張 超，鄧 勇，黃思齊，伍應(yīng)保，張高陽(yáng)，滿(mǎn)百膺，李德芳 *

（1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205）

0 引言

【研究意義】紅麻（Hibiscus cannabinusL.）為錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維作物，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值不僅僅體現(xiàn)于纖維利用，在材料、生物能源、醫(yī)用、飼料、造紙及碳匯交易等多方面都具有重要的研究前景[1?3]；在生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)紅麻具有生長(zhǎng)速度快、生物量大等特點(diǎn)，作為畜禽飼料的價(jià)值也尤為突出：紅麻生長(zhǎng)速度快，葉片中含黃酮和多酚，抗蟲(chóng)能力強(qiáng)，無(wú)需施藥，屬于天然綠色蛋白飼料[4]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)畜牧業(yè)飛速進(jìn)步，飼料產(chǎn)業(yè)一躍而起，如何提高飼料的品質(zhì)成為關(guān)鍵問(wèn)題[5]。亞硝酸還原酶NiR（Nitrite reductase）是植物硝態(tài)氮同化過(guò)程中重要的酶。植物從土壤里攝取氮素一般可以分為兩種形式，一種是以硝態(tài)氮形式進(jìn)入植物體中，該形式必須首先經(jīng)歷一個(gè)還原過(guò)程方可被同化為有機(jī)含氮化合物；而另一種是以氨態(tài)氮形式進(jìn)入植物體后，直接被結(jié)合成含氮的有機(jī)物。亞硝酸還原酶NiR與硝 酸 還 原 酶（ Nitrate reductase，NR） 偶 聯(lián) 完成NO3?無(wú)機(jī)同化[6]，繼而NO2?進(jìn)一步被NiR還原酶還原成NH4+，該酶在硝酸鹽降解并生成銨的過(guò)程中起承前啟后的作用。硝酸還原酶是NO3?無(wú)機(jī)同化步驟中的第一個(gè)酶，也是整個(gè)過(guò)程的限速酶，而亞硝酸還原酶是NO3?無(wú)機(jī)同化的控制酶，兩個(gè)酶偶聯(lián)完成NO3?的無(wú)機(jī)同化[7,8]。本研究通過(guò)克隆紅麻亞硝酸還原酶基因HcNiR，研究其編碼蛋白的生物信息學(xué)與表達(dá)特性，對(duì)了解紅麻氮代謝調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)功能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】相對(duì)于硝酸還原酶NR，亞硝酸還原酶NiR相關(guān)的研究并不多見(jiàn)，其生物學(xué)功能也未明確。Lahners等[9]對(duì)ZmNiR基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，并獲得該基因的分子結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列與菠菜序列相比有86%的相似性，該基因參與對(duì)氮吸收的調(diào)節(jié)。Wang等[10]通過(guò)研究擬南芥根中硝酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在氮饑餓的條件下，由于硝酸鹽量的增加，亞硝酸還原酶mRNA也具有了較高的表達(dá)量。Takahashi等[11]將菠菜亞硝酸還原酶NiR基因?qū)霐M南芥中得出，NiR-mRNA與NiR的總蛋白含量（r=0.74）、NiR總蛋白與NiRA（r=0.71）、NiRA與通過(guò)分析NO2產(chǎn)生的還原氮同化NO2（r=0.65）均呈顯著正相關(guān)，結(jié)果證實(shí)NiR為植物無(wú)機(jī)氮循環(huán)中NO2–同化部分的控制酶；Kato等[12]等研究發(fā)現(xiàn)煙草中含有4個(gè)不同的NiR基因，且在葉片和根系中均有表達(dá)，且與氮吸收相關(guān)。Ozawa等[13]克隆一個(gè)水稻的NiR基因，將該基因在水稻品種越光中超量表達(dá)，提高了其愈傷組織的生長(zhǎng)及再生能力，可作為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因水稻高產(chǎn)的選擇系統(tǒng)。夏磊等[14]克隆了黃瓜亞硝酸還原酶基因CsNiR，研究發(fā)現(xiàn)其活性與外植體分化率表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期研究中利用不同蛋白含量飼用紅麻葉片轉(zhuǎn)錄組與蛋白組測(cè)序聯(lián)合分析得到紅麻亞硝酸還原酶關(guān)鍵基因HcNiR，根據(jù)其基因序列設(shè)計(jì)引物克隆該基因。但其作為亞硝酸還原酶基因功能還未被確定，在生物信息學(xué)方面仍有較多值得挖掘的地方?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆紅麻HcNiR基因并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和組織特異性表達(dá)分析，為更進(jìn)一步研究該基因在紅麻氮代謝調(diào)控機(jī)制及培育紅麻氮高效利用品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

供試紅麻材料349由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所一年生麻類(lèi)作物育種團(tuán)隊(duì)提供，該材料在70多個(gè)具有代表性的紅麻材料中經(jīng)多年試驗(yàn)得出，其葉片具有較高的粗蛋白含量（27.36%）[15]；主要試劑：KOD-FX高保真酶[東洋紡（上海）生物科技有限公司 ]，GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit （北 京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司），零背景pTOPO-TA/Blunt Simple克隆試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司），PC33-2xSybr Green qPCR Mix（北京艾德萊生物科技有限公司）。

1.2 紅麻葉片總 RNA 提取

取萌發(fā)后培養(yǎng)45 d長(zhǎng)勢(shì)良好的紅麻葉片約100 mg，液氮中快速研磨成微小粉末狀，紅麻葉片RNA提取步驟按照EASY spinPlus多糖多酚復(fù)雜植物總RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，13 μL預(yù)處理DEPC水溶解，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA是否完整。

1.3 HcNiR 基因引物設(shè)計(jì)

根據(jù)HcNiR基因序列設(shè)計(jì)引物（表1），內(nèi)參基因beta-actin選擇參考文獻(xiàn)[16]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 目的基因 PCR 擴(kuò)增

以紅麻葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴(kuò)增紅麻HcNiR基因cDNA全長(zhǎng)序列，PCR反應(yīng)體系為25 μL：cDNA 1 μL，2× PCR Buffer 12.5 μL，dNTPs（2 mmol·L?1）5 μL，KOD FX (1 U·μL?1) 1 μL，上游引物HcNiR-F 1 μL，下游引物HcNiR-R 1 μL，ddH2O 補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，32 個(gè)循環(huán)反應(yīng)（94 ℃ 30 s變性，58 ℃ 30 s復(fù)性，72 ℃ 1.5 min 延伸），72 ℃ 終延伸 10 min，4 ℃ 保存 PCR 產(chǎn)物。引物合成及測(cè)序工作由北京擎科生物有限公司完成。

1.5 目的片段與載體的連接與轉(zhuǎn)化

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的DNA片段，加入溶膠液徹底溶解后進(jìn)行膠回收，連接到T載體，利用凍融法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布于含氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)14 h左右。挑取白色單菌落，搖菌待菌液完全渾濁后作菌液PCR鑒定并測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

利 用 SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域，利用 TMHM Server v.2.0 （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；利用Signal IP工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；Protscale模體數(shù)據(jù)庫(kù)（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性；利用 NetPhos 2.0 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；利用ExPASy軟件ProtParam 程序（http://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列特性；ProtComp v.9.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http://linux1.softberry.com/berry.phtml）預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位；SOPMA 和 Phyre （http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/）軟件依次預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)；且從NCBI中收集已知各物種NiR基因序列，利用ClustalX比對(duì)蛋白質(zhì)序列，MEGA7.0軟件設(shè)置以鄰接法用于構(gòu)建HcNiR基因與其他物種NiR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[17]。

1.7 組織特異性分析

將低溫保存的紅麻種子用75%酒精清洗并擦干，種子放置于發(fā)芽盒中， 25 ℃ 萌發(fā) 7 d 轉(zhuǎn)入溫室水培。生長(zhǎng)條件設(shè)定：晝夜溫度25/20 ℃，光周期16/8 h（光/暗），相對(duì)濕度 60%，光強(qiáng)度 700 μmol·m?2，1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，兩天更換一次。培養(yǎng)45 d后取紅麻葉片、根部分組織。提取紅麻總 RNA，使用金牌逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京擎科生物有限公司，北京）反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，選取beta-actin作為內(nèi)參基因；以各樣品的cDNA為模板，根據(jù)PC33-2xSybr Green qPCR Mix說(shuō)明書(shū)在實(shí)時(shí)定量PCR儀（BIO-RAD CFX96）上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)不同組織HcNiR基因在轉(zhuǎn)錄水平上的相對(duì)表達(dá)水平，采用2?ΔΔCT算法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HcNiR 基因克隆和序列特征

基于紅麻葉片轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增紅麻HcNiR基因的cDNA 序列，結(jié)果獲得一條大小約1500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，該基因含有一個(gè)1395 bp 的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼 464 個(gè)氨基酸。用SMART 軟件對(duì)紅麻 HcNiR蛋白進(jìn)行序列分析，分析結(jié)果如圖2，HcNiR氨基酸序列中包含2個(gè)保守的亞硝酸和亞硫酸還原酶4Fe-4S結(jié)合域（Nitrite and sulphite reductase 4Fe-4S domain）分別位于 74~234 aa和335~459 aa，同時(shí)還具有2個(gè)亞硝酸/亞硫酸還原酶鐵氧蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白部分結(jié)構(gòu)域（Nitrite/Sulfite reductase ferredoxin-like half domain），分別位于 1~66 aa和 257~323 aa。

圖1 HcNiR基因克隆的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis of HcNiR cloning result

圖2 HcNiR蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)Fig.2 Predicted conserved domain of HcNiR protein

2.2 紅麻 HcNiR 基因編碼蛋白的親/疏水性分析

運(yùn)用ProtScale工具分析紅麻HcNiR基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物親水性和疏水性，從分析結(jié)果可見(jiàn)，親水性分析中，在多肽鏈第249位的谷氨酸處產(chǎn)生最大峰值，對(duì)應(yīng)峰數(shù)值?3.200；疏水性分析中，在多肽鏈第444位的丙氨酸處產(chǎn)生最大峰值，對(duì)應(yīng)峰數(shù)值2.456。根據(jù)氨基酸分值越高疏水性越強(qiáng)和分值越低親水性越強(qiáng)的規(guī)律，親水性最強(qiáng)的氨基酸是該基因序列第249位的谷氨酸，疏水性最強(qiáng)的氨基酸是該基因序列第444位的丙氨酸。從整體上看，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，且均勻分布在肽鏈中；推測(cè)HcNiR基因編碼的蛋白質(zhì)是親水性蛋白（圖3）。

圖3 HcNiR蛋白質(zhì)親水和疏水性分析Fig.3 Hydrophilicity and hydrophobicity of HcNiR protein

2.3 HcNiR 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

以神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法為基礎(chǔ)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)，HcNiR基因編碼蛋白質(zhì)的可能磷酸化位點(diǎn)如圖4-A所示；結(jié)果可知，HcNiR蛋白存在12個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（分別是27、73、105、112、132、166、239、265、312、370、422和 424）、12個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（分別是2、18、22、41、69、150，208、240、354、362、372和380）以及2個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（分別是136和266），相對(duì)應(yīng)的磷酸化勢(shì)見(jiàn)圖4-B，表明HcNiR蛋白可能被這3種氨基酸激酶磷酸化且激活，最終調(diào)控基因表達(dá)。

圖4 HcNiR蛋白潛在磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Predicted phosphorylation sites in HcNiR protein

2.4 紅麻HcNiR基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

紅麻HcNiR基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物一級(jí)結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，由結(jié)果可知，該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)37.930，低過(guò)閾值40。HcNiR蛋白是穩(wěn)定酸性親水蛋白質(zhì)。利用ProtComp預(yù)測(cè)HcNiR蛋白的亞細(xì)胞定位，該蛋白定位于葉綠體上。

表2 HcNiR基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析Table 2 Primary structure of HcNiR encoded protein

2.5 紅麻HcNiR基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)及高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用SOPMA軟件分析紅麻HcNiR基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)，從分析結(jié)果可知（圖5），HcNiR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、不規(guī)則卷曲、β折疊及β轉(zhuǎn)角組成。其中，α螺旋占35.99%，不規(guī)則卷曲占41.81%，β折疊占16.81%，β轉(zhuǎn)角占5.39%。利用跨膜預(yù)測(cè)服務(wù)運(yùn)用Phyre2數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)分析HcNiR基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物并預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Rasmol軟件分析紅麻HcNiR基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)，并以圖形化分析。從分析數(shù)據(jù)中可得到，HcNiR基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)中含α螺旋25個(gè)，氫鍵286個(gè)，β折疊36個(gè)，轉(zhuǎn)角43個(gè)（圖6）。

圖5 紅麻HcNiR基因編碼的蛋白產(chǎn)物二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure of HcNiR encoded protein

圖6 HcNiR基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structure of HcNiR encoded protein

2.6 HcNiR 編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽分析

利用跨膜預(yù)測(cè)服務(wù)器 TMHMM Server 2.0分析HcNiR基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)（圖7），分析結(jié)果表明其氨基酸在膜外區(qū)域幾率比較接近于1，而在膜內(nèi)區(qū)域幾率非常低，存在跨膜區(qū)域的幾率也比較低。所以推測(cè)HcNiR蛋白464個(gè)氨基酸殘基幾乎完全在膜外且無(wú)明顯跨膜區(qū)域。因而可知HcNiR蛋白并無(wú)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)，同樣也不是膜上受體。通常由5～30個(gè)氨基酸殘基組成的一個(gè)蛋白質(zhì)片段稱(chēng)為信號(hào)肽。HcNiR蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果可知（圖8），其氨基酸序列中并不含有信號(hào)肽。

圖7 HcNiR跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Predicted transmembrane structure of HcNiR

圖8 HcNiR信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.8 Predicted signal peptide of HcNiR

2.7 紅麻 HcNiR 的同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

BlastP程序?qū)cNiR 464個(gè)氨基酸與其他物種中NiR氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，由結(jié)果（圖9）可知，紅麻HcNiR與木槿（XP_039006864.1）、雷蒙德氏棉（XP_012463711.1）、陸地棉（ADJ68001.1）和可可樹(shù)（XP_007042430.2）的相似度分別為97.37%、93.65%、93.00%和92.12%。對(duì)紅麻HcNiR蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，其存在由17個(gè)氨基酸組成的鐵-硫/鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)“TGCPNSCGQVQVADIGF” 。使用MEGA7.0 對(duì)來(lái)自12種植物的HcNiR氨基酸序列繪制NJ（Neighbor-joining 法）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖10），結(jié)果表明，紅麻HcNiR與木槿HsNiR （Hibiscus syriacus）聚在同一分枝，親緣關(guān)系較近；雷蒙德氏棉GrNiR（XP_012463711.1）、陸地棉 GhNiR （ADJ68001.1）與HcNiR距離也相對(duì)較近。紅麻HcNiR蛋白與可可樹(shù)TcNiR（XP_007042430.2）蛋白聚成一支。

圖9 HcNiR的氨基酸序列對(duì)比Fig.9 Amino acid sequences of HcNiR

圖10 HcNiR基因同源進(jìn)化樹(shù)比對(duì)Fig.10 Homologous evolutionary trees of HcNiR

2.8 HcNiR 基因在紅麻不同組織中的表達(dá)分析

以紅麻葉、根cDNA 為模板，以HcNiR-qPCR-F和HcNiR-qPCR-R 為引物，beta-actin 為內(nèi)參引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，檢測(cè)不同組織中HcNiR基因的相對(duì)表達(dá)量。Real time PCR 結(jié)果表明其在紅麻不同器官中（葉、根）中均有表達(dá)，在葉中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于根（P＜0.05）（圖11）。

圖11 HcNiR在不同組織中的表達(dá)情況Fig.11 Expressions of HcNiR in various tissues

3 討論

植物體中氮同化需要在不同氮代謝酶的參與下進(jìn)行，由NO3?還原成NH4+這一代謝過(guò)程需要由硝酸還原酶和亞硝酸還原酶聯(lián)合完成；NR和NiR都與光合作用有著極為密切的聯(lián)系，其中NR是光誘導(dǎo)酶，并且NADH 提供還原力是保證硝酸還原反應(yīng)順利完成的必要條件[18]，而NADH正是由光反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH轉(zhuǎn)換得來(lái)；NiR需要光反應(yīng)中產(chǎn)生的鐵氧還蛋白（Fd）才能夠完成還原反應(yīng)[19]，并將 NO2?還原成NH4+。本研究中克隆到紅麻NiR基因，其目的條帶長(zhǎng)度為1395 bp，共編碼464個(gè)氨基酸，同時(shí)包含保守的亞硝酸和亞硫酸還原酶4Fe-4S結(jié)構(gòu)域及亞硝酸/亞硫酸還原酶鐵氧蛋白部分結(jié)構(gòu)域。小麥TaNiR基因也含有4個(gè)保守的參與鐵硫蛋白簇（4Fe-4S）結(jié)構(gòu)域及鐵氧還蛋白結(jié)合位點(diǎn)[20]。NiR基因在擬南芥、水稻、菠菜、煙草等植物中克隆得到[21]的氨基酸序列中也都含有鐵氧還蛋白亞硝酸鹽還原酶結(jié)構(gòu)域。

提取紅麻總RNA進(jìn)行HcNiR基因組織特異表達(dá)定量分析時(shí)，選擇45 d的葉片和根組織，此時(shí)麻苗正處在旺長(zhǎng)期，各組織基因表達(dá)量均衡且較高。鐵氧化還原蛋白（Fd）依賴(lài)的亞硝酸還原酶不僅存在于葉綠體中，根等非光合組織中也有發(fā)現(xiàn)[22]。本試驗(yàn)中對(duì)紅麻HcNiR基因亞細(xì)胞定位的結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因主要存在于葉綠體中；從組織表達(dá)分析得到，HcNiR基因在葉中表達(dá)量較高，明顯高于根。張芬等[23]研究了茶樹(shù)亞硝酸還原酶基因及其表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)該基因在成熟葉片中表達(dá)量高于一芽二葉和根；孫菲菲等[24]研究發(fā)現(xiàn)白菜亞硝酸還原酶基因葉片中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根表達(dá)量，證明葉與根中的確存在NiR基因的表達(dá)，且在葉中的表達(dá)量高于根，本研究結(jié)果與二者的研究結(jié)果相符。

植物中亞硝酸還原酶基因表達(dá)規(guī)律與各類(lèi)內(nèi)在、外在因素有關(guān)。張芬等[23]研究了不同供氮水平茶樹(shù)葉片中亞硝酸還原酶基因NiR表達(dá)特性，石曉艷等[25]研究了甜菜亞硝酸還原酶基因NiR在不同NO3--N 和 NH4+-N濃度對(duì)甜菜葉片NiR基因表達(dá)的影響，孫菲菲等[24]研究了不同NO3–-N 和NH4+-N濃度對(duì)白菜根和葉片BpNiR基因表達(dá)的影響。陳何等[26]研究莧菜亞硝酸還原酶基因NiR對(duì)不同硝酸銨含量配比與紅藍(lán)復(fù)合光配比的共同調(diào)控氮代謝。本研究結(jié)果有助于深入研究HcNiR基因在紅麻硝態(tài)氮同化過(guò)程中的關(guān)鍵作用，提高氮的轉(zhuǎn)化效率，能夠?yàn)榉N質(zhì)資源鑒定、培育氮紅麻高蛋白品種提供分子生物學(xué)理論依據(jù)；但還需通過(guò)亞細(xì)胞定位、誘導(dǎo)蛋白及紅麻遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)進(jìn)一步對(duì)基因結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，HcNiR基因編碼蛋白含有2個(gè)保守的亞硝酸和亞硫酸還原酶4Fe-4S結(jié)構(gòu)域及2個(gè)保守亞硝酸/亞硫酸還原酶鐵氧蛋白部分結(jié)構(gòu)域，與其他植物NiR在生物學(xué)功能上具有一致性；HcNiR基因具有組織表達(dá)特異性，在紅麻葉片中高效表達(dá)，推測(cè)其主要在初級(jí)氮的同化過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。