīng)用到日化產(chǎn)品的配方中。這些生物源性的物質(zhì)如脂類、蛋白質(zhì)、水溶性聚合物質(zhì)等，富含微生物生長繁殖所需的營養(yǎng)，使得這些產(chǎn)品特別容易產(chǎn)生微生物的污染。此外，日化產(chǎn)品生產(chǎn)工藝大都比較簡單，生產(chǎn)環(huán)境也不會(huì)進(jìn)行嚴(yán)格的微生物控制，加上日化產(chǎn)品大多數(shù)為反復(fù)使用的產(chǎn)品，因此極易產(chǎn)生微生物的污染，從而造成經(jīng)濟(jì)損失和對消費(fèi)者的健康產(chǎn)生影響[3]。因此，充分了解日化產(chǎn)品中污染微生物的特性，豐富日化產(chǎn)品污染菌種資源信息，對該類產(chǎn)品的防腐體系構(gòu)建及污染治理具有積極的作用。

本文通過對某日化產(chǎn)品廠的污染產(chǎn)品進(jìn)行分析，確定了污染的優(yōu)勢菌及其群落構(gòu)成，并對優(yōu)勢菌的耐藥性及產(chǎn)品的防腐體系對此類微生物的抵抗力進(jìn)行了分析，以對此類污染的治理提供理論支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

樣品為洗潔精，主要成分包括水、AES、磺酸、片堿、礦物油、鹽、香精及防腐劑。防腐劑為卡松，總甲基異噻唑啉酮含量95 mg/kg～100 mg/kg。共選取10個(gè)樣品，其中5個(gè)樣品發(fā)臭、明顯異味或疑似帶有異味，另外5個(gè)樣品為正常樣品。所有樣品均為同一工廠提供，配方一致，來源于不同生產(chǎn)批次，隨機(jī)抽樣。將上述樣品按順序分別編碼為S01～S10。防腐劑樣品CJ-5由廣東迪美生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PCA)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)，大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)等微生物分析試劑購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DNA提取試劑盒等分子生物學(xué)分析試劑購自上海生工生物有限公司；其它生化試劑購自廣州化學(xué)試劑廠；標(biāo)準(zhǔn)菌種購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.3 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱、生物安全柜等常規(guī)微生物分析設(shè)備(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)；高效液相色譜儀(安捷倫)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；Nano Drop超微量核酸定量儀(美國 Thermo 公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀)；瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1微生物菌落總數(shù)計(jì)數(shù)及分離

使用GB4789.2—2016《食品微生物菌落總數(shù)的測定》規(guī)定的方法測定樣品中的微生物菌落總數(shù)，并對培養(yǎng)后有菌生長的樣品進(jìn)行單菌落的純化分離[4]。

1.4.2菌種鑒定及污染樣品群落分析

對污染樣品的優(yōu)勢菌種使用16SrRNA基因測序的方法進(jìn)行菌種鑒定，即分別提取污染菌的總DNA，利用細(xì)菌的通用引物16sRNAF:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′ 16sRNAR:5 ′-TAGGGTTACCT TGTTACGACTT-3′進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:預(yù)熱95 ℃，5 min;變性94 ℃，50 s，退火54 ℃，40 s，延伸72 ℃，1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃，10 min。將擴(kuò)增序列進(jìn)行測序，結(jié)果通過BLAST查找比對分析[5]；選取典型的污染樣本進(jìn)行高通量測序，提取純化樣本DNA后，將驗(yàn)證正確的DNA樣本采用Illumina MiSeq/HiSeq測序平臺(tái)對樣本中微生物16SrRNA基因的V3-V4 區(qū)(336F-806R)進(jìn)行測序分析從而得到樣本的群落組成及豐度等信息[6-7]。

1.4.3樣品中防腐劑含量的測試

參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015)中規(guī)定的方法，使用高效液相色譜法測試防腐劑的含量[8]，測定結(jié)束后，于室溫保存28天后，復(fù)測防腐劑的含量。

1.4.4菌落耐藥性分析

分別測試卡松類防腐劑對污染菌的最低抑菌濃度和使用污染菌種對樣品進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)。具體試驗(yàn)方法如下：最低抑菌濃度測試：參照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版)2.1.8.3最小抑菌濃度試驗(yàn)，使用瓊脂稀釋法測試污染樣品分離到的優(yōu)勢菌對防腐劑CJ-5的最低抑菌濃度值[9]。防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)：使用ASTM E 640:2019《含水化妝品防腐功效測試》規(guī)定的方法，對正常的樣品進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)[10]。測試時(shí)，一組樣品采用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的大腸埃希氏菌ATCC8739、金黃色葡萄球菌ATCC6538、銅綠假單胞菌ATCC9027、洋蔥伯克霍爾德氏菌ATCC10425、日溝維腸桿菌ATCC33028的混合菌懸液作為挑戰(zhàn)菌種，另一組樣品使用上述標(biāo)準(zhǔn)菌種與污染菌的混合菌液。測試結(jié)束后，對殘留的防腐劑含量進(jìn)行測定。如沒有通過防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，則對殘留菌種進(jìn)行菌種鑒定。

2 結(jié)果和討論

2.1 污染樣品微生物菌落總數(shù)結(jié)果

采樣后立即對工廠提供的樣品進(jìn)行菌落總數(shù)的測定，結(jié)果顯示，發(fā)臭有異味的樣品S01～S04，均檢出了微生物(細(xì)菌)，菌落總數(shù)菌超過了106CFU/g。疑似有異味的樣品S05及正常無異味的樣品S06～S10，菌落總數(shù)均<10 CFU/g。對所有未檢出微生物的樣品，經(jīng)室溫自然存放28 d后進(jìn)行復(fù)測，S05異味明顯，菌落總數(shù)達(dá)到1.9×104CFU/g；S06～S10性狀氣味無改變，存放后仍未檢出微生物。這表明樣品的變質(zhì)主要是由微生物污染引起。具體結(jié)果見表1。

2.2 變質(zhì)樣品中微生物的優(yōu)勢菌種及群落構(gòu)成

對污染樣品進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)后，分離培養(yǎng)得到優(yōu)勢菌種，并使用16S rRNA基因測序的方法對其進(jìn)行了鑒定。對5個(gè)樣品的測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果均為類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonaspseudoaligenes)，序列相似度均超過99%，具體結(jié)果見表2。使用高通量測序分析樣品的細(xì)菌群落構(gòu)成，在屬水平上，5個(gè)污染樣品中共注釋到了26個(gè)類群，其中假單胞菌屬為所有樣品中共有的屬，且其序列數(shù)比例均超過50%；除此之外，蒼白桿菌屬在S01、S02中占比較高，分別為19.9%及25.4%，為第二優(yōu)勢屬；而柄桿菌屬、青桔菌屬及葡萄球菌屬則是S05中除假單胞菌屬外的其它優(yōu)勢屬，其占比分別為17.6%、20.3%及7.3%。在種水平上，5個(gè)樣品共注釋到23個(gè)類群，類產(chǎn)堿假單胞菌為所有樣品中的優(yōu)勢種。其中S03、S04樣品的菌種構(gòu)成比較單一，類產(chǎn)堿假單胞菌的豐度達(dá)到99.9%；S01、S02的群落構(gòu)成基本相似，但各菌種豐度略有不同，其組成均為類產(chǎn)堿假單胞菌(豐度分別為77.49%及77.43%)、未能分類菌種(Unclassified，分別占19.88%及25.40%)及少量漢氏鹽單胞菌(Halomonasstevensii)(小于2%)；S05的組成最為復(fù)雜，其中類產(chǎn)堿假單胞菌占53.59%、其獨(dú)有的優(yōu)勢菌分別包括未能鑒定到種的海洋浮游菌(unidentified marine bacterioplankton)20.32%、柄桿菌(Caulobactersp.)17.63%及路鄧葡萄球菌(Staphylococcuslentus)7.33%。上述微生物屬水平及種水平群落構(gòu)成分別見圖1和圖2。由上述結(jié)果可以推定，發(fā)生污染的樣品中，污染的主要來源是一致的，但不排除其它污染渠道的存在，污染樣品中可能存在其它常規(guī)培養(yǎng)中未能培養(yǎng)的微生物，或者這些微生物含量較低，不足以形成生長優(yōu)勢。

表2 微生物菌種鑒定結(jié)果及豐度分布信息

圖1 屬水平物種相對豐度

圖2 種水平物種相對豐度

2.3 樣品中防腐劑含量的測定結(jié)果

采樣后，對樣品中的防腐劑含量進(jìn)行測試，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，5個(gè)微生物污染樣品中，所有樣品的防腐劑含量均有所下降，其中S01、S03樣品防腐劑含量已降至不能檢出，S02、S04、S05樣品的總甲基異噻唑啉酮含量分別是 59.9 mg/kg、 46.6 mg/kg和 85.9 mg/kg。對上述樣品自然放置28 d后復(fù)測防腐劑含量，其總異噻唑啉酮含量均下降至未檢出。這表明，樣品的腐敗菌有一定的耐藥性，且會(huì)持續(xù)的消耗防腐劑。對正常未檢出微生物的樣品也進(jìn)行防腐劑含量的檢測，其總異噻唑啉酮的含量分別為103.7 mg/kg、88.2 mg/kg、88.3 mg/kg、76.5 mg/kg和71.1 mg/kg。該配方產(chǎn)品中，正常生產(chǎn)的防腐劑理論添加量為 95 mg/kg ～100 mg/kg，S06～S08的防腐劑含量在正常允許偏差內(nèi)，而S09～S10則略有降低。復(fù)測S06～S10的防腐劑含量，發(fā)現(xiàn)其基本不變。這說明，未發(fā)生微生物污染的樣品中，防腐劑的含量基本沒有降低，未發(fā)生大量的消耗。結(jié)合優(yōu)勢菌的鑒定結(jié)果，推測認(rèn)為，引發(fā)污染的產(chǎn)堿假單胞菌消耗或降解了體系中的防腐劑，或通過代謝改變了體系的微環(huán)境，從而造成了變質(zhì)樣品中防腐劑含量持續(xù)降低的現(xiàn)象。

表3 樣品中殘留防腐劑的含量

2.4 污染菌的耐藥性分析及對防腐體系的挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1污染菌的最低抑菌濃度結(jié)果及分析

污染菌及標(biāo)準(zhǔn)菌的最低抑菌濃度測試結(jié)果見表4。測試數(shù)據(jù)顯示，來源于污染樣品的污染菌的最低抑菌濃度低于污染樣品體系中的防腐劑含量，說明污染菌對變質(zhì)樣品體系中的防腐劑產(chǎn)生了一定的耐藥性，可以在較高濃度的防腐劑含量下生長。但這種耐藥性并不會(huì)隨著傳代而傳遞，在防腐劑的選擇壓力消失時(shí)，其耐藥性消失，表明該腐敗菌的耐藥性不是由基因突變產(chǎn)生的穩(wěn)定耐藥，而是由于基因表達(dá)調(diào)控或代謝調(diào)控等引起的群體適應(yīng)性引起的。這樣的發(fā)現(xiàn)，對于進(jìn)一步的微生物污染治理具有積極的參考價(jià)值。

表4 污染菌及標(biāo)準(zhǔn)菌的最低抑菌濃度測試結(jié)果

2.4.2防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

僅采用標(biāo)準(zhǔn)菌和采用標(biāo)準(zhǔn)菌加污染菌的混合菌液作為挑戰(zhàn)菌種分別進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)，其結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，對同一配方的正常產(chǎn)品進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)混合菌作為挑戰(zhàn)菌種時(shí)，接種后3 d微生物即下降至不能檢出；使用標(biāo)準(zhǔn)混合菌加污染菌種作為挑戰(zhàn)菌種時(shí)，則僅有一個(gè)樣品可以通過挑戰(zhàn)。對其28 d挑戰(zhàn)結(jié)束后的殘留菌種及防腐劑含量進(jìn)行測試，未能通過挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)的樣品中，殘留菌均為銅綠假單胞菌，且未通過挑戰(zhàn)的樣品28 d后已經(jīng)沒有防腐劑殘留，表明未通過挑戰(zhàn)的結(jié)果非實(shí)驗(yàn)室操作污染引起，挑戰(zhàn)結(jié)果可靠。標(biāo)準(zhǔn)混合菌均能夠通過挑戰(zhàn)測試，并且防腐劑殘留量無異常。結(jié)合前文中污染樣品中防腐劑全部無殘留，及本次防腐挑戰(zhàn)前后樣品的防腐劑含量變化，可以發(fā)現(xiàn)，在含有類產(chǎn)堿假單胞菌的樣品下，防腐劑的含量均出現(xiàn)了大幅的下降，而不含此菌株的體系，防腐劑的含量則沒有明顯的降低。由此可以推測，分離到的污染菌是引起防腐劑含量降低的主要因素。該菌種具有一定的耐藥性，但耐藥性并不能持續(xù)傳遞，當(dāng)防腐體系中的防腐劑被消耗降解至一定濃度時(shí)，由于防腐挑戰(zhàn)菌種之間的生存競爭，污染菌本身未能占據(jù)生長優(yōu)勢，導(dǎo)致挑戰(zhàn)之后的存活菌種為銅綠假單胞菌。該結(jié)果進(jìn)一步說明腐敗菌具有一定的非典型性。

表5 防腐挑戰(zhàn)試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究表明，引起本次日化產(chǎn)品變質(zhì)的主要原因是微生物污染，其主要污染微生物為類產(chǎn)堿假單胞菌。這類微生物是一種革蘭氏陰性、好氧的環(huán)境微生物，可以從石油[11]、海洋樣本[12]、切削液[13]、重金屬廢水[14]、醫(yī)院病人樣本[15-16]及其它環(huán)境[17]等中分離得到，日化污染中的報(bào)道少見。此類細(xì)菌對環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性，可以在有重金屬、高滲透壓或某些有機(jī)殺菌劑存在的情況下存活并產(chǎn)生耐藥性。報(bào)道顯示，從上述環(huán)境中分離到的類產(chǎn)堿假單胞菌，有些可以改變應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，通過提高離子通道通透性、脯氨酸、抗氧化酶等的含量來提高植物對高鹽環(huán)境或干旱環(huán)境的耐受性[18-20]，有些通過差異化表達(dá)某些基因，調(diào)節(jié)蛋白及酶的水平來實(shí)現(xiàn)對金屬富集環(huán)境的適應(yīng)[21-24]。OLAYA-ABRIL A等發(fā)現(xiàn)，在珠寶廢水中的類產(chǎn)堿假單胞菌可以過量產(chǎn)生二氫二癸酸合酶DapA1。這是一種參與賴氨酸代謝的蛋白質(zhì)，也參與二癸酸鹽的合成，而二癸酸鹽是優(yōu)良的金屬螯合劑，可以提高鐵、銅、鋅等金屬的耐受能力[22]。此外還發(fā)現(xiàn)，類產(chǎn)堿假單胞菌可以利用多種氮源及碳源，如石油烴[11,25]、硝基苯[26]、硝酸鹽及亞硝酸鹽[27]，及其它物質(zhì)[13,17]，一株可以降解氰化物的類產(chǎn)堿假單胞菌在以含氰化物的首飾殘?jiān)颁@分別作為唯一氮源時(shí)，共有20個(gè)sRNAS發(fā)生了差異化表達(dá)，這些基因大多與編碼氰化物同化所必需的硝化酶NitC的nit1C基因簇、編碼氰化物不敏感的細(xì)胞色素bd型末端氧化酶的cioAB基因簇、中等長度的聚羥基脂肪酸鹽(ml-PHAs)基因簇、編碼谷氨酰胺合成酶和尿素酶的基因簇相關(guān)[23]。同時(shí)這類菌株還具有一定的致病性，并發(fā)現(xiàn)其對某些抗生素有一定的耐藥性[28-29]。本次污染中分離到的腐敗菌可以持續(xù)引起異噻唑啉酮類消毒劑的降解或消耗，對此類消毒劑有一定的耐受性。由于其耐藥性沒有實(shí)現(xiàn)持續(xù)的傳遞，初步推測不是由基因突變導(dǎo)致的，這種對防腐劑的耐受性，可能是由于能降解這種防腐劑的酶的基因表達(dá)或翻譯水平發(fā)生了調(diào)控；也可能是污染菌的代謝途徑發(fā)生了改變，使得體系的微環(huán)境發(fā)生了改變，從而引起甲基異噻唑啉酮類防腐劑降解，或者是其它的未知的途徑改變等引起的獲得性耐藥。使用這種腐敗菌種混合標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)，比較難以通過挑戰(zhàn)測試，但是最終體系中殘留的菌種卻不是這種污染菌，進(jìn)一步表明了這個(gè)菌種的特殊性。由于尚沒有關(guān)于這種微生物對卡松類防腐劑耐藥性的深入報(bào)道，其耐藥機(jī)理其耐藥機(jī)理值得進(jìn)一步的研究和探討。

近年來，隨著法律法規(guī)的不斷完善，允許使用的防腐劑類別逐年受限，導(dǎo)致產(chǎn)品保護(hù)的壓力越來越大[30-31]。逐年縮緊的使用譜和不斷增加的防腐劑添加量，進(jìn)一步導(dǎo)致了耐藥菌的產(chǎn)生，從而形成惡性循環(huán)[32]。因此，建立工業(yè)產(chǎn)品的污染菌種數(shù)據(jù)庫，通過對工業(yè)產(chǎn)品中的腐敗微生物的分離鑒定，充分了解其生物學(xué)特性及耐藥特征，有助于制定出更合理有效的微生物控制方案。除了常見的污染微生物，非常規(guī)、不典型的菌種也應(yīng)該引起充分的重視，這對于科學(xué)的進(jìn)行日化產(chǎn)品生產(chǎn)、運(yùn)輸、存儲(chǔ)及使用過程的微生物控制具有積極的意義。