王凱華，楊鑫勇，鄭光珊，陳真珍，覃 輝，黃建民

(1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧530200；3.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011)

腦卒中是一種嚴重危害人類生命健康的疾病，其中缺血性卒中約占85%。我國缺血性卒中的發(fā)病率遠高于西方國家，近年來其發(fā)病率、復發(fā)率、致殘率和病死率明顯增高，且發(fā)病年齡逐步年輕化，給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。本病病理基礎多為動脈粥樣硬化，腦組織血液供應障礙，導致局部腦組織缺血缺氧和壞死。目前研究表明缺血性卒中時，神經細胞損傷受炎癥[1]、細胞凋亡[2]、興奮性氨基酸毒性[3]、氧化應激等途徑調控[4]，而近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)線粒體自噬是腦缺血病理過程中重要的保護機制,已成為腦缺血損傷潛在的治療靶點[5]。

缺血性卒中屬于中醫(yī)學中風病范疇，其病機不外“風、火、痰、瘀、虛”五端，屬于難治性疾病的范疇，其病機為年老體衰，或久病氣血虧虛。臨床上缺血性中風風痰阻絡證多見，且常夾濕、夾瘀，臨床以經典方劑溫膽湯治療中風風痰阻絡證獲得良好療效。枳實以其破氣消積、化痰散痞，陳皮以其理氣健脾、燥濕化痰之功入伍溫膽湯方中。柚皮素(Naringenin)屬于二氫黃酮類化合物，是傳統(tǒng)中藥枳實、陳皮中的重要有效成分[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)柚皮素具有較好的抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用，容易穿透血腦屏障，在減輕腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要的作用。但柚皮素減輕腦缺血損傷的作用機制是否與調控線粒體自噬有關，目前尚不明確。因此，本研究擬通過細胞和動物實驗探索柚皮素調控線粒體自噬途徑對小鼠腦缺血后神經細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生6～7周的SPF級C57BL/6J小鼠，體重19.4～21.4 g，由廣西中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號:SCXK(湘)2019-0004。本實驗經本校倫理委員會批準，符合3R原則，倫理編號：DW20210411-075。飼養(yǎng)條件：同周齡小鼠10只/籠，溫度22～25 ℃，濕度70%～75%，自由飲水、進食，光照周期12 h∶12 h。

1.2 主要試劑 柚皮素(N164488)，Mdivi-1抑制劑(HY-15886)，強效裂解液(00020210315)，BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，上海緣葉生物科技有限公司)，Tomm20、Timm23、LC3I/Ⅱ、 Cyt C、Caspase3等一抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，P62、BNIP3一抗(ABclonal)；GAPDH、山羊抗兔血清二抗(美國，Abcam)，二甲基亞砜 (DMSO，000020210315)。

1.3 儀 器 1659001型蛋白電泳儀、Trans-Blot SD 型半干轉膜儀(Bio-Rad)，低溫冷凍離心機(珠海黑馬)，微量分光光度計(北京凱奧)，透射電子顯微鏡(Hitachi)，搖臂顯微鏡、解剖顯微鏡由廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，Bio-Rad 化學發(fā)光成像儀由廣西中醫(yī)藥大學科學實驗中心公共平臺提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物實驗

1.4.1.1 實驗分組：小鼠190只，分為空白組10只，假手術組30只，模型組30只，溶劑組30只，柚皮素組30只，Mdivi-1 抑制劑組30只，抑制劑+柚皮素給藥組30只。除空白組外，其余各組均以1、3、7 d三個時間點進行結果檢測。

1.4.1.2 藥物制備及給藥方式:依次向柚皮素藥品粉末中加入10% DMSO,40% PEG300,5%Tween-80+0.9%氯化鈉溶液,制備澄清的柚皮素(30 mg/kg，0.2 ml/10 g)、抑制劑(50 mg/kg，0.2 ml/10 g)以及柚皮素聯(lián)合抑制劑溶液，每次給藥前配制。每天早10時，每組動物以10%葡萄糖水0.2 ml/10 g灌胃，空白組除外。下午4 時每組腹腔注射給藥，空白組除外，假手術組及模型組予0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，溶劑組予不含藥的溶劑腹腔注射。

1.4.1.3 小鼠腦缺血再灌注損傷模型的建立：參照文獻方法，采用經典的大腦中動脈栓塞法(MCAO) 制備小鼠腦缺血再灌注損傷模型[7-8]。每只大鼠均缺血2 h，再灌注24 h后用于實驗。雄性C57小鼠，七氟烷持續(xù)吸入麻醉，去除顱骨表面組織，接入激光多普勒血流檢測儀，置于顯微鏡下，切開小鼠頸部正中，暴露右頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)，游離CCA至分叉處，結扎后剪斷ECA分支。在距離ECA根部5 mm左右結扎并剪斷ECA。在ECA遠端剪開一個小缺口，邊松開動脈夾，邊將線栓(直徑約0.3 mm)送入ICA，阻斷右側大腦中動脈(RMCA) 起始處血流，多普勒檢測RMCA血流下降至20%則提示RMCA栓塞成功。縫合后把小鼠放在保溫箱中。栓塞2 h時取出線栓。假手術組采用相同的操作方法，不插入線栓。

1.4.1.4 小鼠神經功能缺損測定：再灌注24 h后，采用Bederson評分對小鼠進行神經功能損傷評定，總分為5分。0分：無神經功能缺損癥狀；1分：小鼠不能完全伸展對側前爪；2分：小鼠側推抵抗力下降，并伴向對側轉圈行為；3分：小鼠向對側傾倒；4分：小鼠不能自行行走，意識喪失。評分越高則小鼠神經功損傷越嚴重。

1.4.1.5 小鼠腦梗死體積測定：采用TTC法測定腦梗死體積。分別取各組小鼠，腹腔麻醉后斷頭取腦，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，置于-20 ℃冰箱中速凍20 min，取出后，行冠狀大腦切片，2 mm/片，將切片置于1%TTC中，避光，37 ℃溫孵20 min，每隔7～8 min 翻動1次，染色后以4%多聚甲醛固定。拍照后用圖像分析系統(tǒng)進行分析處理，采用積分法計算梗死體積占全腦體積的百分比。

1.4.1.6 電鏡觀察小鼠線粒體結構和線粒體自噬體分布：各組小鼠于造模后1、3、7 d三個時間點取標本，將腦組織浸泡在電鏡固定液中。取1 mm3小塊組織，快速放入電鏡固定液中，在4 ℃下固定2 h。0.1 mol/L PBS(PH 7.4)洗3次，每次15 min。然后用1%的鋨酸0.1 mol/L PBS(pH 7.4)室溫下固定2 h。腦組織依次置于梯度乙醇，100%丙酮中脫水，15 min/次。包埋后，將樣品插入包埋板后37 ℃烤箱過夜。60 ℃烤箱聚合48 h，使用超薄切片機切制 60～80 nm 超薄切片。鈾鉛雙染色，切片置于室溫中干燥過夜，電子顯微鏡進行觀察，采集圖像進行結果分析。

1.4.2 細胞實驗

1.4.2.1 皮層神經元培養(yǎng)：參照文獻的方法進行小鼠皮層神經細胞的培養(yǎng)[9]。

1.4.2.2 實驗分組：正常組為小鼠皮層神經元正常培養(yǎng)；模型組：正常培養(yǎng)神經元糖氧剝奪/再灌注后繼續(xù)培養(yǎng)48 h；模型+柚皮素組：正常培養(yǎng)神經元糖氧剝奪/再灌注后用含80 μmol/L柚皮素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；正常+柚皮素組：正常培養(yǎng)神經元加用含80 μmol/L 柚皮素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h;模型+抑制劑組：正常培養(yǎng)神經元糖氧剝奪/再灌注后立即用含Mdivi-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；柚皮素+抑制劑組：正常培養(yǎng)神經元糖氧剝奪/再灌注后立即加入Mdivi-1，用含80 μmol/L柚皮素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4.2.3 小鼠皮層神經元糖氧剝奪/再灌注模型(OGD/R)的建立：參照神經細胞缺血再灌注模型制作方法[9],取培養(yǎng)7 d的神經細胞,吸去原培養(yǎng)液,用無糖Earle’s液清洗兩遍后加入無糖Earle’s液維持。將細胞培養(yǎng)皿置于可通氣的低氧細胞培養(yǎng)罐內,向罐內緩慢通入含有95% N2和5% CO2的混合氣體以排除罐內原有的空氣,從而降低氧氣濃度。正壓填充30 min后形成低氧環(huán)境,關閉氣罐,拔掉罐蓋氣體進出連接管,置于恒溫培養(yǎng)箱內(氧糖剝奪,體外模擬缺血缺氧)。90 min后取出缺氧罐,吸去無糖Earle’s液,換回細胞維持培養(yǎng)液,放入恒溫細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)正常培養(yǎng)(復糖復氧,體外模擬再灌注)進行后續(xù)實驗。

1.4.2.4 MTT法檢測細胞活力：無菌環(huán)境下，取出各組細胞培養(yǎng)板，吸棄各孔內培養(yǎng)基，PBS 洗滌各孔3次，各孔內依次加入已配制好的10% MTT溶液，水平晃勻后，放回細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育約 4 h。輕緩吸棄各孔內細胞溶液，并向各孔內加入150 μl DMSO，再繼續(xù)進行孵育，直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan已全部溶解而未見晶體樣物質存在。最后，于酶標儀570 nm波長處測定各孔吸光度值并記錄數(shù)值。

1.4.2.5 電鏡觀察各組細胞線粒體結構和線粒體自噬體、線粒體自噬溶酶體分布:參照文獻方法制作小鼠皮層神經細胞切片，鈾鉛雙染色，切片置于室溫干燥過夜，透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像進行結果分析。

1.4.2.6 Western blot檢測細胞質與線粒體內TOMM20及COX4I1、P62、自噬標記物LC3水平和Cyt C水平:Western blot參照文獻的研究方法[8]。使用細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA進行蛋白定量，用15%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白轉移至VADF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(兔抗鼠多克隆抗體，1∶1000)，4 ℃過夜。TBST清洗3次，加入二抗(羊抗鼠單克隆抗體，1∶3000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌后，用化學發(fā)光顯色法顯影，定影，洗片。用Image J圖像處理軟件分析條帶的灰度值并進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行分析。數(shù)據以均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計描述，組間比較采用單因素方差分析；P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 動物實驗結果

2.1.1 柚皮素對小鼠腦缺血后神經功能缺損的影響：見表1。假手術組和空白組均為0分。各時點模型組與溶劑組之間神經功能缺損評分比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。1 d時，柚皮素組評分低于模型組、溶劑組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3 d時，柚皮素組評分與模型組、溶劑組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學組意義(P<0.05)。7 d時，柚皮素組評分為0，與模型、溶劑組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.1.2 柚皮素對小鼠腦缺血后腦梗死體積的影響：見表2(圖1)。假手術組與模型組、溶劑組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各時間點，模型組與溶劑組之間腦梗死體積比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，柚皮素組腦梗死體積明顯低于模型組、溶劑組，柚皮素組與模型組、溶劑組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 各組小鼠腦梗死體積比率比較(%)

圖1 TTC染色法檢測各組小鼠腦梗死情況

2.1.3 柚皮素對小鼠線粒體結構和線粒體自噬體分布的影響：空白無圖組、假手術組線粒體結構正常，未見線粒體自噬體形成。模型組、溶劑組均可見部分線粒體輕度腫脹，膜密度增加，少量線粒體自噬現(xiàn)象。柚皮素組細胞漿可見大量自噬體形成，部分線粒體腫脹、空泡變性，線粒體膜膜密度增加，大量線粒體自噬，其自噬程度1 d<3 d<7 d。Mdivi-1抑制劑組可見部分線粒體輕度腫脹，膜密度增加，細胞胞漿偶見少量線粒體自噬，少量自噬體形成。柚皮素+抑制劑組可見少量線粒體自噬現(xiàn)象，少量線粒體部分輕度腫脹，部分線粒體嵴排列紊亂，細胞胞漿偶見自噬體形成。隨著給藥時間的增加，線粒體自噬率隨之增加(圖2)。

圖2 各組電鏡線粒體微觀結構(×5000)

2.2 細胞實驗結果

2.2.1 小鼠原代皮層神經元培養(yǎng)結果：小鼠原代皮層神經元培養(yǎng)結果顯示，神經細胞胞體飽滿,突起相互交織成網絡,細胞狀態(tài)良好(圖3)。

A:貼壁培養(yǎng)1 d的皮層神經元(×100)；B、C:貼壁培養(yǎng)7 d的皮層神經元(×200)；D:貼壁培養(yǎng)皮層神經元及經NSE熒光染色(×100)

2.2.2 MTT法檢測細胞活力：見表3。MTT法檢測神經細胞細胞活力，在0、1 d時，各組之間細胞活力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3、7 d時，各組間細胞活力皆與0 d時比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3 d時，其余各組與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；除正常組外，其余各組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。至7 d時，各組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；除正常組外，其余各組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組間MTT法細胞活力比較(%)

2.2.3 電鏡觀察小鼠神經細胞線粒體結構和線粒體自噬體分布：空白組線粒體結構正常，偶可見極少數(shù)線粒體自噬體形成，正常+柚皮素組結果同空白組一致。模型組可見部分線粒體輕度腫脹，膜密度增加，少量線粒體自噬現(xiàn)象。柚皮素組可見胞漿內大量髓樣小體、自噬體形成，線粒體膜欠完整，膜密度增加。模型+抑制劑組可見少部分線粒體輕度腫脹，膜密度增加，細胞胞漿僅偶見少量線粒體自噬體形成。柚皮素+抑制劑組可見少量線粒體部分輕度腫脹，少數(shù)線粒體膜密度輕度增加，細胞胞漿偶見髓樣小體、自噬體形成(圖4)。

圖4 電鏡觀察小鼠神經細胞線粒體微觀結構(×5000)

2.2.4 Western blot檢測細胞質與線粒體內TOMM20及COX4I1、P62、自噬標記物LC3水平和Cyt C水平：見圖5。正常+柚皮素組自噬相關蛋白P62、LC3、COX4I1、TOMM20表達水平高于柚皮素組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組與模型+抑制劑組自噬相關蛋白表達水平均低于柚皮素組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型+柚皮素組自噬相關的蛋白表達水平均高于模型組與模型+抑制劑組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。柚皮素+抑制劑組自噬相關蛋白表達水平較模型+抑制劑組升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型+抑制劑組細胞質內的細胞損傷標準蛋白Cyt C表達水平明顯高于其他組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 各組細胞自噬相關蛋白表達情況

3 討 論

缺血性腦卒中屬于臨床神經內科常見疾病，是指腦血栓形成或在腦血栓的基礎上導致腦梗死而引起的神經功能缺損，如偏癱和意識障礙等一系列相關病癥[10]。現(xiàn)代醫(yī)學認為，本病病理基礎多為動脈粥樣硬化，腦組織血液供應障礙，導致局部腦組織缺血缺氧和壞死[11]。如何盡快恢復腦組織血供，防止缺血再灌注損傷，挽救神經元，恢復其功能是治療的關鍵。從中醫(yī)理論出發(fā)，缺血性腦卒中相當于中醫(yī)學的“中風”等疾病，屬于難治性疾病的范疇，其病機為年老體衰，或久病氣血虧虛，元氣耗傷，腦脈失養(yǎng)，氣虛不能運血，血液運行不暢，經脈失養(yǎng)，腦脈不充，導致氣滯、血瘀或津阻痰凝，痰瘀互結阻脈，腦脈失養(yǎng)，虛實夾雜，正虛邪戀，導致疾病纏綿難愈[12]?！峨y經·八難》說：“氣者，人之根本也”，氣虛則氣化功能障礙，脾胃不能化生水谷精氣，水谷精氣不能轉化為營氣和津液，則血無以化生，從而導致血脈空虛?！端貑枴び駲C真藏論篇第十九》也指出:“氣虛身中卒至，五臟絕閉，脈道不通”。王清任根據自己的實踐認為“無論外感、內傷……所傷者無非氣血”，元氣虛不能達于血管，血液無氣推動，必停而留瘀，指出半身不遂主因在于元氣虛損。治療當標本兼治，急性期以祛邪為主，虛實夾雜者宜攻補兼施。

研究表明柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、降脂、降血糖等藥理作用[6]。最近有研究發(fā)現(xiàn)柚皮素干預對永久性腦缺血大鼠模型動物具有神經保護作用[13],攝入含有柚皮素作為活性成分的枳實、陳皮可能有助于預防缺血性卒中[14]。我們團隊前期發(fā)現(xiàn)柚皮素通過增強腦缺血小鼠腦內NRF2基因的表達，阻止線粒體去極化，促進線粒體自噬，從而減輕小鼠腦缺血再灌注損傷[15-16]。

本研究結果表明，腦缺血再灌注損傷1、3、7 d后，柚皮素組小鼠與模型組和溶劑組相比，神經功能缺損評分降低，神經功能缺損程度減輕，腦梗死體積縮小。3、7 d時柚皮素+模型組神經元細胞活力較模型組明顯增強。以上結果表明柚皮素可以有效減輕小鼠腦缺血再灌注損傷，具有較好的神經保護作用。

最新研究表明，線粒體功能失調是加重造成腦缺血再灌注不可逆損傷的主要因素之一。線粒體是進行能量代謝、維持氧化還原平衡的重要細胞器，是腦缺血后神經細胞死亡的關鍵靶區(qū)，也是決定神經細胞能否存活的關鍵因素[17-19]。腦缺血可以誘導缺血區(qū)神經細胞發(fā)生線粒體自噬,過程中進一步激活線粒體自噬可產生顯著的神經保護作用[20]。本研究通過透射電鏡觀察腦缺血小鼠神經細胞線粒體結構變化和線粒體自噬體分布情況，結果表明腦缺血會引起神經細胞線粒體腫脹，線粒體自噬增加。柚皮素組可引起神經細胞內大量線粒體自噬，線粒體自噬程度隨時間增加而增強，線粒體抑制劑可抑制線粒體自噬。柚皮素組細胞自噬相關蛋白P62、LC3、COX4I1、TOMM20表達水平高于正常組，模型組細胞自噬相關蛋白表達水平高于模型+抑制劑組，柚皮素+Mdi組自噬相關蛋白表達水平較模型+抑制劑組升高，說明柚皮素可促進線粒體自噬，柚皮素對腦缺血損傷后神經細胞的保護作用可能是通過激活線粒體自噬實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究通過動物及細胞實驗表明，柚皮素可以有效減輕小鼠腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮神經保護作用，其機制可能是通過激活并增加線粒體自噬，線粒體自噬具有顯著的神經保護作用。本研究的結果對于進一步開發(fā)有效的神經保護制劑提供了客觀依據。