劉琨毅，王利妍，安江珊，羅慧，王興華,3，馬燕，呂才有，趙明

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)院/食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 昆明 650201；2.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644003； 3.普洱市茶葉科學(xué)研究所，云南 普洱 665000

0 引言

云南普洱茶是我國特有的名茶，其茶湯呈紅褐色,滋味醇厚回甘、陳香顯著[1]。據(jù)報(bào)道[2-3]，普洱茶可以調(diào)節(jié)人體腸道微生物菌群，具有抗高脂血癥、抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防糖尿病等多種保健功能。普洱茶獨(dú)特的風(fēng)味和保健功能主要?dú)w因于其發(fā)酵過程中的微生物作用[4-5]，但在傳統(tǒng)普洱茶自然發(fā)酵(Natural Fermentation，NF)過程中，往往存在微生物來源復(fù)雜、不可控等因素，從而導(dǎo)致其品質(zhì)不穩(wěn)定等問題[6]。

強(qiáng)化發(fā)酵(Enhanced Fermentation，EF)是將一種或多種外源微生物接入未經(jīng)滅菌的原料中進(jìn)行發(fā)酵，以提高發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的技術(shù)[7]。例如，乳酸菌強(qiáng)化發(fā)酵紅酸湯可以明顯減少亞硝酸鹽的含量[8]，黑曲霉強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶可改善普洱茶的感官品質(zhì)[9]。目前，強(qiáng)化發(fā)酵技術(shù)在白酒[10-11]、食醋[12]等發(fā)酵食品生產(chǎn)過程中已有較廣泛的應(yīng)用，并達(dá)到了提高發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的目的，但強(qiáng)化發(fā)酵技術(shù)在普洱茶生產(chǎn)過程中的應(yīng)用及其對(duì)普洱茶微生物群落結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的影響卻鮮有報(bào)道。

阿曲霉(Aspergillusamstelodami)是一種能產(chǎn)纖維素酶的真菌，對(duì)形成普洱茶的品質(zhì)特征具有積極作用[13]。謝曉晨等[14]研究證實(shí)，阿曲霉是小青柑(一款普洱茶產(chǎn)品)的優(yōu)勢真菌。因此，將阿曲霉應(yīng)用于普洱茶發(fā)酵不失為一種有益的探索，但接種阿曲霉發(fā)酵的普洱茶的感官特征、化學(xué)成分及微生物群落結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步研究，以探究該菌用于發(fā)酵普洱茶的可行性。

基于此，本研究擬將從普洱茶中分離獲得的阿曲霉A1接種于滅菌和未滅菌的曬青茶中，分別進(jìn)行普洱茶的純菌發(fā)酵(Pure Fermentation，PF)和強(qiáng)化發(fā)酵，分析發(fā)酵茶樣的感官特征、化學(xué)成分及微生物群落結(jié)構(gòu)，以期獲得一種提高普洱茶品質(zhì)的有效方法，為高品質(zhì)普洱茶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

曬青茶(選取一芽三葉的云南大葉種云抗10號(hào)茶樹鮮葉，經(jīng)攤放、殺青、揉捻、日光干燥至含水量低于10%后制得)，云南省普洱市茶葉科學(xué)研究所研制；兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、沒食子酸(GA)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、沒食子兒茶素(GC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、咖啡堿(CA)、鞣花酸(EA)、楊梅素(MY)、木犀草素(LU)、槲皮素(QU)、山奈酚(KA)的標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；真菌DNA提取試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CP214型電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)；756CRT型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)；1200型高速液相色譜，配有TSKgel ODS-80TM色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，美國安捷倫公司產(chǎn)；Trident 960型基因擴(kuò)增儀，上海力新儀器有限公司產(chǎn)；CT15RE型離心機(jī)，日本日立公司產(chǎn)；SW-CJ-1B型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)；YS6060型色差儀，深圳市三恩時(shí)科技有限公司產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的分離鑒定從普洱茶(涇普茯茶)中分離純化得到菌株A1，對(duì)其ITS序列進(jìn)行DNA測序分析[15]，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，以明確該菌株為阿曲霉。

1.3.2 阿曲霉A1菌懸液的制備將阿曲霉A1接種于PDA培養(yǎng)基中，于25 ℃條件下培養(yǎng)7 d。用無菌生理鹽水洗脫孢子，完成計(jì)數(shù)后，利用無菌生理鹽水將孢子濃度調(diào)整至1×107CFU/mL，隨后將1 mL孢子懸液接種至100 mL茶葉培養(yǎng)基中，于25 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4 d，菌體計(jì)數(shù)后利用無菌生理鹽水將菌體濃度調(diào)整至1×107CFU/mL，即得阿曲霉A1菌懸液。其中，茶葉培養(yǎng)基是用2 L蒸餾水于100 ℃條件下浸泡100 g曬青茶30 min，經(jīng)4層紗布過濾后，于121 ℃條件下滅菌20 min而成。

1.3.3 阿曲霉A1純菌發(fā)酵普洱茶方法稱取100 g曬青茶(RM)置于500 mL三角瓶中，加入40 mL蒸餾水，濕熱(121 ℃，20 min)滅菌，冷卻后待用。將阿曲霉A1菌懸液接種于滅菌茶樣中，于28 ℃、相對(duì)濕度60%的培養(yǎng)箱中發(fā)酵20 d后取出，于-80 ℃貯藏待用，樣品命名為PF；將滅菌茶樣不接菌，進(jìn)行相同操作后作為對(duì)照樣品(CK)。每組樣品均進(jìn)行3次重復(fù)發(fā)酵。

1.3.4 阿曲霉A1強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶方法在云南省普洱市茶葉科學(xué)研究所開展強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶實(shí)驗(yàn)。稱取曬青茶25 kg裝入發(fā)酵筐中，加入10 L蒸餾水，再加入250 mL阿曲霉A1菌懸液，攪拌混勻后進(jìn)行發(fā)酵，每隔5 d翻堆一次，25 d后發(fā)酵完成。在每次翻堆前，采用五點(diǎn)取樣法取樣，樣品于-80 ℃貯藏待用，其中接種阿曲霉A1的翻堆樣品依次命名為EF1～5，自然發(fā)酵的樣品(未接種阿曲霉A1)依次命名為NF1～5。每組樣品均進(jìn)行3次重復(fù)發(fā)酵。

1.3.5 茶葉化學(xué)成分測定及感官審評(píng)參考M.Zhao等[4]的方法，分別采用恒重法、福林酚比色法[16]、茚三酮比色法、蒽酮法測定茶樣水浸出物(Water Extracts，WE)、茶多酚(Tea Polyphenols，TP)、游離氨基酸(Free Amino Acids，F(xiàn)AA)及可溶性糖(Soluble Sugars，SS)含量；采用萃取比色法[17]測定茶樣茶黃素(Theaflavins，TF)、茶紅素(Thearubigins，TR)及茶褐素(Theabrownins，TB)含量；采用課題組建立的高效液相色譜法[5](High Performance Liquid Chromatography，HPLC)定量分析茶樣中的GA、CA、EA、QU、LU、KA、MY、C、EC、EGC、ECG、EGCG、GC、GCG和CG含量。9位評(píng)茶員根據(jù)《茶葉感官審評(píng)方法》(GB/T 23776—2018)[18]及胡圓圓等[19]對(duì)普洱茶的感官審評(píng)方法,從干茶外形、湯色、香氣、滋味和葉底5個(gè)項(xiàng)目對(duì)茶樣進(jìn)行專業(yè)審評(píng)，采用百分制評(píng)分，每5分為一檔，2～3分為半檔；將5個(gè)項(xiàng)目評(píng)分分別與其評(píng)分系數(shù)20%、15%、25%、30%、10%相乘，并將各個(gè)乘積值相加，即為該茶樣感官審評(píng)的總分。同時(shí)利用色差儀對(duì)茶湯的顏色進(jìn)行測定。

1.3.6 基于高通量測序進(jìn)行微生物多樣性分析采用真菌DNA提取試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒分別提取接種阿曲霉A1普洱茶樣品的真菌和細(xì)菌的DNA，應(yīng)用DNA聚合酶(2×Rapid Taq Master Mix)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)。其中，利用引物338F和806R擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3—V4區(qū)，以引物ITS5-1737F和ITS2-2043R擴(kuò)增真菌ITS1的V2區(qū)。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并委托深圳微生態(tài)公司，應(yīng)用Illumina MiSeq測序平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因測序[20]。應(yīng)用QIIME 2.0軟件對(duì)獲得的序列按97%的相似度進(jìn)行聚類和OTU劃分，計(jì)算群落豐度(ACE指數(shù)、Chao1指數(shù))和Alpha多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))，評(píng)估每個(gè)樣品的微生物多樣性水平[21]。測序序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(Release 13.8，http:∥greengenes.secondgenome.com)和Silva數(shù)據(jù)庫(Release115，http:∥www.arb-silva.de)進(jìn)行比對(duì)，找出最接近且可信度達(dá)80%以上的種屬信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示；采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)；基因測序結(jié)果已上傳至National Center for Biotechnology Information(NCBI)基因數(shù)據(jù)庫(https:∥bigd.big.ac.cn/bioproject)，編號(hào)為MZ576486和PRJNA691718。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿曲霉A1的分離鑒定結(jié)果分析

將菌株A1測序所得序列與NCBI基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，選擇模式物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，菌株A1與A.amstelodami聚為一支，故將菌株A1命名為阿曲霉A1(A.amstelodamiA1)。

圖1 菌株A1的ITS核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 阿曲霉A1純菌發(fā)酵對(duì)茶葉感官及特征成分的影響分析

對(duì)阿曲霉A1純菌發(fā)酵普洱茶茶樣進(jìn)行感官審評(píng)，純菌發(fā)酵茶樣的茶湯呈橙紅色，滋味醇厚，對(duì)照樣品的茶湯呈黃綠色，澀味較突出。這表明阿曲霉A1純菌發(fā)酵能改善曬青茶的感官品質(zhì)，并與普洱茶的感官特征(茶湯呈紅褐色、滋味醇厚回甘)相似[22]。不同茶樣中22種茶葉特征成分的聚類熱圖如圖2所示,其中，不同肩標(biāo)小寫字母表示同一種特征成分含量之間具有顯著性差異(P<0.05)。由圖2可知，與對(duì)照樣品相比，純菌發(fā)酵茶樣中茶多酚(TP)和5種兒茶素(GCG、CG、ECG、EGCG、EGC)含量均顯著降低(P<0.05)，促使其茶湯苦澀度降低；而純菌發(fā)酵茶樣中茶紅素(TR)和茶褐素(TB)含量均顯著增加(P<0.05)，使得其茶湯由黃綠色變?yōu)槌燃t色，這些茶葉特征成分的變化也與傳統(tǒng)普洱茶發(fā)酵過程中特征成分的變化相似[23]。由此可以推斷,阿曲霉A1對(duì)普洱茶的發(fā)酵具有積極作用，可將阿曲霉A1接種到曬青茶中進(jìn)行普洱茶的強(qiáng)化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.3 阿曲霉A1強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)茶葉感官及特征成分的影響分析

自然發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的感官特征、評(píng)分和審評(píng)結(jié)果見表1和圖3，其中*表示自然發(fā)酵茶樣與強(qiáng)化發(fā)酵茶樣具有顯著性差異(P<0.05)。由表1和圖3可知，經(jīng)自然發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵處理后，茶樣的茶湯均呈紅褐色、滋味醇厚回甘、香氣純正，但強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的茶湯顏色更深、滋味更醇厚、香氣略帶怡人的陳香，且其干茶外形、湯色、滋味、香氣和葉底的感官審評(píng)分?jǐn)?shù)均顯著高于自然發(fā)酵茶樣(P<0.05)。由圖3c)可知，強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的茶湯其a*值(24.80±0.65)和b*值(76.73±1.38)均顯著高于自然發(fā)酵茶樣(P<0.05)，而其L*值(69.48±0.81)顯著低于自然發(fā)酵茶樣(P<0.05)，這進(jìn)一步說明了強(qiáng)化發(fā)酵茶樣具有更深的紅褐色。結(jié)合圖2可知，強(qiáng)化發(fā)酵茶樣中TB和SS的含量均顯著高于自然發(fā)酵茶樣(P<0.05)，這與感官審評(píng)中強(qiáng)化發(fā)酵茶樣具有更深的紅褐色和更顯著的甜味結(jié)果一致；而強(qiáng)化發(fā)酵茶樣中C、CA、EC和EGC的含量均顯著低于自然發(fā)酵茶樣(P<0.05)，驗(yàn)證了強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的苦澀度較自然發(fā)酵茶樣更低。由此可知，阿曲霉A1強(qiáng)化發(fā)酵提高了普洱茶的感官品質(zhì)。

圖2 不同茶樣中22種茶葉特征成分的聚類熱圖

圖3 自然發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的感官審評(píng)結(jié)果

表1 自然發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的感官特征及評(píng)分

2.4 阿曲霉A1強(qiáng)化發(fā)酵茶樣微生物群落結(jié)構(gòu)分析

自然發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的微生物群落豐度及Alpha多樣性指數(shù)見表2。由表2可知，經(jīng)過QIIME2.0軟件檢查并剔除嵌合體序列等疑問序列后，得到54 330～77 742個(gè)序列，歸類為503～833個(gè)真菌OTUs、482～2050個(gè)細(xì)菌OTUs。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，強(qiáng)化發(fā)酵茶樣中微生物群落豐度及Alpha多樣性指數(shù)均增加，但在發(fā)酵后期(EF5)均下降，與自然發(fā)酵茶樣中微生物群落豐度及Alpha多樣性指數(shù)在發(fā)酵后期(NF5)仍繼續(xù)上升形成差異。強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)茶樣真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響如圖4和圖5所示，其中，圖4b)中，C為微小根毛霉，D為食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母，E為黑曲霉，F(xiàn)為Brunneoclavisporabambusae，G為馬克斯克魯維酵母，H為煙曲霉，I為Paraphysodermasedebokerense，J為疏綿狀嗜熱絲孢菌，K為Cyberlindnerasp.RODW5，L為Rogersellagriseliniae，M為布蘭克假絲酵母，N為Endogonecorticioides，O為阿曲霉，P為其他真菌；圖5b)中，C為芽孢桿菌，D為短狀桿菌，E為短桿菌，F(xiàn)為伯克氏菌，G為金黃桿菌，H為腸桿菌，I為腸球菌，J為歐文氏菌，K為埃希氏菌，L為克雷白氏菌，M為考克氏菌，N為甲基桿菌，O為微桿菌，P為蒼白桿菌，Q為擬桿菌，R為假單胞菌，S為羅爾斯頓菌，T為鞘氨醇桿菌，U為葡萄球菌，V為結(jié)核桿菌，W為Xylella，X為其他細(xì)菌。由圖4a)和圖5a)可知，在發(fā)酵過程中，自然發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化，且在各個(gè)階段差異顯著，這主要是因?yàn)榘l(fā)酵過程中茶樣化學(xué)成分的不斷變化及微生物之間的相互作用(如共生和拮抗作用)[24]。

表2 自然發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的微生物群落豐度及Alpha多樣性指數(shù)

圖5 強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)茶樣細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖4b)可知，原料(RM)中的優(yōu)勢真菌為B.bambusae(41.50%)、黑曲霉(21.18%)和馬克斯克魯維酵母(17.27%)。在強(qiáng)化發(fā)酵各階段中，均檢測到了阿曲霉(0.01%～0.03%)，但不是優(yōu)勢真菌；而B.bambusae(41.91%)是發(fā)酵初期(EF1)的優(yōu)勢真菌；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微小根毛霉(41.68%～66.42%)迅速生長繁殖，在發(fā)酵中期(EF2～4)成為優(yōu)勢真菌；食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(72.61%)在發(fā)酵后期(EF5)成為優(yōu)勢真菌；黑曲霉(8.64%～33.74%)在整個(gè)發(fā)酵階段均為優(yōu)勢真菌。在自然發(fā)酵過程中，黑曲霉始終是優(yōu)勢真菌(26.64%～37.40%)；此外，發(fā)酵初期(NF1)的優(yōu)勢真菌還包括馬克斯克魯維酵母(31.28%)；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微小根毛霉(37.48%～61.22%)迅速繁殖，與黑曲霉共同成為發(fā)酵中后期(NF2～5)的優(yōu)勢真菌。由此可知，雖然在發(fā)酵初期將阿曲霉A1接種到未經(jīng)滅菌的曬青茶中進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，但整個(gè)發(fā)酵過程處于開放狀態(tài)，環(huán)境中的微生物也會(huì)進(jìn)入發(fā)酵系統(tǒng)[10]，適合在茶葉中生長的微生物就會(huì)在這種發(fā)酵體系中生長繁殖。

由圖5b)可知，RM中的優(yōu)勢細(xì)菌主要是腸桿菌(20.94%)、金黃桿菌(16.65%)和假單胞菌(6.90%)。在強(qiáng)化發(fā)酵過程中，芽孢桿菌(39.01%～52.50%)是發(fā)酵前中期(EF1～3)的優(yōu)勢細(xì)菌；隨著發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行，葡萄球菌(12.11%～34.37%)和芽孢桿菌(19.63%～37.39%)共同成為發(fā)酵中后期(EF4～5)的優(yōu)勢細(xì)菌。在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期(NF1)的優(yōu)勢細(xì)菌主要是埃希氏菌(32.41%)、克雷白氏菌(27.41%)和假單胞菌(24.54%)；芽孢桿菌(37.07%)在發(fā)酵中期(EF3)成為優(yōu)勢細(xì)菌；而在發(fā)酵后期(EF5)，埃希氏菌(16.46%)再次成為優(yōu)勢細(xì)菌。

綜上所述，盡管在接種阿曲霉A1進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵過程中，阿曲霉在茶樣真菌群落中所占比例有限，但相對(duì)自然發(fā)酵顯著改變了其他微生物的相對(duì)豐度，例如增加了B.bambusae、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母、葡萄球菌和芽孢桿菌的相對(duì)豐度，降低了黑曲霉、馬克斯克魯維酵母、埃希氏菌、克雷白氏菌和假單胞菌的相對(duì)豐度，這也解釋了強(qiáng)化發(fā)酵茶樣的感官及特征成分的變化原因。

3 結(jié)論

本文將分離自普洱茶的阿曲霉A1接種于滅菌和未滅菌的曬青茶中，分別進(jìn)行了純菌發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵，進(jìn)而分析了發(fā)酵茶樣的感官特征、化學(xué)成分及微生物群落結(jié)構(gòu)。經(jīng)純菌發(fā)酵后，茶樣中茶多酚和5種兒茶素含量均顯著降低，茶紅素和茶褐素含量均顯著增加。經(jīng)強(qiáng)化發(fā)酵后，茶樣中茶褐素和可溶性多糖含量均顯著高于自然發(fā)酵，而兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素和咖啡堿含量均顯著降低；茶湯的感官特征也隨之發(fā)生變化，例如，a*值、b*值及干茶外形、湯色、滋味、香氣、葉底的感官評(píng)分均顯著升高，L*值顯著降低。雖然阿曲霉A1在強(qiáng)化發(fā)酵的真菌群落中只占很小的比例，但其促使了其他幾種主要微生物相對(duì)豐度的顯著變化，因此，阿曲霉A1通過與其他微生物的協(xié)同作用改變了普洱茶中茶葉的特征成分，從而提高了普洱茶的感官品質(zhì)。本研究為改善傳統(tǒng)普洱茶發(fā)酵工藝提供了新思路，并為后續(xù)進(jìn)行多菌種的普洱茶強(qiáng)化發(fā)酵乃至實(shí)現(xiàn)普洱茶工業(yè)化的控菌發(fā)酵起到了一定的推動(dòng)作用，后續(xù)也將對(duì)阿曲霉A1強(qiáng)化發(fā)酵普洱茶的作用機(jī)理及安全性展開進(jìn)一步研究。