朱亞瓊

品測(上海)檢測科技有限公司， 上海 201108

我國是世界上最大的農(nóng)業(yè)國之一，據(jù)《2021年國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)》報(bào)道，全年糧食類種植面積達(dá)到11 763萬公頃，比上年增加86萬公頃。中國在農(nóng)藥使用量和生產(chǎn)量上都位居世界第1位[1]。近年來，農(nóng)藥品種不斷增多，大量的農(nóng)藥施于農(nóng)田，給農(nóng)產(chǎn)品造成直接污染的同時(shí)，一部分殘留在人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境中，殘存于土壤、水源、大氣以及農(nóng)作物中，對(duì)人類、家畜(動(dòng)物性食品)及環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響[2]。氟吡菌酰胺是一種琥珀酸脫氫酶抑制劑，它可以選擇性地抑制線蟲線粒體中的呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ，從而導(dǎo)致線蟲死亡，具有低毒安全，殺菌譜廣等特點(diǎn)，既可用于防治灰霉病、白粉病、菌核病以及念珠菌屬引起的病害，又對(duì)線蟲有較好的防治作用[3]。國標(biāo)GB 2763—2021[4]對(duì)動(dòng)物源性食品中氟吡菌酰胺制定了限量要求，但目前尚未出臺(tái)針對(duì)動(dòng)物源性食品中氟吡菌酰胺的檢測方法或相應(yīng)的研究報(bào)道，因此亟需開展一種高效、簡便，同時(shí)能夠準(zhǔn)確地定性和定量的檢測方法。本文以禽肉為研究對(duì)象，優(yōu)化提取溶劑和凈化方法，比較了2種檢測器的靈敏度，得到適用于禽肉基質(zhì)的檢測方法。

目前有大量文獻(xiàn)針對(duì)植物源性食品中氟吡菌酰胺檢測的相關(guān)研究。其中提取溶劑一般選擇：乙腈、酸化乙腈、乙酸乙酯、丙酮和正己烷等，凈化方式大多使用QuEChERS，檢測器為氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀或超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀[5-7]。本文參考相關(guān)研究的結(jié)論，結(jié)合禽肉基質(zhì)特性，優(yōu)化出適用于禽肉基質(zhì)中氟吡菌酰胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9 %，北京曼哈格生物科技有限公司)；乙酸乙酯、乙腈、正己烷、甲酸(色譜純，上海安譜科技股份有限公司)；超純水(自制)；無水硫酸鈉(分析純，國藥)；N-丙基乙二胺吸附劑(PSA)(粒徑范圍：40 μm～60 μm，平均孔徑：100 ?，上海安譜科技股份有限公司)；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)(粒徑范圍：40 μm～60 μm，平均孔徑：60 ?，上海安譜科技股份有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(型號(hào)I Class/5500，配有ESI源，美國沃特世公司/AB SCIEX)；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(型號(hào)8890/7000D，配有EI源，美國安捷倫公司)；高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)HR21M，湖南赫西儀器裝備有限公司)；電子天平(型號(hào)ME204，梅特勒托利多科技(中國)有限公司)；超聲機(jī)(型號(hào)SB25-12D，寧波新芝生物科技股份有限公司)；氮吹儀(型號(hào)Xce/Vap，美國Horizon公司)；渦旋振蕩器(型號(hào)Multi reax，德國HEIDOLPH公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1檢測器的選擇

將GC-MS/MS和LC-MS/MS的儀器參數(shù)調(diào)試到最佳響應(yīng)狀態(tài)，將濃度為1.0 ng/mL的氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)，比較兩種檢測器的信噪比與精密度，選擇相同濃度條件下信噪比大且響應(yīng)值穩(wěn)定的檢測器。

1.3.1.1GC-MS/MS儀器條件

色譜柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；載氣(氦氣)流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1.0 μL；升溫程序見表1；進(jìn)樣口溫度：280 ℃，傳輸管溫度：280 ℃。監(jiān)測方式：MRM；氟吡菌酰胺特征離子：173/145(定量離子)，173/95(定性離子)。

表1 氣相色譜儀升溫程序

1.3.1.2LC-MS/MS儀器條件

色譜柱：BEHC18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)、乙腈(B)；洗脫方式：梯度洗脫，見表2；離子源：電噴霧離子源ESI+；離子化電壓：5000 V；去溶劑溫度：550 ℃；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；氣簾氣：20 psi；監(jiān)測方式：MRM；氟吡菌酰胺特征離子：397/173(定量離子)，397/208(定性離子)，進(jìn)樣體積：2.0 μL。

表2 梯度洗脫比例

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇

因禽肉基質(zhì)復(fù)雜，在電離過程中目標(biāo)物易受雜質(zhì)干擾，導(dǎo)致離子化效率或高或低。為驗(yàn)證基質(zhì)效應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備了4種禽肉基質(zhì)曲線與溶劑配制的曲線上機(jī)檢測，觀察其基質(zhì)效應(yīng)。具體方法為：溶劑曲線：用乙腈將氟吡菌酰胺稀釋成濃度為0.5 ng/mL，1.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL和50 ng/mL的系列工作曲線；基質(zhì)曲線：分別移取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液至空白基質(zhì)提取液中，45 ℃水浴氮?dú)獯到桑尤胍译?.0 mL，渦旋復(fù)溶，配制成和溶劑曲線一致的濃度上機(jī)測試。

1.3.3提取溶劑的選擇

按照氟吡菌酰胺的物理性質(zhì)，其在水中溶解度較低，易溶于有機(jī)溶劑。實(shí)驗(yàn)分別采用乙腈、1%甲酸乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑，比較3種溶劑的提取效率。具體步驟：稱取4種禽肉試樣(雞肉、鴿肉、鴨肉和鵝肉)各2 g(精確至0.001 g)，置于50 mL離心管中，分別加入10 mL提取溶劑和5 g無水硫酸鈉，振蕩5 min后超聲10 min，以8 000 r/min離心10 min，取出上清液，殘?jiān)尤?0 mL提取溶劑再次提取，合并提取液于45 ℃水浴氮吹近干，加入2.0 mL乙腈溶解，3.0 mL乙腈飽和正己烷去脂，離心，去除正己烷，取乙腈層過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。

1.3.4凈化方法的選擇

國內(nèi)外農(nóng)藥殘留主要凈化方法有：SPE、GPC和QuEChERS，凈化試劑：無水硫酸鈉、石墨化碳黑(GCB)、氨基(NH2)、PSA、弗羅里硅土和C18等。本文研究對(duì)象為禽肉，試驗(yàn)用QuEChERS方法凈化，根據(jù)禽肉的特性，選擇無水硫酸鈉、PSA和C18為凈化劑。其中無水硫酸鈉能去除水份；PSA用于消除各種有機(jī)酸、脂肪酸、糖類和部分色素的影響；C18可吸附油脂和非極性雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)將考察PSA、C18的用量與回收率的關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器的選擇、曲線范圍和檢出限

將氟吡菌酰胺配制為1.0 ng/mL，在GC-MS/MS和LC-MS/MS上測試10次，由軟件計(jì)算得到的信噪比的平均值以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)見表3。

表3 GC-MS/MS和LC-MS/MS不同濃度下信噪比

以上數(shù)據(jù)可知，同一濃度下LC-MS/MS上的信噪比比GC-MS/MS上的信噪比大且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，因此LC-MS/MS上的靈敏度和精密度優(yōu)于GC-MS/MS。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇LC-MS/MS進(jìn)行測試。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)氟吡菌酰胺濃度在0.5 ng/mL時(shí)，LC-MS/MS上的信噪比和精密度滿足實(shí)驗(yàn)要求，結(jié)合基質(zhì)效應(yīng)的影響，以0.5 ng/mL為基質(zhì)曲線的最低點(diǎn)濃度。當(dāng)氟吡菌酰胺濃度高于50 ng/mL時(shí)，在LC-MS/MS上的響應(yīng)過載，線性相關(guān)系數(shù)不能滿足要求。因此線性范圍定為：0.5 ng/mL ～50 ng/mL，相關(guān)系數(shù)在0.99以上。取陰性基質(zhì)提取液重復(fù)進(jìn)樣20次，計(jì)算出噪聲的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，按公式CL儀器=3×Sb/b(b：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)，得出儀器的檢出限。用儀器的檢出限除以稱樣量，乘以稀釋倍數(shù)，綜合考慮基質(zhì)效應(yīng)，最終確定LOD(檢出限)為0.5 μg/kg。

圖1 氟吡菌酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖(濃度：0.5 ng/mL)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇

基質(zhì)效應(yīng)與基質(zhì)的種類有關(guān)，農(nóng)藥結(jié)構(gòu)、濃度以及檢測器及進(jìn)樣方式也會(huì)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生影響[8]，通常表現(xiàn)為使目標(biāo)物質(zhì)信號(hào)降低或增強(qiáng)。用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率除以溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來表示基質(zhì)效應(yīng)(Me)的大小。具體公式如下。

當(dāng)Me為負(fù)值時(shí)表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，Me為正值時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)，如恰好為0則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)[9]。實(shí)驗(yàn)采用4種陰性禽肉基質(zhì)(雞肉、鴿肉、鴨肉和鵝肉)配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和乙腈配制的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線上機(jī)測試，其相關(guān)系數(shù)、斜率和Me值見表4。

表4 不同溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及斜率、相關(guān)系數(shù)和Me

從Me值得知，禽肉中存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，且4種禽肉之間的斜率較為接近，即基質(zhì)干擾較為相似。由此得出，禽肉中含有相似雜質(zhì)對(duì)氟吡菌酰胺的離子化效率產(chǎn)生干擾，對(duì)其響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線作為定量依據(jù)。

2.3 提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)用雞肉、鴿肉、鴨肉和鵝肉在1.0 μg/kg 、2.0 μg/kg 、5.0 μg/kg濃度處加標(biāo)，分別用乙腈、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈提取，每個(gè)濃度做6平行，計(jì)算出平均回收率，其數(shù)據(jù)見圖2-圖5。

圖2 雞肉基質(zhì)中3種提取溶劑的回收率

圖3 鴿肉基質(zhì)中3種提取溶劑的回收率

圖4 鴨肉基質(zhì)中3種提取溶劑的回收率

圖5 鵝肉基質(zhì)中3種提取溶劑的回收率

由上圖可得，1%甲酸乙腈在4種禽肉基質(zhì)中的平均回收率均高于乙腈和乙酸乙酯提取的回收率。故提取溶劑選用 1%甲酸乙腈。

2.4 凈化方式的選擇

通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(加標(biāo)濃度：10 μg/kg)，在C18粉末用量為100 mg的條件下，測試加入不同質(zhì)量的PSA粉末(0 mg、25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg和200 mg)對(duì)4種禽肉基質(zhì)的凈化效果，觀察回收率的變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖6。

圖6 PSA不同用量的回收率

圖6表明 ，PSA的用量在0 mg ～125 mg時(shí)回收率均為增長趨勢，當(dāng)用量在125 mg ～200 mg時(shí)回收率無明顯增長。為節(jié)省成本，將PSA用量定為125 mg。

在PSA粉末用量為125 mg的條件下，測試用不同質(zhì)量的C18粉末(0 mg、25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg和200 mg)對(duì)4種禽肉基質(zhì)凈化效果，比較其回收率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖7。

圖7 C18不同用量的回收率

圖7可得 ，C18用量在0 mg ～150 mg時(shí)回收率均為增長趨勢，但C18用量在150 mg ～200 mg時(shí)回收率程下降趨勢。C18用量為150 mg時(shí)回收率最佳。

2.5 檢測方法的驗(yàn)證

試驗(yàn)結(jié)果表明：用1%甲酸乙腈提取，使用125 mg PSA以及150 mgC18凈化，LC-MS/MS檢測為禽肉中氟吡菌酰胺最佳檢測方法。通過加標(biāo)回收對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表4所示。

表4 方法優(yōu)化后測得的氟吡菌酰胺的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

使用最佳前處理方法得到的回收率范圍在87.5%～96.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5%～7.7%，能夠滿足日常農(nóng)藥殘留檢測的需求。

3 結(jié)論

本文建立了1%甲酸乙腈提取、QuEChERS凈化、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定禽肉中氟吡菌酰胺殘留量的檢測方法。采用MRM模式掃描，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。考察了線性范圍、基質(zhì)效應(yīng)，確定了檢出限，驗(yàn)證了回收率與精密度，各項(xiàng)參數(shù)均符合實(shí)驗(yàn)室檢測要求。本文對(duì)動(dòng)物源性食品中氟吡菌酰胺檢測的研究起到積極的作用。